高巍

（遼寧省撫順市新賓縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，遼寧 撫順 113200）

我國(guó)是水禽（主要是鴨和鵝等）養(yǎng)殖的第一大國(guó)。隨著養(yǎng)殖生產(chǎn)集約化程度的提高，多種傳染性疾病已成為阻礙水禽養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的瓶頸，其中鴨疫里默氏桿菌病是危害最大和最難控制的疾病之一。鴨疫里默氏桿菌病是鴨、鵝、火雞和其它鳥類的一種高致病性和接觸性傳染病，主要侵害1~8周齡（尤其2~3周齡）雛鴨、雛鵝及雛火雞等[1]。該病的病原為鴨疫里默氏桿菌（Riemerella anatipestifer, RA），其血清型較為復(fù)雜，目前我國(guó)流行的鴨疫里默氏桿菌血清型主要以1型、2型和10型為主[2-3]。

自1904年Riemer最初發(fā)現(xiàn)鵝群感染鴨疫里默氏桿菌以來，該病已呈世界性分布[4]。我國(guó)研究者則于1982年首次發(fā)現(xiàn)北京鴨感染血清1型鴨疫里默氏桿菌[5]。目前，對(duì)于鴨疫里默氏桿菌病的診斷主要是依靠發(fā)現(xiàn)地的流行病學(xué)調(diào)查、發(fā)病動(dòng)物群體的臨床癥狀觀察、剖檢后的病理變化分析及實(shí)驗(yàn)室診斷相結(jié)合的方式。本試驗(yàn)從遼寧省某疑似發(fā)生鴨疫里默氏桿菌病的規(guī)?；B(yǎng)鵝場(chǎng)采集雛鵝的腦和心臟病料12份，分離培養(yǎng)病原菌并進(jìn)行革蘭氏染色，利用PCR方法及生化試驗(yàn)進(jìn)行鑒定，并對(duì)獲得的1株鴨疫里默氏桿菌進(jìn)行血清型定型、耐藥性分析及致病性試驗(yàn)等生物學(xué)分析，以期為今后遼寧省水禽養(yǎng)殖場(chǎng)鴨疫里默氏桿菌病的防控和治療提供臨床數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

從遼寧省某規(guī)?；B(yǎng)鵝場(chǎng)中疑似感染鴨疫里默氏桿菌的雛鵝體內(nèi)采集腦和心臟病料共計(jì)12份，患病雛鵝拉白色或綠色稀便，出現(xiàn)共濟(jì)失調(diào)等神經(jīng)癥狀。

1.2 主要試劑

TSA固體培養(yǎng)基、TSB液體培養(yǎng)基和哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基均購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司，藥敏紙片購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司，生化鑒定管購(gòu)自北京陸橋技術(shù)股份有限公司，鴨疫里默氏桿菌 1、2、3、10 型陽性血清，均由東北大學(xué)提供。

1.3 鴨疫里默氏桿菌的分離與鑒定

對(duì)疑似感染鴨疫里默氏桿菌的雛鵝進(jìn)行解剖，無菌采集病鵝的腦和心臟病料，分別劃線接種至哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基，置于37℃、CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)約24～48 h。挑取平板上的單個(gè)菌落，進(jìn)一步劃線至TSA固體平板上進(jìn)行細(xì)菌純化培養(yǎng)。挑取TSA固體平板上的單菌落至TSB液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，將擴(kuò)增后的菌液涂布到載玻片上，經(jīng)革蘭氏染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察菌體的形態(tài)。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道設(shè)計(jì)合成引物，取純化后的菌液利用16S rRNA引物進(jìn)行菌液PCR鑒定[6]，引物序列見表1。同時(shí)利用生化鑒定管對(duì)獲得的菌株開展生化分析試驗(yàn)。

表1 鴨疫里默氏桿菌的PCR鑒定引物

1.4 鴨疫里默氏桿菌的血清型鑒定

參照文獻(xiàn)[7]方法，分別用PBS緩沖液和大腸桿菌作為抗原陰性反應(yīng)對(duì)照，采用玻片凝集法對(duì)分離鑒定到的鴨疫里默氏桿菌進(jìn)行血清型鑒定。判定結(jié)果的方法：菌液與陽性血清混合之后3 min內(nèi)出現(xiàn)顆粒狀凝集者為陽性，只出現(xiàn)輕微凝集的判為可疑，不出現(xiàn)凝集者為陰性。

1.5 鴨疫里默氏桿菌的藥敏試驗(yàn)

按紙片法對(duì)鴨疫里默氏桿菌分離株進(jìn)行15種常見藥物的敏感性分析試驗(yàn)，不同藥物紙片的敏感度判斷標(biāo)準(zhǔn)參見說明書。

1.6 鴨疫里默氏桿菌的致病性試驗(yàn)

在TSA平板上劃線復(fù)蘇鴨疫里默氏桿菌分離株，在37℃條件下CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，將菌液離心后利用生理鹽水洗滌沉淀2次，最后用生理鹽水重懸沉淀，將菌數(shù)調(diào)整至5×109cfu/mL。將處理好的菌液經(jīng)頸部皮下接種10羽7日齡雛鴨，每只注射500 μL，對(duì)照組的10羽雛鴨采用同種方式接種等量TSB液體培養(yǎng)基。每日觀察雛鴨的日常狀態(tài)、發(fā)病和死亡情況等，并記錄數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌分離鑒定結(jié)果

