梁婷，梁沁，周翠娟，盧靜蘭

(廣西醫(yī)科大學第八附屬醫(yī)院 貴港市人民醫(yī)院，貴港 537100)

胚胎質(zhì)量和內(nèi)膜容受性是影響輔助生殖技術(shù)(ART)助孕成功的兩個關(guān)鍵因素。近年來，隨著促排卵方案的優(yōu)化、受精方式的改進和胚胎培養(yǎng)及篩選技術(shù)的提高，胚胎質(zhì)量已得到較為充分的保障。因此，改善子宮內(nèi)膜容受性成為提高體外受精-胚胎移植(IVF-ET)臨床妊娠率、降低胚胎反復種植失敗的關(guān)鍵[1]。

輸卵管積液是育齡期婦女常見的疾病，是慢性盆腔炎性疾病后遺癥的主要表現(xiàn)。盡管IVF-ET最初就是主要針對輸卵管因素性不孕癥進行治療，但令人費解的是，與其他不孕原因患者相比，重度輸卵管積液不孕患者往往臨床助孕結(jié)局較差[2]。一些回顧性研究表明，輸卵管積液患者的胚胎著床率和妊娠率較低[3-4]，輸卵管積液與IVF的不良結(jié)局之間存在明確的聯(lián)系[4-5]。輸卵管積液患者的自然流產(chǎn)率也有所增加[6-7]。另一方面，在IVF之前接受輸卵管切除術(shù)的輸卵管積液患者，臨床妊娠率和活產(chǎn)率增加[8]。其他回顧性研究也報告了輸卵管積液患者行輸卵管切除術(shù)后的預后得到改善[4-5]。

輸卵管積液對生育結(jié)局的損害不僅與輸卵管積液的胚胎毒性有關(guān)，而且與其所致內(nèi)膜炎性環(huán)境有密切聯(lián)系。研究認為輸卵管積液主要包含炎癥性因子、免疫細胞和壞死組織，積液倒流引起宮腔積液，影響子宮內(nèi)膜的形態(tài)[9]。炎癥環(huán)境使內(nèi)膜免疫微環(huán)境受到破壞，有可能會引起慢性子宮內(nèi)膜炎(chronic endometritis，CE)，并損害子宮內(nèi)膜容受性[10]。

對于輸卵管積液的患者，準確評估其子宮內(nèi)膜容受性是改善助孕結(jié)局的關(guān)鍵。然而，目前臨床上評估子宮內(nèi)膜容受性的方法較簡單，僅從激素水平和超聲影像學評估某一時間點的內(nèi)膜狀態(tài)，其準確性和可重復性均存疑，缺乏動態(tài)的、綜合的內(nèi)膜容受性監(jiān)測手段。本文將綜合超聲學指標、子宮內(nèi)膜容受性分子標志物，如同源框基因A10(homeobox gene A10，HOXA10)、整合素αvβ3等，連續(xù)、動態(tài)地評估輸卵管積液患者的子宮內(nèi)膜容受性，以期為輸卵管積液導致不孕的患者提供治療依據(jù)。

資料和方法

一、研究對象

以2020年7月至2022年6月在貴港市人民醫(yī)院生殖中心助孕的不孕癥患者作為招募對象。

輸卵管積液組(積液組)納入標準：(1)年齡20～40歲，卵巢儲備功能正常；(2)因輸卵管因素、男方因素等進行IVF/ICSI-ET或凍融胚胎移植(FET)；(3)子宮輸卵管造影(HSG)提示至少一側(cè)存在輸卵管積液；(4)近3個月未使用抗生素；(5)近3個月未使用口服避孕藥和雌孕激素類藥物。無輸卵管積液組(對照組)納入標準除(3)外，其余與積液組相同，(3)改為HSG排除雙側(cè)輸卵管積液。

排除標準：(1)存在嚴重心肺功能不全等全身性疾病，不能耐受宮腔鏡手術(shù)或內(nèi)膜活檢和不能耐受妊娠；(2)卵巢功能不全或內(nèi)分泌紊亂；(3)雙方或一方染色體異常。兩組排除標準相同。

經(jīng)過招募，最終納入符合標準的患者197例。其中，積液組(至少一側(cè)輸卵管積液)91例，對照組(無輸卵管積液)106例。所有入組患者均簽署知情同意書。本課題經(jīng)貴港市人民醫(yī)院倫理委員會的審批。

