劉倩，張琦，謝青貞

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，武漢 430060)

胚胎著床是人類和胎生動物生殖生理過程中的一個重要環(huán)節(jié)，絕大多數(shù)的妊娠丟失被認為發(fā)生于胚胎著床期間[1]。滋養(yǎng)層細胞在胚胎著床和整個妊娠過程中具有重要作用，其功能失調(diào)會導(dǎo)致胚胎著床失敗、自然流產(chǎn)、妊娠滋養(yǎng)層細胞疾病等妊娠相關(guān)性疾病的發(fā)生。然而滋養(yǎng)層細胞功能的調(diào)控機制至今仍未完全明確。

microRNAs(miRNAs)是一類非編碼的小RNA，在蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄后表達過程中發(fā)揮重要作用。其中，microRNA125a-3p(miR-125a-3p)在抑制細胞增殖分化、侵襲等活動方面具有重要作用，并在多種腫瘤細胞中異常表達[2]。在生殖方面，miR-125a-3p被指出參與了卵母細胞的成熟過程[3]。細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK1/2)等信號傳導(dǎo)通路的活化也受到miR-125a-3p的調(diào)控[4]。我們的前期研究首次發(fā)現(xiàn)滋養(yǎng)層細胞中存在Fyn的表達，后者可調(diào)控滋養(yǎng)層細胞的功能(未發(fā)表數(shù)據(jù))。miR-125a-3p被證實可通過與Fyn mRNA 3′端的非翻譯區(qū)相結(jié)合，直接抑制Fyn的表達和活性，其對細胞活動的影響至少部分依賴于Fyn的作用[5]。因此，本研究擬進一步檢測miR-125a-3p在不同滋養(yǎng)層細胞系中的表達特點，并從滋養(yǎng)層細胞行為角度探索miR-125a-3p的作用及相關(guān)機制，以進一步了解胚胎著床過程及滋養(yǎng)層細胞功能調(diào)控，為相關(guān)妊娠并發(fā)癥的診治提供新依據(jù)。

材料和方法

一、細胞系

人滋養(yǎng)層細胞系HTR-8/SVneo，絨癌細胞系JAR和JEG-3均購自ATCC(American Type Culture Collection)，培養(yǎng)在37℃、5%CO2條件下。

二、主要試劑和儀器

RPMI 1640、MEM、胎牛血清、胰酶-EDTA溶液(0.25%)、青霉素-鏈霉素混合液、Opti-MEMI均購自美國GIBCO公司，Trizol購自美國Ambion公司，HiScript Reverse Transcriptase(RNase H)、5×HiScript Buffer、50×ROX Reference Dye Ⅱ、SYBR Green Master Mix均購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司，miR-125a-3p inhibitor及陰性對照、miR-125a-3p引物、U6引物、GAPDH引物均來源于上海捷瑞生物工程有限公司，Lipofectamine 2000購自美國Thermo公司，CCK8細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒購自美國MCE公司(MedChemExpress)，Transwell小室和Matrigel基質(zhì)膠均購自美國Corning公司，細胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物，RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、蛋白A/G-瓊脂糖均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，抗GAPDH兔多克隆抗體購自杭州賢至生物有限公司，抗Fyn兔單克隆抗體、抗信號傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)兔單克隆抗體、抗ERK鼠單克隆抗體、抗p-ERK兔單克隆抗體均購自英國Abcam公司，抗p-STAT3兔單克隆抗體購自美國CST公司，HRP標(biāo)記羊抗小鼠二抗和HRP標(biāo)記羊抗兔二抗均購自武漢博士德生物工程有限公司，通用酪氨酸激酶測定試劑盒購自日本Takara公司。

ABI QuantStudio6實時熒光定量PCR儀購自美國Applied Biosystems公司，Odyssey紅外熒光掃描成像系統(tǒng)購自美國LI-COR公司，奧利巴斯光學(xué)顯微鏡IX51購自日本OLYMPUS公司，多功能酶標(biāo)儀Flexstation 3購自美國Molecular Devices公司，CytoFLEX流式細胞儀購自美國Beckman Coulter公司。

