●任倩俐 蘇 凱 姚 麗 李金邦 張 敬 張麗霞※※

（1.太原動(dòng)物園 山西 太原 030009；2.北京動(dòng)物園管理處 北京 100044；3.北京動(dòng)物園圈養(yǎng)野生動(dòng)物技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京 100044）

褐馬雞（Crossoptilon mantchuricum）是我國(guó)特有的瀕危珍稀雉類，全球現(xiàn)存約17 900只，被IUCN紅色名錄列為易危物種。目前僅分布于山西、北京、河北和陜西，其中山西是其主要分布省份[1]。為了保護(hù)這一珍稀鳥類，多年來學(xué)者們?cè)谛螒B(tài)學(xué)、繁殖生物學(xué)、生態(tài)學(xué)、保護(hù)生物學(xué)等領(lǐng)域?qū)竹R雞進(jìn)行了廣泛的研究，但關(guān)于褐馬雞繁殖及生長(zhǎng)發(fā)育的功能基因以及相關(guān)生物學(xué)現(xiàn)象的分子機(jī)制研究較少，轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究處于空白狀態(tài)，若想揭示、利用褐馬雞生長(zhǎng)發(fā)育、應(yīng)激生理、抗病免疫等作用機(jī)制，則需要了解其遺傳信息。由于褐馬雞為國(guó)家一級(jí)保護(hù)動(dòng)物，采集組織器官對(duì)其進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析不現(xiàn)實(shí)，血液樣本的采集操作簡(jiǎn)單，對(duì)動(dòng)物的傷害較小，適用于褐馬雞繁育機(jī)制的研究。截至目前，血液轉(zhuǎn)錄組分析已經(jīng)在多個(gè)哺乳動(dòng)物中完成，如北極熊、棕熊[2]、人[3-4]、豬[5]、牛[6]和大熊貓[7]等。同時(shí)相關(guān)研究表明，禽類就巢期間，血液中PRL（催乳素）、FSH（促卵泡素）等激素的含量會(huì)增多[8]，因此可以從血液轉(zhuǎn)錄本在褐馬雞繁殖期前后的變化發(fā)現(xiàn)其基因調(diào)控機(jī)制。本試驗(yàn)以褐馬雞為研究對(duì)象，通過探究其在繁殖期和非繁殖期的基因表達(dá)模式和分子調(diào)控機(jī)制的變化，為褐馬雞季節(jié)性行為策略、瀕危機(jī)制、生態(tài)學(xué)研究及保護(hù)遺傳學(xué)的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集及RNA測(cè)序

在太原動(dòng)物園褐馬雞繁育基地選取健康的3齡成鳥2對(duì)，體重約5 kg，編號(hào)為7L195♀，7L181♂，7L346♀，7L297♂（以下簡(jiǎn)稱 HC1、HX1、HC2、HX2）。在5月和10月分別采用翼下采血法提取褐馬雞的血液樣本，每份樣本采集2.5 mL全血至 EDTA 采血管中，加入7.5 mL TriZol裂解液混勻，立刻轉(zhuǎn)入耐-192℃低溫的螺紋口凍存管中，干冰用于RNA樣品制備、檢驗(yàn)和測(cè)序（表1）。

表1 樣品名編號(hào)

1.2 差異表達(dá)基因的篩選

1.3 差異表達(dá)基因的GO分類、KEGG富集分析

在BlastGO軟件中將差異表達(dá)基因的序列與GO（Gene Ontology）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行注釋和富集分析；通過BlastX軟件將差異表達(dá)基因與KEGG數(shù)據(jù)庫比對(duì)，使用在線注釋工具KAAS對(duì)核酸和蛋白質(zhì)序列進(jìn)行功能注釋并分析基因代謝途徑[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA測(cè)序質(zhì)量控制

采用瓊脂糖凝膠電泳法對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，樣本總RNA的純度較高，符合轉(zhuǎn)錄測(cè)序cDNA 文庫構(gòu)建對(duì)RNA質(zhì)量的要求。統(tǒng)計(jì)了下機(jī)原始數(shù)據(jù)每個(gè)樣本的Reads 數(shù)以及總數(shù)據(jù)量（表2），各項(xiàng)數(shù)據(jù)符合要求，可用于生物信息學(xué)分析。組裝后褐馬雞全基因組測(cè)序共獲得 16.1 Gbp 數(shù)據(jù)，39 907 條 Unigenes，總長(zhǎng)度為 39 002 861 bp，平均長(zhǎng)度為 324 bp。

表2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序產(chǎn)量統(tǒng)計(jì)