二、研究方法

1.記錄患者基本資料：年齡、不孕年限、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、宮腔操作史、基礎激素水平(E2、FSH、LH)、抗苗勒管激素(AMH)水平等。

2.超聲監(jiān)測：入組患者胚胎移植前1～2個自然月經(jīng)周期的早卵泡期、晚卵泡期、排卵期以及黃體期的子宮內(nèi)膜厚度、子宮動脈搏動指數(shù)(PI)和阻力指數(shù)(RI)。

3.內(nèi)膜活檢：積液組和對照組分別有27人和31人自愿進行內(nèi)膜活檢。內(nèi)膜活檢于排卵后第7天(LH+7)進行，檢查無禁忌證后，取截石位，消毒鋪巾后，使用一次性S型宮腔組織吸引管(立可靈TY-C3.1/30-1S型，上海家寶)進行子宮內(nèi)膜組織取樣。活檢組織置于中性福爾馬林中固定。

4.免疫組化染色：對固定24 h的組織進行脫水、透明、浸蠟、包埋、切片。用SP三步法檢測子宮內(nèi)膜容受性指標整合素αvβ3(16-0519-81，Invitrogen，美國；稀釋1∶100)、HOXA10(sc-271428，Santa Cruz，美國；稀釋1∶100)以及CE分子標志物CD138(ab128936，Abcam，美國；稀釋1∶5 000)的表達。將切片60℃烤片2 h后，進行脫蠟和水化，放入檸檬酸鈉緩沖液(C1032，北京索萊寶)中進行高壓抗原修復10 min，自然冷卻后用雙氧水滅活內(nèi)源性過氧化物15 min，山羊血清封閉20 min，隨后加入一抗，置于4℃過夜。復溫后加入相應二抗(PV-9001，北京中杉金橋)孵育30 min，DAB(ZLI-9018，北京中杉金橋)顯色1 min，蘇木素染核30 s，隨后進行返藍，脫水，風干，透明，封片后鏡下觀察。

CE的診斷以每高倍鏡視野下出現(xiàn)大于5個CD138陽性的漿細胞作為標準。整合素αvβ3及HOXA10的相對表達量采用H-score方法對免疫組化結(jié)果進行評分：隨機選擇5個視野，分別對每個視野的陽性信號強度和陽性細胞數(shù)比例進行評分。陽性信號強度分為強、中、弱三類，分別記3、2、1分；陽性細胞數(shù)比例為視野中陽性細胞的數(shù)量占所有細胞數(shù)的比值，以百分數(shù)表示。單個視野H-score評分為信號強度的得分×陽性細胞百分數(shù)，計算5個視野的平均值為該切片的最終評分。

5.CE的治療：對于確診為CE的患者，每日口服多西環(huán)素100 mg，治療14 d。治療完成后的下一個周期再行內(nèi)膜活檢復查(方法同前)，評價治療效果以及子宮內(nèi)膜容受性變化。

三、統(tǒng)計學分析

結(jié) 果

一、入組患者基線資料

本研究共納入197例病例，其中積液組(至少一側(cè)輸卵管積液)91例，對照組(無輸卵管積液)106例。兩組患者在年齡、不孕年限、BMI、宮腔操作史、基礎性激素水平、AMH水平等方面均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)(表1)。

表1 兩組患者基線資料比較[(-±s)，n(%)]

二、兩組患者不同時期內(nèi)膜厚度/類型及內(nèi)膜血流參數(shù)

兩組患者間子宮內(nèi)膜厚度在早卵泡期和晚卵泡期無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，在排卵期和黃體期，積液組子宮內(nèi)膜厚度均顯著薄于對照組(P<0.001)(表2，圖1)。兩組患者的子宮內(nèi)膜類型構(gòu)成比在早卵泡期、晚卵泡期和黃體期均無統(tǒng)計學差異(P=0.468)；在排卵期，對照組有9.43%(10/106)的患者內(nèi)膜未轉(zhuǎn)化(仍為A型)，而積液組仍有21.98%(20/91)患者的內(nèi)膜未轉(zhuǎn)化，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.017)(表2，圖2)。兩組間內(nèi)膜血流參數(shù)比較，積液組的RI在排卵期和黃體期顯著高于對照組(P<0.05)，而PI在各期差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(表2)。

表2 兩組患者各時期內(nèi)膜厚度、類型及內(nèi)膜血流參數(shù)比較[(-±s)，n(%)]

