李 林，鞏明霞，遲田英，王英麗，于小靜，杜秋明，南文龍，陳義平，王志亮

（1.中國動物衛(wèi)生與流行病學中心，山東青島 266032；2.延邊州動物疫病預防控制中心，吉林延吉 133400）

牛結節(jié)性皮膚?。╨umpy skin disease，LSD）是由牛結節(jié)性皮膚病病毒（lumpy skin disease virus，LSDV）引起牛全身性感染的急性、亞急性或慢性傳染病。該病主要通過吸血媒介昆蟲機械傳播，也可以通過污染的飼料和水等直接或間接傳播。LSD 發(fā)病率受許多因素影響（如養(yǎng)殖條件、免疫狀態(tài)和蟲媒密度等），變動范圍較大，死亡率較低。所有品種的牛，不論年齡和性別都會受到影響，其中哺乳期犢牛更為嚴重。一些野生動物如長頸鹿、羚羊和跳羚等，也可以感染LSDV。LSDV 是雙鏈DNA 病毒，屬于痘病毒科（Poxviridae）羊痘病毒屬（Capripoxvirus，CaPV），同屬的病毒還包括山羊痘病毒（goatpox virus，GTPV）和綿羊痘病毒（sheeppox virus，SPPV）[1]。LSD 典型特征是在皮膚上形成結節(jié)，從而導致牛皮受損，還可造成產(chǎn)奶量下降、流產(chǎn)、不育等，少數(shù)發(fā)病牛最終因嚴重感染死亡，還因牛的流動和貿(mào)易限制造成間接損失，對養(yǎng)牛業(yè)產(chǎn)生重大經(jīng)濟影響，因此LSD 被世界動物衛(wèi)生組織列為法定通報疫病，在我國被確定為二類動物疫病。

LSD 最早于1929 年發(fā)現(xiàn)于非洲贊比亞，其后在非洲多個國家流行，1957 年首次證實由LSDV引起。自2012 年起，該病由中東傳播至歐洲東南部，并持續(xù)蔓延到高加索和巴爾干地區(qū)以及俄羅斯和哈薩克斯坦等國家。2019 年以來，南亞、東亞和東南亞等地區(qū)相繼暴發(fā)LSD[2-10]。我國于2019 年8月首次確診新疆維吾爾自治區(qū)伊犁州發(fā)生LSD 疫情，此后疫情波及安徽、福建、江西、廣東和浙江等十余個省份。有效的疫苗免疫配合其他控制措施是控制和消滅LSD 最有效的方式。本文著重介紹了國內(nèi)外常用LSD 疫苗的種類、副作用及其免疫效果和質(zhì)量控制，以期為該病控制和消滅提供技術支持。

1 疫苗種類

目前只有弱毒活疫苗（LAV）用于預防LSD：第一類為基于LSDV 毒株的弱毒同源疫苗，包括Neethling 株疫苗和KGSP 株疫苗；第二類為非LSDV 毒株的弱毒異源羊痘疫苗，包括山羊痘疫苗（Kedong、Gorgan 和AV41 株等）和綿羊痘疫苗（Yugoslavian RM65、羅馬尼亞株和Bakirk?y株等）。

1.1 弱毒同源活疫苗

同源疫苗能為牛提供很好的保護，免受毒力較強的野毒侵襲。國外常用的這類疫苗包括由南非Neethling 株以及肯尼亞綿羊和山羊痘病毒（Kenyan sheep and goat pox virus，KSGP）KSGP O-240 株和KSGP O-180 株為種毒的一系列疫苗。