三、實驗方法

1.實時熒光定量PCR：Trizol法提取細胞中的總RNA，分光光度計檢測純度。按照HiScript Reverse Transcriptase試劑說明合成cDNA，采用20 μl的cDNA、引物、SYBR Green 和ROX reference dye Ⅱ混合物構(gòu)成PCR反應(yīng)體系，2-ΔΔCT計算目的基因的相對表達量。所用引物序列如下：miR-125a-3p正向引物：5′-TGCGCACAGGTGAGGTTCTTGG-3′，反向引物：5′-CCAGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′；莖環(huán)引物：5′-GTCGTATCCAGTG-CAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC-GGCTCCCA-3′；U6正向引物：5′-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3′，反向引物：5′-AAATATGGAACGCTTCACGA-3′；Fyn正向引物：5′-GCACGGACAGAAGATGAC-3′，F(xiàn)yn 反向引物：5′-CCAATCACGGATAGAAAGT-3′；GAPDH正向引物：5′-TCAAGAAGGTGGTGAAGCAGG-3′，GAPDH反向引物：5′-TCAAAGGTGGAGGAGTGGGT-3′。

2.細胞轉(zhuǎn)染及分組：細胞培養(yǎng)于37℃恒溫培養(yǎng)箱中，胰蛋白酶消化傳代。選取指數(shù)生長期的HTR-8/SVneo、JEG-3細胞，待細胞融合度約為70%時，利用Lipofectamine 2000進行分組轉(zhuǎn)染：(1)空白對照組(CK組)，未做任何處理；(2)陰性對照組(NC組)，轉(zhuǎn)染NC-inhibitor；(3)實驗組(inhibitor組)，轉(zhuǎn)染miR-125a-3p inhibitor。轉(zhuǎn)染6 h后換液，轉(zhuǎn)染24 h后收集各組細胞以備檢測。

3.CCK-8法檢測細胞增殖情況：取指數(shù)生長期的細胞以5×103/孔接種于96孔板，轉(zhuǎn)染24 h后，每孔加入10 μl CCK-8，37℃培養(yǎng)4 h，酶標(biāo)儀測定450 nm波長下各孔吸光值(OD450)。

4.Transwell法檢測細胞侵襲能力：分別收集各組細胞，無血清培養(yǎng)基稀釋細胞濃度至3×105/ml。無血清培養(yǎng)基稀釋Matrigel膠至終濃度1 mg/ml。24孔板中預(yù)先加入4℃預(yù)冷800 μl 10% FBS的培養(yǎng)基(含雙抗)，并放入Transwell小室，在Transwell小室上室底部中央垂直加入100 μl Matrigel膠，37℃溫育4～5 h使其干成膠狀，后在Transwell上室分別加入200 μl各組細胞懸液，37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h。70%乙醇固定細胞，0.5%結(jié)晶紫染色。倒置光學(xué)顯微鏡下，隨機選擇5個100倍視野，計算侵襲細胞數(shù)。

5.流式細胞儀檢測細胞凋亡情況：用培養(yǎng)基調(diào)整指數(shù)生長期的細胞密度到5×105/ml，接種于6孔板，每孔1 ml細胞懸液，轉(zhuǎn)染24 h后按照AnnexinV-APC/7-AAD細胞凋亡檢測試劑盒進行操作。同時設(shè)陰性對照，即正常細胞不加AnnexinV-APC和7-AAD；陽性對照1，以凋亡效果最明顯的溶劑組作為陽性對照，只加5 μl AnnexinV-APC單標(biāo)；陽性對照2，以凋亡效果最明顯的溶劑組作為陽性對照，只加5 μl 7-AAD單標(biāo)。流式細胞儀上機檢測，以nnexinV-APC和7-AAD雙陽、AnnexinV-APC單陽細胞視為凋亡細胞。