與積液組比較，*P<0.001。圖1 兩組患者月經(jīng)周期子宮內(nèi)膜發(fā)育情況

排卵期兩組患者A型內(nèi)膜率比較，*P<0.05。圖2 兩組患者月經(jīng)周期子宮內(nèi)膜類型比較

三、兩組患者HOXA10及整合素αvβ3評分

積液組和對照組分別有27名和31名患者進行內(nèi)膜活檢，活檢時間為LH+7。通過免疫組化方法觀察兩組患者內(nèi)膜組織中HOXA10及整合素αvβ3在細胞質(zhì)中的表達情況(圖3和圖4)，并將結(jié)果進行H-score量化，發(fā)現(xiàn)積液組兩個指標的H-score評分均顯著低于對照組(P<0.001)(表3)。

A：積液組；B：對照組；右側(cè)系相應左圖(×100)方框區(qū)放大圖像(×400)。圖3 兩組患者子宮內(nèi)膜組織中的HOXA10表達(免疫組化染色)

A：積液組；B：對照組；右側(cè)系相應左圖(×100)方框區(qū)放大圖像(×400)。圖4 兩組患者子宮內(nèi)膜組織中的整合素αvβ3表達(免疫組化染色)

表3 兩組患者子宮內(nèi)膜組織HOXA10和整合素αvβ3免疫組化結(jié)果量化(-±s)

四、兩組患者CE發(fā)病率

在進行內(nèi)膜活檢的患者中，積液組一共有13名患者存在CE，CE發(fā)生率為48.14%(13/27)。對照組一共有6名患者存在CE，發(fā)生率為19.35%(6/31)；積液組CE發(fā)生率顯著升高(P=0.02)(表4)。

表4 內(nèi)膜活檢患者中CE發(fā)生率(%)

五、CE治療前后HOXA10及整合素αvβ3評分比較

所有19例CE患者均進行了抗生素治療，治療后均再次進行了內(nèi)膜活檢。再次活檢證實積液組仍有2名患者存在CE，對照組有1名患者存在CE，整體治愈率為84.21%(16/19)。與治療前相比，所有患者治療后的HOXA10表達量有升高趨勢(圖5)，但沒有達到統(tǒng)計學差異(P>0.05)(表5)；整合素αvβ3的表達量在治療后明顯升高(圖6)，且差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.001)(表5)。

A：治療前；B：治療后；右側(cè)系相應左圖(×100)方框區(qū)放大圖像(×400)。圖5 CE患者治療前后子宮內(nèi)膜組織中的HOXA10表達(免疫組化染色)

A：治療前；B：治療后；右側(cè)系相應左圖(×100)方框區(qū)放大圖像(×400)。圖6 CE患者治療前后子宮內(nèi)膜組織中的整合素αvβ3表達(免疫組化染色)

表5 CE治療前后內(nèi)膜組織HOXA10和整合素αvβ3免疫組化結(jié)果量化(-±s)

討 論

本研究中，我們通過檢測月經(jīng)周期各時期子宮內(nèi)膜類型、厚度、內(nèi)膜血流參數(shù)PI和RI，以及容受期子宮內(nèi)膜容受性分子標志HOXA10和整合素αvβ3，探究了輸卵管積液對子宮內(nèi)膜容受性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與無輸卵管積液的患者相比，存在輸卵管積液的患者子宮內(nèi)膜受到一定程度的損害，表現(xiàn)為子宮內(nèi)膜生長緩慢，RI增大，排卵期內(nèi)膜轉(zhuǎn)換延緩，CE發(fā)生率升高，以及子宮內(nèi)膜容受性分子的表達下降。

目前，超聲檢查仍是臨床上最常用于評估子宮內(nèi)膜容受性的方法[11]。通過分子手段如基因芯片、免疫組化等方法評估子宮內(nèi)膜容受性分子的表達多用于實驗研究[12]。子宮內(nèi)膜容受性微陣列(Endometrial receptivity array，ERA)是較為全面地評價容受性的方法，但由于該方法效果未明確且價格昂貴，在國內(nèi)仍少有使用[13]。