2.2 差異表達(dá)基因的篩選

將8個(gè)樣本中的重復(fù)樣本混合后組合成3個(gè)對(duì)照組，即HC10 vs HC05（非繁殖期和繁殖期雌性）、HX10 vs HX05（非繁殖期和繁殖期雄性）、HC05 vs HX05（繁殖期雌性和雄性）。結(jié)果顯示，非繁殖期與繁殖期的雌雞進(jìn)行比較，有4007條差異基因表達(dá)，上調(diào)基因數(shù)目為2567，下調(diào)基因數(shù)目為1440；非繁殖期與繁殖期的雄雞進(jìn)行比較，差異基因數(shù)目為3529，上調(diào)基因數(shù)目為2313，下調(diào)基因數(shù)目為1216；繁殖期的雌雞和雄雞相比較，有336條差異基因表達(dá)，上調(diào)的基因數(shù)目為150，下調(diào)的基因數(shù)目為186（圖1）。

圖1 差異表達(dá)基因火山圖

經(jīng)比較，HC10 vs HC05對(duì)照組中，非繁殖期雌性褐馬雞體內(nèi)Mucl2、HBE1、Col1a1、Klk1b22、Col1a2基因表達(dá)量顯著高于繁殖期的雌性褐馬雞；HX10 vs HX05對(duì)照組中，非繁殖期雄性褐馬 雞 體 內(nèi)MT-CO3、MT-ND4、EEF1A1、MTCO1基因表達(dá)量顯著高于繁殖期的雄性褐馬雞；HC05 vs HX05對(duì)照組中，繁殖期雌性褐馬雞體內(nèi)HINT1、TXNL1、Txnl1、AVD、vcp基因表達(dá)量顯著高于雄性褐馬雞（表3）。這些基因是與褐馬雞生長(zhǎng)發(fā)育、激素調(diào)控、性別決定、免疫、代謝、酶活性、線粒體等生命活動(dòng)息息相關(guān)的基因，這些基因的表達(dá)與調(diào)控從分子水平上揭示了褐馬雞在性別之間、季節(jié)變化方面的不同行為。

表3 比較組部分差異表達(dá)基因

2.3 差異基因的GO富集分析

對(duì)各個(gè)對(duì)照組的差異表達(dá)基因進(jìn)行表達(dá)模式聚類分析，以了解其在生物過程中的功能分類，包括生物學(xué)過程、細(xì)胞組分和分子功能，即GO富集分析。結(jié)果表明，有174個(gè)與繁殖功能相關(guān)的基因比對(duì)到GO數(shù)據(jù)庫中，其中，非繁殖期與繁殖期的雌雞進(jìn)行比較，4007個(gè)差異基因中有2762個(gè)得到注釋，15個(gè)基因參與繁殖調(diào)節(jié)相關(guān)的信號(hào)通路；非繁殖期和繁殖期的雄雞進(jìn)行比較，3529個(gè)差異基因中有2526個(gè)得到注釋，143個(gè)基因參與繁殖調(diào)節(jié)相關(guān)的信號(hào)通路；繁殖期的雌雞和雄雞相比較，336個(gè)差異基因中有222個(gè)得到注釋，16個(gè)基因參與了繁殖調(diào)節(jié)相關(guān)的信號(hào)通路。將P-value值設(shè)置為小于0.05，所有的差異基因顯著富集到了10 147條GO terms中，占所有 terms的21.66%。

在生物學(xué)過程中，有305個(gè)基因注釋到翻譯（Translation）類別中，數(shù)量最多，其次為DNA模 板 轉(zhuǎn) 錄（Transcription，DNA-templated） 和DNA 模板的轉(zhuǎn)錄調(diào)控（Regulation of transcription，DNA-templated）；在細(xì)胞組分中，有525個(gè)基因注釋到核（Nucleus），數(shù)量最多，其次為細(xì)胞質(zhì)（Cytoplasm）和細(xì)胞外體（Extracellular exosome）；在分子功能中，有527個(gè)基因注釋到蛋白質(zhì)結(jié)合（Protein binding），其次為三磷酸腺苷結(jié)合（ATP binding）和核糖體的結(jié)構(gòu)組成（Structural constituent of ribosome）。