6.Western blot檢測蛋白表達：細胞裂解后提取總蛋白，BCA法測定總蛋白濃度。通過12%聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS/PAGE)分離蛋白，并通過電印跡轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜。室溫下，5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗孵育，4℃過夜。漂洗后，HRP標(biāo)記二抗室溫孵育1 h。顯影，曝光，BandScan分析膠片灰度值。

7.免疫共沉淀法檢測Fyn活性：將總細胞裂解蛋白液與50 μl蛋白A/G-瓊脂糖珠混合，混合物4℃ 10 000g離心10 min，取上清液，加入5～30 μg靶向FYN特異性抗體，室溫孵育1 h，再加入30 μl蛋白A/G-瓊脂糖，室溫孵育20 min。使用通用酪氨酸激酶測定試劑盒，依照說明書測定Fyn激酶活性。

四、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、miR-125a-3p在3種不同細胞系中的表達水平

采用實時熒光定量PCR檢測HTR-8/SVneo、JAR和JEG-3細胞中miR-125a-3p的表達，結(jié)果顯示，miR-125a-3p mRNA相對表達水平在HTR-8/SVneo、JAR和JEG-3細胞中依次降低，以HTR-8/SVneo細胞為參照，分別為(1.000±0.012)、(0.664±0.022)和(0.322±0.019)，組間比較均有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)(圖1)。

與HTR-8/SVneo組比較，**P<0.01；與JAR組比較，##P<0.01。圖1 miR-125a-3p在不同細胞系中的表達

二、miR-125a-3p干預(yù)對其在滋養(yǎng)層細胞中表達水平的影響

干預(yù)實驗以miR-125a-3p表達最高的HTR-8/SVneo細胞系和miR-125a-3p表達最低的JEG-3細胞系為實驗對象，轉(zhuǎn)染miR-125a-3p inhibitor后，實時熒光定量PCR檢測滋養(yǎng)層細胞中miR-125a-3p表達水平。HTR-8/SVneo和JEG-3細胞中inhibitor組miR-125a-3p的相對表達水平顯著低于空白對照組(CK組)及陰性對照組(NC組)[分別為(0.406±0.038)vs.(1.000±0.029)vs.(1.031±0.098)，(0.415±0.035)vs.(1.000±0.093)vs.(1.060±0.092)，P<0.05](圖2)。

A：HTR-8/SVneo細胞；B：JEG-3細胞。與其他兩組比較，*P<0.05。圖2 HTR-8/SVneo細胞和JEG-3細胞轉(zhuǎn)染miR-125a-3p inhibitor后的表達抑制

三、miR-125a-3p對滋養(yǎng)層細胞增殖能力的影響

CCK-8檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-125a-3p inhibitor后滋養(yǎng)層細胞的增殖能力增強(圖3)。HTR-8/SVneo細胞的增殖率，CK組為(100.000±3.808)%，NC組為(99.408±0.854)%，inhibitor組則升高至(142.190±3.297)%，inhibitor組與其他兩組比較具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。JEG-3細胞的增殖率，CK組為(100.000±1.762)%，NC組為(98.821±3.064)%，inhibitor組則升高至(120.917±2.239)%，inhibitor組與其他兩組比較具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。

與其他兩組比較，*P<0.05。圖3 miR-125a-3p對滋養(yǎng)層細胞增殖能力的影響

四、miR-125a-3p對滋養(yǎng)層細胞侵襲作用的影響

Transwell小室實驗結(jié)果顯示，HTR-8/SVneo細胞系中miR-125a-3p inhibitor轉(zhuǎn)染細胞的侵襲數(shù)量較CK組和NC組顯著增加[(1.422±0.062)vs.(1.000±0.025)vs.(1.006±0.027)，P<0.05]；JEG-3細胞系中inhibitor組的細胞侵襲數(shù)量較CK組和NC組顯著增加[(1.286±0.026)vs.(1.000±0.022)vs.(1.010±0.033)，P<0.01](圖4)。