超聲檢查一般以子宮內(nèi)膜類型、子宮內(nèi)膜厚度以及內(nèi)膜血流參數(shù)PI、RI等指標對子宮內(nèi)膜容受性進行評估。良好的子宮內(nèi)膜表現(xiàn)為排卵期發(fā)生內(nèi)膜轉(zhuǎn)化，內(nèi)膜厚度達到10 mm以上，PI、RI在正常范圍內(nèi)[14]。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)從排卵期開始，積液組的子宮內(nèi)膜厚度就低于對照組，一直持續(xù)到黃體期。積液組在排卵期仍有21.98%(20/91)的患者內(nèi)膜未轉(zhuǎn)化，顯著高于對照組的9.43%(10/106)。血流動力學上，我們觀察到積液組的RI在排卵期和黃體期高于對照組，但PI沒有明顯差異。吳洪波等[15]研究發(fā)現(xiàn)輸卵管積液會降低患者HCG注射日A型血流及三線型內(nèi)膜的比例，但對血流參數(shù)PI、RI及子宮內(nèi)膜厚度無明顯影響。產(chǎn)生這種差異的原因可能是我們與該研究的設計類型、納入/排除標準等存在差異。且本研究選取了月經(jīng)周期中具有代表性的4個不同時間點進行檢測，從而可以動態(tài)地了解內(nèi)膜容受性的變化。

HOXA10和整合素αvβ3是常用于評價子宮內(nèi)膜容受性的指標。HOXA10是同源框基因家族的一員，該基因敲除后會導致子宮內(nèi)膜蛻膜化障礙，引起不孕[16]。整合素αvβ3在子宮內(nèi)膜上皮細胞以及胚胎的滋養(yǎng)層細胞中均有表達，在母胎識別和黏附過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[17]。我們的研究發(fā)現(xiàn)，HOXA10和整合素αvβ3在輸卵管積液患者子宮內(nèi)膜的表達均較無輸卵管積液的對照組低，這一結(jié)果與李艷萍[18]的研究相似。此外，周云[19]研究發(fā)現(xiàn)，輸卵管積液患者在接受硬化治療后，子宮內(nèi)膜組織中的血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、整合素αvβ3、HOXA10等分子表達升高。這些結(jié)果表明，輸卵管積液最終可能會通過損害子宮內(nèi)膜容受性，導致不良妊娠結(jié)局，而對輸卵管積液加以糾正可能改善妊娠結(jié)局。

輸卵管積液對胚胎的毒性作用被認為是造成女性生育率下降的主要原因。但后來發(fā)現(xiàn)，在進行胚胎移植的患者中，存在輸卵管積液的患者妊娠率仍較不存在輸卵管積液的患者低，因此輸卵管積液對內(nèi)膜的損害作用也開始受到重視[20]。當輸卵管積液反流至宮腔時，積液中的炎癥因子、細胞因子、病原體可能會對子宮內(nèi)膜產(chǎn)生損害作用。有研究發(fā)現(xiàn)，存在輸卵管積液的患者CE檢出率升高，表明積液對內(nèi)膜造成了損害[10，21]。本研究中我們檢測了一部分患者子宮內(nèi)膜CD138的表達，發(fā)現(xiàn)積液組CE的檢出率是48.14%(13/27)，顯著高于對照組的19.35%(6/31)，這個結(jié)果與前述研究結(jié)果一致。此外，我們還發(fā)現(xiàn)，輸卵管積液伴有CE的患者，CE治愈后HOXA10的表達沒有顯著變化，但整合素αvβ3的表達顯著上調(diào)，提示CE的治療可能在一定程度上改善患者的子宮內(nèi)膜容受性。這也提示我們，CE的檢測和治療可能是輸卵管因素不孕患者診療的一個重要部分。

本研究的優(yōu)勢在于，我們連續(xù)觀察了輸卵管積液患者一個完整月經(jīng)周期的子宮內(nèi)膜超聲參數(shù)。月經(jīng)是一個周而復始的過程，既往的研究往往只關(guān)注種植窗口期子宮內(nèi)膜容受性的狀態(tài)，連續(xù)的評估則可以發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜在哪個時期就開始出現(xiàn)異常。本研究的不足在于樣本量小，仍需要更多的臨床數(shù)據(jù)加以支持；此外，本研究中沒有繼續(xù)隨訪患者后續(xù)的妊娠結(jié)局，無法將患者的超聲學參數(shù)和免疫組化結(jié)果與妊娠結(jié)局相聯(lián)系。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)輸卵管積液會增加子宮內(nèi)膜血流阻力，使內(nèi)膜生長和轉(zhuǎn)化延緩。并且，輸卵管積液降低子宮內(nèi)膜容受性分子標志物HOXA10和整合素αvβ3的表達，增加CE發(fā)生風險；而CE的治療可能在一定程度上改善子宮內(nèi)膜容受性。