HC10 vs HC05比較組中，在非繁殖期的高表達(dá)基因發(fā)現(xiàn)了TGFB1、ACVR1B和BCL2L1 3個(gè)基因涉及褐馬雞的繁殖調(diào)控機(jī)制。TGFB1（轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β-1前蛋白前體）編碼的蛋白質(zhì)參與到促卵泡素正調(diào)節(jié)、黃體生成素正調(diào)節(jié)、孕酮分泌、凋亡過程調(diào)控等過程；ACVR1B基因（激活素受體1B型亞型X1）編碼的蛋白與抑制素（INH）結(jié)合有關(guān)，抑制素在生物學(xué)功能上通過對(duì)促卵泡素（FSH）的負(fù)反饋調(diào)節(jié)，進(jìn)而對(duì)雌性褐馬雞在非繁殖期的各類行為進(jìn)行調(diào)控；BCL2L1基因（Bcl-2家族蛋白復(fù)合物）是B 細(xì)胞白血病淋巴瘤2p家族基因，是決定生殖細(xì)胞命運(yùn)的重要基因，在雌性褐馬雞的非繁殖期參與到了細(xì)胞凋亡和生殖細(xì)胞、卵泡發(fā)育的調(diào)控。

2.4 差異基因的KEGG富集分析及代謝通路

KEGG通路分析結(jié)果顯示，HC10 vs HC05對(duì)照組中有2509個(gè)差異基因富集到311個(gè)信號(hào)通路上；HX10 vs HX05對(duì)照組中有2300個(gè)差異基因富集到309個(gè)信號(hào)通路中；HC05 vs HX05對(duì)照組中有210個(gè)差異基因富集到130個(gè)信號(hào)通路中。88個(gè)差異基因在KEGG代謝通路中均參與了與繁殖相關(guān)的信號(hào)通路中，有22個(gè)基因富集到卵母細(xì)胞減數(shù)分裂（Ocyte meiosis），29個(gè)基因富集到 GnRH 信號(hào)通路（GnRH signaling pathway，促性腺激素釋放激素）、19個(gè)基因富集到孕酮介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟（Progesterone-mediated ocyte maturation）、13個(gè)基因富集到催產(chǎn)素（Oxytocin signaling pathway）、5個(gè)基因富集到雌激素代謝通路（Estrogen signaling pathway）。

3 討論與結(jié)論

動(dòng)物隨季節(jié)變化產(chǎn)生的規(guī)律性活動(dòng)，不僅受環(huán)境因素的影響，也與自身內(nèi)源性節(jié)律調(diào)控有關(guān)，而參與繁殖調(diào)控的相關(guān)基因往往在年度周期中有著節(jié)律性的表達(dá)變化，并且在調(diào)節(jié)季節(jié)性活動(dòng)變化中發(fā)揮重要功能。褐馬雞作為我國(guó)特有的瀕危珍禽，其種群數(shù)量少，分布范圍小，樣本采集困難，隨著保護(hù)生物學(xué)研究的不斷深入，筆者發(fā)現(xiàn)除了保護(hù)棲息地之外，更重要的是保護(hù)其遺傳多樣性。

隨著RNA-Seq 技術(shù)的發(fā)展應(yīng)用，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序以檢測(cè)范圍廣、測(cè)序通量高、檢測(cè)成本低、分辨率好和靈敏度高等特點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于非模式生物以及低豐度稀有轉(zhuǎn)錄本相關(guān)基因挖掘與研究。本研究通過高通測(cè)序技術(shù)，獲取了不同繁育階段、不同性別褐馬雞血液轉(zhuǎn)錄組信息，構(gòu)建褐馬雞血液轉(zhuǎn)錄組文庫，共得到39 907條Unigenes，通過GO功能富集和KEGG分析，發(fā)現(xiàn)有174個(gè)與繁殖功能相關(guān)的基因比對(duì)到GO數(shù)據(jù)庫中，有88個(gè)基因在KEGG代謝通路中參與到了與繁殖相關(guān)的代謝通路。在差異基因的GO分析中，TGFB1、ACVR1B和BCL2L1 3個(gè)基因在非繁殖期雌性褐馬雞體內(nèi)高表達(dá)，它們參與了促卵泡素、抑制素、孕酮的激素調(diào)控以及生殖細(xì)胞、卵泡的調(diào)控，從分子層面揭示了基因表達(dá)量的變化影響激素分泌進(jìn)而影響褐馬雞季節(jié)性行為策略；雌性褐馬雞非繁殖期和繁殖期對(duì)照組中，在Biological process中找到了與繁殖相關(guān)的功能組，此結(jié)果與陳杰[10]鵝的產(chǎn)蛋性能的影響基因研究結(jié)果相似，說明繁殖性能與GO注解中的這幾個(gè)進(jìn)程相關(guān)。本研究結(jié)果既豐富褐馬雞的轉(zhuǎn)錄組信息，也為今后開展褐馬雞遺傳學(xué)研究、分子調(diào)控機(jī)制以及瀕危動(dòng)物的保護(hù)工作奠定了基礎(chǔ)。