1.1.1 Neethling 毒株疫苗 Neethling 原型毒株（Neethling-WC/RSA/1957）分離自1957 年南非Western Cape 省的一起疫情。為了在牛身上安全地使用，通過大量傳代來致弱LSDV 野毒株毒力。先在羔羊腎（LK）細胞中連續(xù)傳代61 代，而后在雞胚絨毛尿囊膜上傳代20 代，又在LK 細胞中傳代3 代，最終獲得減毒疫苗表型毒株（LW-1959）。自20 世紀60 年代以來，南非一直使用Neethling/vaccine/LW1959 毒株疫苗來控制該病。目前該毒株在不同的公司有多種衍生疫苗，如OBP（南非Onderstepoort Biological Products 公司）、Herbivac LS（南非Deltamune 公司）和Bovivax（摩洛哥MCI Sante Animale 公司）是基于Neethling 株的LSD 疫苗，而Lumpyvax?（南非MSD 公司）是基于SIS Neethling 毒株的疫苗。通過對Lumpyvax、Herbivac LS 和OBP 等疫苗毒株的全基因組測序，3 個毒株與Neethling 疫苗LW 1959 株基因組之間有99.9%的同源性[11]。這3 個疫苗株與LW 1959毒株的不同之處在于有2 個氨基酸修飾和2 個不影響編碼序列的單核苷酸缺失。在LW037（G/V）基因上，Lumpyvax 和Herbivac LS 都有額外的氨基酸差異。此外，Herbivac LS 顯示出2 個單核苷酸缺失，其中1 個缺失會導致LW134a基因的移碼。OBP 在末端非編碼區(qū)包含1 個18 nt 缺失和另外3個不影響編碼序列的單核苷酸插入/缺失[12]。

1.1.2 KSGP 毒株疫苗 除Neethling 毒株疫苗外，另兩種同源性疫苗為KSGP O-240 和KSGP O-180疫苗。這些疫苗已在埃塞俄比亞、以色列和埃及等幾個國家用于預防LSD。KSGP O-240 和KSGP O-180 這兩個毒株都來自綿羊，均可感染綿羊和山羊，毒株之間沒有太大差異，只是分離時間不同[13]。區(qū)別在于KSGP O-180 分離株通過在胎牛肌肉細胞中傳代18 代獲得，而KSGP O-240 株在細胞中僅傳代6次獲得。還有1種KS-1毒株（Kenyan sheep pox）疫苗是從KSGP 疫苗衍生而來的。KSGP 毒株疫苗多年來已被廣泛用于預防山羊痘和綿羊痘[14]。雖然這些毒株的名稱指的是SPPV 和GTPV，但KSGP 和KS-1 毒株的真正身份已被證實為LSDV 毒株[14-15]。

1.2 弱毒異源活疫苗

LSDV 基因組與SPPV 和GTPV 非常相似，有97%的核苷酸同源性。羊痘病毒屬的3 種病毒在血清學上彼此無法區(qū)分，能夠誘導異源交叉保護，因此異源疫苗（山羊痘疫苗和綿羊痘疫苗）也被用于防控LSD。雖然同源疫苗（Neethling 疫苗或KSGP 疫苗）能給牛提供良好的保護，但疫苗免疫時會出現(xiàn)一些溫和的副反應，而羊痘疫苗在牛身上通常不會引起副反應。另外，羊痘疫苗的優(yōu)勢是價格相對便宜，尤其是在羊痘流行的國家。對于那些沒有同源疫苗但又同時流行LSD、綿羊痘和山羊痘的國家，出于經(jīng)濟和安全性原因，一些國家傾向于使用異源弱毒疫苗來預防控制LSD 傳播。

已經(jīng)用于LSD 防控的山羊痘疫苗包括Kedong株、Gorgan 株、G20-LKV 株以及國內(nèi)使用的AV41 株山羊痘疫苗[16]。目前使用的綿羊痘疫苗包括Yugoslavian RM65 株、Bakirk?y 株和羅馬尼亞綿羊痘病毒（Romanian SPPV）疫苗等[17-18]。