五、miR-125a-3p對滋養(yǎng)層細胞凋亡的影響

流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，miR-125a-3p抑制后，滋養(yǎng)層細胞的凋亡數(shù)量減少(圖5)。HTR-8/SVneo細胞的凋亡率，CK組為(6.137±0.159)%，NC組為(6.437±0.266)%，inhibitor組則下降至(2.290±0.223)%，inhibitor組與其他兩組比較具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)。JEG-3細胞的凋亡率，CK組為(6.793±0.134)%，NC組為(7.547±0.273)%，inhibitor組則為(4.287±0.333)%，inhibitor組與其他兩組比較具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。

A：不同處理下滋養(yǎng)層細胞相對侵襲數(shù)量：與其他兩組比較，*P<0.05，**P<0.01。B：各組Transwell小室實驗結(jié)果：圖中藍紫色顯示為遷移到下層的細胞。圖4 miR-125a-3p對滋養(yǎng)層細胞侵襲能力的影響

A：不同條件下滋養(yǎng)層細胞凋亡情況的流式細胞散點圖；B：各組細胞的凋亡率：與其他兩組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖5 miR-125a-3p對滋養(yǎng)層細胞凋亡的影響

六、miR-125a-3p對滋養(yǎng)層細胞中Fyn的表達和活性的影響

HTR-8/SVneo和JEG-3細胞進行轉(zhuǎn)染實驗后，檢測Fyn的mRNA和蛋白表達，以及活性變化。結(jié)果顯示，miR-125a-3p inhibitor轉(zhuǎn)染組中Fyn的mRNA和蛋白表達量明顯增加，活性水平亦明顯升高(圖6)。HTR-8/SVneo細胞中Fyn mRNA相對表達水平：CK組為(1.000±0.108)，NC組為(0.990±0.082)，inhibitor組上升至(3.590±0.184)，inhibitor組與其他兩組相比有顯著性差異(P<0.01)；HTR-8/SVneo細胞中Fyn蛋白相對表達量：inhibitor組(2.851±0.205)顯著高于CK組(1.018±0.204)和NC組(1.000±0.241)(P<0.05)；HTR-8/SVneo細胞中Fyn的活性水平：inhibitor組[(73.311±3.090)U/5×106細胞]顯著高于CK組[(25.322±2.025)U/5×106細胞]和NC組[(32.000±1.732)U/5×106細胞](P<0.01)。JEG-3細胞呈現(xiàn)出類似的改變，inhibitor組Fyn mRNA相對表達水平(2.070±0.130)顯著高于CK組(1.000±0.089)和NC組(1.080±0.102)(P<0.01)；Fyn蛋白相對表達量(2.797±0.047)顯著高于CK組(1.125±0.020)和NC組(1.000±0.047)(P<0.01)；Fyn活性水平[(154.200±2.810)U/5×106細胞]顯著高于CK組[(108.684±3.888)U/5×106細胞]和NC組[(103.242±2.755)U/5×106細胞](P<0.01)。

A：Western blot檢測Fyn蛋白水平；B：實時熒光定量PCR檢測Fyn mRNA水平；C：免疫共沉淀檢測Fyn活性水平。與其他兩組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖6 抑制miR-125a-3p后Fyn mRNA和蛋白表達及活性變化