將采集的病料涂布血平板培養(yǎng)后，生成的白色菌落有光澤，表面光滑，半透明且邊緣整齊。分離菌株染色后經(jīng)鏡檢顯示為革蘭氏陰性菌，呈短桿狀，以單個(gè)或成對(duì)存在，少量呈短鏈狀。利用16S rRNA基因引物鑒定菌株，均擴(kuò)增出片段大小約為500 bp的目的條帶，經(jīng)序列比對(duì)分析確定為鴨疫里默氏桿菌。該株鴨疫里默氏桿菌分離株的生化試驗(yàn)結(jié)果顯示，觸酶試驗(yàn)和脲酶試驗(yàn)結(jié)果為陽性，而不同糖的微量反應(yīng)試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、MR試驗(yàn)和V-P試驗(yàn)等結(jié)果則均為陰性，符合鴨疫里默氏桿菌的基本生化特性。

2.2 血清型鑒定結(jié)果

血清型鑒定結(jié)果顯示，該分離株能與鴨疫里默氏桿菌1型陽性血清產(chǎn)生凝集，而與其它幾種血清型的陽性血清均未產(chǎn)生凝集，因此確定該菌株屬于血清型1型。

2.3 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)分離得到的鴨疫里默氏桿菌經(jīng)藥敏紙片法進(jìn)行耐藥性分析，試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。該分離株對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類和β-內(nèi)酰胺類藥物敏感性較高，對(duì)氯霉素類藥物中敏，而對(duì)卡那霉素、鏈霉素和慶大霉素等氨基糖苷類抗生素則表現(xiàn)出明顯的耐藥性。

表2 鴨疫里默氏桿菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.4 致病性試驗(yàn)結(jié)果

雛鴨致病性試驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組雛鴨在整個(gè)試驗(yàn)過程中精神狀況和采食情況均正常且未出現(xiàn)死亡。試驗(yàn)組的10羽雛鴨在接種24 h后開始出現(xiàn)發(fā)病癥狀，發(fā)病雛鴨表現(xiàn)出精神不振、拉黃白稀便、羽毛臟亂和采食減少等臨床癥狀，發(fā)病率為100%。試驗(yàn)組雛鴨在接種36 h后開始出現(xiàn)死亡，共死亡8羽，死亡率達(dá)80%。以上結(jié)果證實(shí)，本試驗(yàn)分離得到的這株鵝源鴨疫里默氏桿菌對(duì)雛鴨也有較強(qiáng)的致病性。

3 討論

鴨疫里默氏桿菌在世界各水禽養(yǎng)殖地區(qū)均有流行，由于其感染后的發(fā)病率和死亡率高，且近年來在我國(guó)呈上升趨勢(shì)，防控形勢(shì)愈發(fā)嚴(yán)峻，給我國(guó)水禽養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[8]。盡管鴨疫里默氏桿菌能夠侵害鴨、鵝等不同種類的禽類，但是在實(shí)際生產(chǎn)中鴨疫里默氏桿菌病疫情的暴發(fā)絕大多數(shù)見于鴨群，也使人們更多地去關(guān)注鴨群中本病流行的情況，而對(duì)鵝群的感染狀況有所忽略。近期，遼寧省內(nèi)一家肉鵝養(yǎng)殖場(chǎng)出現(xiàn)雛鵝死亡病例，患病雛鵝表現(xiàn)出稀便和神經(jīng)癥狀，而對(duì)病死雛鵝剖檢后的病理變化顯示，各種癥狀與鴨疫里默氏桿菌病非常相似。為了探究該養(yǎng)殖場(chǎng)雛鵝的感染情況，本試驗(yàn)對(duì)死亡雛鵝進(jìn)行病原學(xué)檢測(cè)，采用常規(guī)方法分離細(xì)菌病原，并對(duì)分離菌株進(jìn)行血清型鑒定試驗(yàn)，結(jié)果顯示，該病原菌為血清1型鴨疫里默氏桿菌。

目前臨床中對(duì)于鴨疫里默氏桿菌病多以藥物治療為主，但由于治療中抗生素的不斷濫用，鴨疫里默氏桿菌對(duì)多種抗生素產(chǎn)生耐藥性，其耐藥譜也越來越廣泛。文獻(xiàn)報(bào)道顯示，不同地區(qū)或不同分離源的鴨疫里默氏桿菌分離株對(duì)抗生素的敏感性存在差異。吳彩艷等的研究顯示，廣東地區(qū)鴨疫里默氏桿菌普遍對(duì)氟苯尼考、阿莫西林及頭孢類藥物比較敏感，而對(duì)強(qiáng)力霉素、環(huán)丙沙星和恩諾沙星則嚴(yán)重耐藥[9]。張燕等對(duì)安徽地區(qū)34株鴨疫里默氏桿菌分離株的耐藥性分析試驗(yàn)結(jié)果顯示，這些分離株對(duì)氨基糖苷類和大環(huán)內(nèi)酯類藥物耐藥性最高，對(duì)頭孢類和氯霉素類最為敏感[2]。本試驗(yàn)根據(jù)藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果分析顯示，分離株對(duì)氨基糖苷類藥物有很強(qiáng)的耐藥性，而對(duì)四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類和β-內(nèi)酰胺類藥物則較為敏感。此外，致病性研究結(jié)果還表明，這株鵝源鴨疫里默氏桿菌對(duì)鴨也具有致病性。上述結(jié)果能為該肉鵝養(yǎng)殖場(chǎng)的鴨疫里默氏桿菌感染防治提供一定參考。