2 正在研究中的疫苗

目前還沒有商品化的滅活LSDV 疫苗。普遍的觀點認為，滅活疫苗需要多次免疫才能產(chǎn)生良好的保護作用。近年來，出于對同源活疫苗副作用和出現(xiàn)重組病毒的擔心，滅活疫苗獲得了更多關注并顯示出替代LAV 的潛力[19-20]。摩洛哥研制了一種以Neethling 株為基礎的油佐劑滅活疫苗，在保加利亞進行了臨床試驗。結果發(fā)現(xiàn)：該疫苗很安全，未引起任何不良反應；從接種后第7 天開始產(chǎn)生高水平的特異性抗體，誘導保護作用與活疫苗相似，完全保護強毒株攻毒。此外，臨床研究證實了該疫苗的安全性和有效性。該疫苗在長達1 年的時間里沒有表現(xiàn)出任何不良反應，并誘導了高水平的抗體[19]。另一項研究[21]發(fā)現(xiàn)，一種低分子量共聚物佐劑疫苗配方可為免疫動物遭受強毒感染提供保護。該發(fā)現(xiàn)有力支持了針對LSDV 感染時使用滅活疫苗的可能性，并表明所選擇的佐劑對保護效果有顯著影響。

LDSV 基因組較大，可以作為重組亞單位疫苗的骨架?；贚SDV 的載體系統(tǒng)已經(jīng)被廣泛用于構建攜帶其他病毒（如藍舌病病毒、裂谷熱病毒和牛流行熱病毒等）保護性抗原的重組疫苗，其中許多已經(jīng)證明能誘導有效的免疫保護，可實現(xiàn)一種疫苗預防多種疫病[22-25]。

3 疫苗免疫效果

3.1 弱毒同源疫苗

疫苗在過去幾十年間被廣泛應用于預防LSD，其中Neethling 疫苗應用范圍最廣，時間最長。2012—2013 年以色列[18]、2014—2015 年塞浦路斯[26]以及2016—2017 年歐洲東南部，通過使用同源Neethling 疫苗進行大規(guī)模免疫接種成功控制了LSD 疫情，證明了同源減毒活疫苗具有良好的臨床應用效果[27-28]。對歐洲巴爾干地區(qū)6 個國家免疫Neethling 疫苗后的結果總結發(fā)現(xiàn)，該疫苗對于預防LSD 具有很高的有效性。這6 個國家的疫苗效力（vaccine effectiveness，VE）平均為79.8%（95%CI：73.2%～84.7%），阿爾巴尼亞最低，為62.5%，保加利亞和塞爾維亞最高，均超過97%。從接種疫苗到形成保護性免疫的時間分析表明，VE 主要發(fā)生在接種后的前14 d[28]。

歐盟LSD 參考實驗室使用攻毒試驗，對5 種商品化弱毒同源活疫苗效力進行了評估[29]，結果發(fā)現(xiàn)：在標準條件下，所評估的5 種疫苗都能有效保護動物免受強毒LSDV 攻擊；除了血清學反應的微小差異外，疫苗之間的副作用也有部分差異，如局部反應和接種疫苗時的Neethling 反應。近年來發(fā)現(xiàn)，KSGP 疫苗不適合用于防控LSD。埃塞俄比亞采用的KS1 O-180 疫苗在保護牛群免受LSDV侵害方面效果較差，無論是直接的臨床保護還是減少傳播[30]。這都意味著需要提高疫苗質(zhì)量或開發(fā)有效的替代疫苗，以對LSD 提供良好保護。

3.2 弱毒異源疫苗

近年來的研究表明，山羊痘疫苗能給牛提供與LSDV 同源疫苗相同的保護作用[16]。2015 年埃塞俄比亞使用攻毒保護試驗和監(jiān)測免疫反應相結合的方法，首次評估了Gorgan 株疫苗的免疫效果，包括其安全性、免疫源性和效力[31]。給牛接種1 mL Gorgan 株疫苗時（病毒滴度為3.5 或4.5 TCID50/mL），該疫苗對LSDV強毒提供了良好保護，在接種疫苗的動物中沒有檢測到不良反應。用遲發(fā)型超敏反應（DTH）檢測，發(fā)現(xiàn)接種Gorgan 株疫苗的牛在接種部位顯示出強烈的細胞免疫反應，表明具有高水平的免疫原性。另外，印度和孟加拉國使用山羊痘疫苗似乎也起到了滿意的結果[13]。