七、miR125a-3p對滋養(yǎng)層細胞中相關(guān)信號通路的影響

采用Western blot檢測抑制miR-125a-3p后滋養(yǎng)層細胞中相關(guān)信號通路ERK1/2和STAT3的磷酸化水平，以評估m(xù)iR-125a-3p是否可通過ERK1/2-STAT3通路對滋養(yǎng)層細胞的功能發(fā)揮調(diào)控作用。如圖7顯示，轉(zhuǎn)染miR-125a-3p inhibitor后，ERK1/2及STAT3的磷酸化水平均不同程度增加。HTR-8/SVneo細胞中miR-125a-3p inhibitor轉(zhuǎn)染組中的ERK1/2和STAT3磷酸化比值為(0.904±0.071)、(0.903±0.018)，分別顯著高于CK組的(0.322±0.024)和(0.308±0.052)以及NC組的(0.338±0.024)和(0.332±0.054)(P<0.05)；JEG-3細胞中miR-125a-3p inhibitor轉(zhuǎn)染組中的ERK1/2和STAT3的磷酸化比值為(0.913±0.090)、(0.893±0.113)，分別顯著高于CK組的(0.271±0.020)和(0.348±0.091)以及NC組的(0.298±0.006)和(0.341±0.096)(P<0.05)。

A：不同條件下各蛋白的代表性Western blot條帶；B：不同條件下ERK1/2的磷酸化水平；C：不同條件下STAT3的磷酸化水平；與其他兩組比較，*P<0.05。圖7 miR-125a-3p對滋養(yǎng)層細胞中ERK1/2-STAT3信號通路的影響

討 論

滋養(yǎng)層細胞是一類特殊的上皮細胞，具有強大的侵襲能力。妊娠過程中，滋養(yǎng)層細胞對子宮的侵襲過程類似腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移，但與腫瘤細胞不同，滋養(yǎng)層細胞的活動同時受到刺激因子和抑制因子的調(diào)控而具有時空特異性和自限性。滋養(yǎng)層細胞自身、子宮上皮和基質(zhì)細胞、子宮自然殺傷細胞及巨噬細胞等產(chǎn)生的各類因子均可調(diào)控滋養(yǎng)層細胞的行為及功能，酪氨酸激酶JAK-STAT3、ERK1/2、Wnt等多條信號通路參與其中。各因素維持動態(tài)平衡是保證滋養(yǎng)層細胞發(fā)揮正常功能的關(guān)鍵[6-7]。滋養(yǎng)層細胞功能異常與胚胎著床失敗、自然流產(chǎn)、妊娠滋養(yǎng)層細胞疾病、子癇、胎兒宮內(nèi)生長受限等妊娠并發(fā)癥的發(fā)生相關(guān)。

人胎盤可不同程度地表達大量miRNAs，滋養(yǎng)層細胞是其主要來源[8-9]。使用miRNA陣列等高通量測序方法已在正常人類胎盤中鑒定出600多種miRNAs[10]。同樣，從胎盤分離的滋養(yǎng)層細胞中也檢測到762種miRNAs，其中大約一半明顯表達，部分特異性表達于人胎盤，且這些miRNAs的表達隨著妊娠時期的變化而改變[9]。miRNA在胎盤中的時間表達模式提示其在不同妊娠時期可能具有特定功能，并在妊娠的建立和維持中發(fā)揮重要作用。而正常妊娠和病理妊娠胎盤組織中miRNA的表達也不同。Hromadnikova等[11]的研究顯示，與正常妊娠胎盤相比，子癇前期和胎兒宮內(nèi)生長受限患者胎盤中miR-515-5p、miR-517-5p和miR-520a-5p等多種miRNA表達改變，提示miRNA可通過某些靶向基因調(diào)控滋養(yǎng)層細胞行為和功能，包括凋亡、遷移和侵襲等。例如子癇前期胎盤中高表達的miR-24-3p靶向作用于視黃醇結(jié)合蛋白4，抑制滋養(yǎng)層細胞的增殖和侵襲[12]。而另一些miRNAs則可能促進滋養(yǎng)層細胞的活動，在相關(guān)疾病中發(fā)揮相反作用。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-18b通過下調(diào)Notch2依賴的T細胞免疫球蛋白粘液素3/雷帕霉素復(fù)合物1通路，促進滋養(yǎng)層細胞的增殖和侵襲，進而有利于改善子癇前期狀態(tài)[13]。

