謝龍飛 肖丹瑜 常依 張旭財(cái) 李小申 熊文廣

摘要： 【目的】了解金黃色葡萄球菌（以下簡稱“金葡菌”） Staphylococcus aureus 中成簇的規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR） 的分布情況，分析其對(duì)抗生素耐藥基因和毒力基因水平轉(zhuǎn)移的影響?！痉椒ā繌墓矓?shù)據(jù)庫獲取組裝完整的金葡菌基因組575 個(gè)，利用生物信息學(xué)方法，統(tǒng)計(jì)CRISPR 結(jié)構(gòu)的攜帶情況，菌株多位點(diǎn)序列分型（Multi-locus sequence typing，MLST） 型別分布和菌株耐藥基因、毒力基因的分布情況；對(duì)CRISPR 結(jié)構(gòu)陽性（CRISPR+） 和CRISPR 結(jié)構(gòu)陰性（CRISPR?） 的金葡菌耐藥基因和毒力基因攜帶數(shù)目進(jìn)行差異顯著性分析。同時(shí)對(duì)實(shí)驗(yàn)室60 株金葡菌二代測序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，驗(yàn)證公共數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果。對(duì)實(shí)驗(yàn)室60 株金葡菌中原噬菌體、接合質(zhì)粒的攜帶情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，討論CRISPR 結(jié)構(gòu)對(duì)菌株原噬菌體和接合質(zhì)粒的影響。【結(jié)果】基因組組裝完整的575 株金葡菌中，有62 株攜帶CRISPR 結(jié)構(gòu)（CRISPR+），513 株不攜帶CRISPR 結(jié)構(gòu)（CRISPR?）；CRISPR+金葡球菌攜帶耐藥基因、毒力基因的數(shù)目顯著小于CRISPR?金葡菌。實(shí)驗(yàn)室60 株金葡菌中，有14 株為CRISPR+，46 株為CRISPR?；CRISPR+金葡菌攜帶更少的耐藥基因和毒力基因，與公共數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果一致。對(duì)原噬菌體和接合質(zhì)粒的分析結(jié)果顯示，CRISPR?菌株攜帶更多的原噬菌體序列，與CRISPR+菌株之間差異顯著（P<0.05）；接合質(zhì)粒方面，CRISPR?和CRISPR+菌株無顯著性差異。【結(jié)論】CRISPR 結(jié)構(gòu)可能限制了金葡菌中耐藥基因和毒力基因的水平轉(zhuǎn)移，CRISPR?菌株更容易受到噬菌體和可移動(dòng)質(zhì)粒的干擾。本研究為進(jìn)一步研究金葡菌耐藥基因和毒力基因的傳播提供了參考。

金黃色葡萄球菌（ 以下簡稱“ 金葡菌” ）Staphylococcus aureus 是一種革蘭陽性球菌，可引起肺和皮膚組織感染，甚至危及生命。作為一種機(jī)會(huì)致病菌，金葡菌已成為外科手術(shù)感染及醫(yī)療器械污染中最常見的病原體[1-3]。近年來，隨著抗生素的大量使用，金葡菌耐藥性逐漸增強(qiáng)，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcusaureus，MRSA） 的出現(xiàn)引起了全球的廣泛關(guān)注。有研究表明，金葡菌可通過噬菌體、質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子及葡萄球菌盒式染色體（ S t a p h y l o c o c c a l c a s s e t t echromosome mec，SCCmec） 等方式進(jìn)行耐藥基因的水平轉(zhuǎn)移[4-6]。mecA 作為MRSA 菌株攜帶的耐藥基因，已有研究表明mecA 主要通過SCCmec 元件進(jìn)行水平轉(zhuǎn)移[7-8]。