雖然羊痘病毒屬的3 種病毒具有較高的遺傳相似性，但從最近的研究和疫情暴發(fā)中獲得的數(shù)據(jù)及經(jīng)驗表明，弱毒綿羊痘疫苗對LSDV 野毒株只提供部分交叉保護[32-33]。許多國家使用綿羊痘疫苗防控LSD。例如：土耳其、格魯吉亞和阿塞拜疆使用土耳其Bakirk?y SPPV 株疫苗為牛接種，劑量為用于綿羊劑量的3～10 倍；俄羅斯聯(lián)邦和亞美尼亞選擇了由俄羅斯聯(lián)邦動物衛(wèi)生中心（ARRIAH）生產(chǎn)的綿羊痘凍干疫苗[34]；在以色列和約旦，使用了RM65 株弱毒疫苗[18，35]，其劑量是接種綿羊劑量的10 倍；在埃及和沙特阿拉伯，使用羅馬尼亞SPPV 株[36]，其中沙特阿拉伯每6 個月給牛接種1 次疫苗，接種劑量是羊的10 倍[37]。與巴爾干地區(qū)使用同源疫苗成功控制LSD 相比，使用SPPV疫苗控制LSD不完全有效[27]。比如，2006—2007年，以色列使用南斯拉夫RM65 綿羊痘疫苗時，觀察到了該疫苗效力較低，而Neethling 疫苗的臨床效力是RM65 疫苗的4 倍[38]。目前，LSD 被認為是土耳其的地方病，也在俄羅斯部分地區(qū)流行，造成這一局面的原因除了這些國家對LSD 控制措施以及這些國家存在相對較大的牛種群等因素以外，使用SPPV 疫苗預防LSD 可能是其中重要原因[13]。

4 疫苗副作用

盡管弱毒同源疫苗通過連續(xù)傳代致弱，但在使用Neethling 疫苗時，牛首次免疫時會產(chǎn)生副作用。常見的副作用包括接種部位的局部反應、短暫的發(fā)燒和產(chǎn)奶量下降[39]。有些動物可能會表現(xiàn)出溫和的全身性反應，稱為Neethling 反應。這些副反應不同于毒力較強野毒株引起的損害，通常只涉及淺表和較小的皮膚損害，在2～3 周內(nèi)即可消失，不會轉化為壞死性結痂或潰瘍。在巴爾干地區(qū)使用LSD 疫苗獲得的經(jīng)驗表明，同源疫苗只有第一次接種時才會出現(xiàn)副作用，再次接種幾乎沒有副作用。以色列一項測試弱毒同源LSD 活疫苗副作用程度的觀察性對照研究結果表明，牛奶產(chǎn)量減少主要在接種疫苗后7 d 內(nèi)，每頭奶牛1 周內(nèi)減少6～8 kg（取決于胎次）。在接種疫苗后的30 d 里，總體產(chǎn)奶量減少并不明顯[40]。

為了防止LSD 傳入，作為無疫國家的克羅地亞在2016 年8—11 月使用Neethling 疫苗開展了預防性接種。這是在沒有野毒干擾的情況下，探索Neethling 疫苗接種后潛在不良影響的最佳案例。通過農(nóng)場報告并得到獸醫(yī)確認的被動監(jiān)測，記錄了接種后的不良反應：共有28 686 個牛場的431 367頭牛免疫了疫苗，其中0.19%的農(nóng)場（44 個）報道了0.09%的牛（399 頭）與免疫相關聯(lián)的不良反應和0.024%的牛死亡（102 頭）；大多數(shù)不良反應發(fā)生在接種疫苗后2 周內(nèi)；農(nóng)場報告的主要不良反應為產(chǎn)奶下降（27%）、發(fā)熱（22%）、注射部位水腫（21%）。其中某些癥狀（如產(chǎn)奶減少、發(fā)燒）可能由多種因素造成，因此不能排除其他病因，這也許高估了疫苗接種的不良反應程度[40]。

KSGP 疫苗的傳代次數(shù)較低，其減毒水平比Neethling 株疫苗低。KSGP O-240 疫苗在某些品種的牛身上免疫后觀察到了不良反應，奶牛臨床癥狀類似于LSDV 自然感染，導致產(chǎn)生發(fā)燒、皮膚損傷和產(chǎn)奶量減少等臨床癥狀[14，32]。