miR-125a-3是miR-125a家族的成員，起源于pre-miR-125a的3′端。既往報道指出，miR-125a-3p通常在癌細胞中異常表達，對各種類型癌癥的發(fā)展具有不同的影響，可作為腫瘤診斷的標(biāo)志因子及治療靶點[14-15]。例如，miR-125a-3p在人乳頭狀甲狀腺癌組織和細胞系中的表達水平分別低于正常甲狀腺組織和正常甲狀腺細胞系，對于乳頭狀甲狀腺癌細胞的生長和轉(zhuǎn)移具有顯著抑制作用[16]。本研究發(fā)現(xiàn)滋養(yǎng)層細胞可表達miR-125a-3p，并且在不同滋養(yǎng)層細胞系中表達水平亦存在差異，提示miR-125a-3p的表達與滋養(yǎng)層細胞狀態(tài)及功能有關(guān)。我們的進一步研究證實，miR-125a-3p對于滋養(yǎng)層細胞的增殖、侵襲同樣具有抑制作用，同時可促進滋養(yǎng)層細胞的凋亡。此為對miR-125a-3p在滋養(yǎng)層細胞中表達及作用的首次研究。

我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)yn可促進滋養(yǎng)層細胞的活動。Fyn為非受體酪氨酸激酶Src家族中的一員，可表達于多種細胞的質(zhì)膜上，通過調(diào)控各類信號傳導(dǎo)通路，參與細胞的分化、凋亡、運動和侵襲等，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展和免疫細胞的增殖分化中具有重要作用。值得注意的是，miR-125a-3p被證實可通過與Fyn mRNA 3′端的非翻譯區(qū)相結(jié)合直接抑制Fyn的表達和活性，miR-125a-3p對腫瘤細胞的調(diào)控作用至少部分依賴于Fyn[17]。本研究中，轉(zhuǎn)染miR-125a-3p inhibitor后，滋養(yǎng)層細胞中Fyn蛋白、mRNA表達及活性均顯著升高，這也證實在滋養(yǎng)層細胞中miR-125a-3p同樣對Fyn發(fā)揮負調(diào)控作用。

ERK1/2信號通路主要參與細胞增殖活化、形態(tài)維持、骨架重建等，與滋養(yǎng)層細胞的功能密切相關(guān)。最近的一項研究指出，ERK1/2通路參與調(diào)控滋養(yǎng)層細胞的侵襲遷移活動[18]。另有研究表明，在不同的刺激因子下，ERK1/2通路活化，STAT3隨即發(fā)生磷酸化，促進JEG-3細胞的侵襲[19]。ERK1/2通路被抑制后，人滋養(yǎng)層細胞系HTR8/SVneo的增殖、侵襲能力和IFN-γ的分泌水平均下降[20]。本研究轉(zhuǎn)染miR-125a-3p inhibitor后，滋養(yǎng)層細胞中ERK1/2和STAT3的磷酸化水平均顯著升高，提示在滋養(yǎng)層細胞中miR-125a-3p可抑制ERK1/2-STAT3信號通路的活化。

綜上所述，本研究首次發(fā)現(xiàn)滋養(yǎng)層細胞中存在miR-125a-3p的表達，且其在絨癌細胞系中低表達，表達水平與滋養(yǎng)層細胞功能相關(guān)。通過對Fyn和ERK1/2-STAT3信號通路的抑制作用，miR-125a-3p可抑制滋養(yǎng)層細胞的增殖和侵襲，促進其凋亡，進而在胚胎著床中發(fā)揮重要作用。對于臨床樣本及動物實驗的研究將在后續(xù)進一步開展，并更深入探討調(diào)控機制。本研究有利于進一步理解胚胎著床過程及滋養(yǎng)層細胞的功能調(diào)控，并為胚胎著床失敗、自然流產(chǎn)、妊娠滋養(yǎng)層細胞疾病的防治提供理論參考。