山羊痘疫苗和綿羊痘疫苗的副作用報道相對較少。綿羊痘疫苗在非感染或免疫牛身上引起的副作用比LSD 減毒疫苗引起的副作用更少，但是當大劑量接種SPPV RM65 疫苗可能會產(chǎn)生典型的疫苗副作用，如牛全身性皮膚損傷[41]。

5 疫苗質(zhì)量控制

世界動物衛(wèi)生組織在《陸生動物疫苗與診斷手冊》中要求LSD 疫苗對所有品種、年齡和懷孕牛均須安全。這意味著：疫苗沒有傳染性，體外細胞傳代后仍為弱毒；在使用推薦的免疫方式時，對所有品種的牛產(chǎn)生最小的臨床反應；無外源病原污染，如病毒、支原體、細菌和真菌等；若疫苗用原代細胞培養(yǎng)必須排除藍舌病病毒、口蹄疫病毒和狂犬病病毒等[13，42]。

疫苗質(zhì)量控制中至關重要的一個環(huán)節(jié)是使用分子生物學手段定期檢測疫苗中是否含有正確的羊痘病毒基因和毒株，檢查疫苗中的病毒亞群[13]。在非洲的中部和北部以及中東等地區(qū)，由于綿羊痘、山羊痘和LSD 流行相互重疊，許多國家傾向于使用Neethling 疫苗免疫牛，使用KS1 疫苗免疫羊，因此一些LSD 流行國家的疫苗生產(chǎn)企業(yè)會提供兩種類型的弱毒活疫苗。在同一生產(chǎn)線上生產(chǎn)兩種疫苗可能會造成兩種疫苗病毒交叉污染的風險[13]。

2017—2019 年以來，哈薩克斯坦、俄羅斯、印度、中國、越南和泰國等國家相繼發(fā)現(xiàn)了類疫苗重組毒株，其來源一直是個謎。根據(jù)最新的研究[43]推測，這些毒株很可能是由于哈薩克斯坦接種了質(zhì)控不合格的Lumpivax 疫苗后而產(chǎn)生的溢出結果。2016 年哈薩克斯坦暴發(fā)LSD 后使用了肯尼亞生產(chǎn)的基于Neethling 毒株的Lumpivax 疫苗（KEVEVAPI 公司，肯尼亞）。通過對兩個批次的Lumpivax 疫苗進行全基因組分析發(fā)現(xiàn)，該疫苗似乎是多種羊痘病毒的復合物。利用迭代富集/組裝策略，在疫苗中得到了類Neethling 毒株LSDV疫苗、類KSGP 毒株LSDV 疫苗和類GTPV 蘇丹株的完整基因組，并且還存在幾種重組毒株，而這些重組毒株與最近流行的類疫苗重組毒株幾乎相同。這類疫苗重組株可分為4 組，重組毒株的巨大差異表明它們是在疫苗種子生產(chǎn)過程中產(chǎn)生。因此，推測近年來多個國家流行的類疫苗重組毒株極有可能是疫苗生產(chǎn)過程中污染了其他CaPVs 而產(chǎn)生的重組病毒。

6 結語

2019 年LSD 傳入我國后，2 年內(nèi)散播至十多個省份。此前國內(nèi)對LSD 研究較少，對LSD 的防控可參考國際先進經(jīng)驗。歐洲巴爾干地區(qū)在短短幾年內(nèi)就成功控制LSD 的經(jīng)驗表明，如果區(qū)域內(nèi)積極開展疫苗研發(fā)、大規(guī)模的群體免疫接種、相關動物貿(mào)易的移動限制、實施撲殺政策、消毒和蟲媒控制等必要的防控措施，就可以有效控制LSD。因此，應結合國內(nèi)的環(huán)境狀況，積極開展疫苗、流行病學、監(jiān)測診斷等相關防控技術研究，采取綜合防控措施加快控制消滅LSD。