SCCmec 是一種具有高度多樣性的移動(dòng)遺傳因子。1999 年首次測定了1982 年分離的日本金葡菌N315 菌株的mec 整體結(jié)構(gòu)及DNA 序列。1 年后，mec DNA 被發(fā)現(xiàn)是由2 個(gè)位點(diǎn)特異性重組酶基因c c rA 和c c rB 驅(qū)動(dòng)的新基因元件，命名為S C Cmec[9]。SCCmec （SCC 家族的主要成員） 是一種攜帶mec 基因（mecA、mecB 和mecC） 以及控制其表達(dá)的基因mecR1（編碼信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白mecR1） 和mecI（編碼抑制蛋白mecI） 的移動(dòng)遺傳元件，并作為葡萄球菌菌株間基因信息交換的載體。SCCmec 位于葡萄球菌染色體復(fù)制起點(diǎn)附近，插入在插入位點(diǎn)attB （orfX 的3'端）。SCCmec 有3 個(gè)基本的遺傳因素：ccr 基因復(fù)合體（由ccrAB 或ccrC 及其周圍的ORFs 組成）、mec 基因復(fù)合體（由mec 基因、插入序列和周圍的ORFs 組成） 和連接區(qū)（J 區(qū)）。在ccr 基因復(fù)合體中，通過ccrAB 或ccrC 位點(diǎn)特異性重組，可以將多個(gè)耐藥和耐重金屬基因插入SCCmec 中，SCCmec 可通過ccrAB 或ccrC 的精確切除和整合，整合到葡萄球菌菌株的染色體上；因此，不同的葡萄球菌菌株交換遺傳信息，以適應(yīng)不同的環(huán)境和抗生素選擇的壓力[10]。SCCmec 編碼一種新的特異性青霉素結(jié)合蛋白（PBP2a），與金葡菌內(nèi)源性青霉素結(jié)合蛋白相比，PBP2a 與β–內(nèi)酰胺的結(jié)合親和力降低，導(dǎo)致抗生素失活。與其他對(duì)β–內(nèi)酰胺類抗生素的抑制機(jī)制不同，MRSA 還能夠通過PBP2a 持續(xù)合成獨(dú)特的細(xì)胞壁成分。由于獲得了SCCmec 元件，甲氧西林敏感金葡菌（ M e t h i c i l l i n - s e n s i t i v eStaphylococcus aureus，MSSA） 進(jìn)化為MRSA[11]。根據(jù)各類型SCCmec 在J 區(qū)域的差異，將SCCmec 分為不同的型和亞型。III 型SCCmec 在巴西、波蘭、伊朗、土耳其、馬來西亞、泰國、中國和中國臺(tái)灣等國家或地區(qū)為主要檢出類型[12]。本研究通過對(duì)實(shí)驗(yàn)室60 株二代測序金葡菌基因組序列SCCmec 元件進(jìn)行比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)CRISPR 陽性（CRISPR+） 和CRISPR 陰性（CRISPR?） 不同菌株中都攜帶SCCmec元件，SCCmec 元件的主要類型為III 型，另外有1 株為VIII 型，1 株為XII 型，與報(bào)道結(jié)果一致。

成簇的規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列（Clusteredregularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR） 是存在于原核生物中的一種適應(yīng)性免疫系統(tǒng)。有研究表明，約50% 的細(xì)菌攜帶CRISPR/Cas 系統(tǒng)[13]。它能夠靶向切割核酸序列，從而抵御噬菌體、質(zhì)粒等外源基因的入侵，保持細(xì)菌自身遺傳結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定[14]。CRISPR/Cas 系統(tǒng)能否限制細(xì)菌耐藥基因和毒力基因的水平轉(zhuǎn)移，目前還沒有明確的結(jié)論。M a r r a f f i n i 等[ 1 5 ] 發(fā)現(xiàn)表皮葡萄球菌RP62a 菌株的CRISPR/Cas 系統(tǒng)可以阻止質(zhì)粒的結(jié)合轉(zhuǎn)移。張蒙蒙等[ 1 6 ] 發(fā)現(xiàn)葡萄球菌中CRISPR/Cas 系統(tǒng)可以限制mecA 等耐藥基因的轉(zhuǎn)移。目前，金葡菌中CRISPR/Cas 系統(tǒng)對(duì)細(xì)菌耐藥基因和毒力基因的影響還不清楚。本研究以NCBI 數(shù)據(jù)庫5 7 5 株金葡菌的基因組序列為研究對(duì)象，探討CRISPR 結(jié)構(gòu)對(duì)其耐藥基因和毒力基因的影響，并通過對(duì)實(shí)驗(yàn)室分離菌株二代測序基因組序列進(jìn)行分析，做進(jìn)一步驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 材料

575 株金葡菌基因組序列下載自NCBI 數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/genomes/154），60 株金葡菌基因組為本研究前期臨床分離菌株的二代測序數(shù)據(jù)。

1.2 方法

1.2.1 CRISPR 位點(diǎn)的識(shí)別與提取 通過CRISPRsfinder （https：//crispr.i2bc.paris-saclay.fr/Server/） 在線進(jìn)行，統(tǒng)計(jì)具有CRISPR 位點(diǎn)的金葡菌，將金葡菌基因組分為CRISPR+和CRISPR? 2 大類。1.2.2 金葡菌多位點(diǎn)序列分型及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 對(duì)575 株金葡菌通過Center for GenomicEpidemiology 在線網(wǎng)站（http：//www.genomicepidemiology.org/） 進(jìn)行多位點(diǎn)序列分型（Multi-locussequence typing，MLST），構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。對(duì)CRISPR+和CRISPR?菌株ST 型別進(jìn)行韋恩圖的繪制，分析二者的相關(guān)性。

1.2.3 耐藥基因、毒力基因的統(tǒng)計(jì) 通過Center forGenomic Epidemiology 網(wǎng)站下載整理耐藥基因和毒力基因數(shù)據(jù)庫，預(yù)測金葡菌基因組的ORF，利用blastn 軟件進(jìn)行耐藥基因和毒力基因的比對(duì)（序列一致率>80%，覆蓋率>70%）。

1.2.4 原噬菌體和接合質(zhì)粒的比對(duì)分析 實(shí)驗(yàn)室6 0 株金葡菌基因組通過P H A S T ER 在線網(wǎng)站（http：//phaster.ca/） 比對(duì)原噬菌體的攜帶情況，統(tǒng)計(jì)結(jié)果為完整噬菌體序列。通過Center for GenomicEpidemiology 在線網(wǎng)站比對(duì)接合質(zhì)粒存在情況（序列一致率>95%）。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，CRISPR+和CRISPR?與耐藥基因和毒力基因之間的關(guān)系采用χ2 檢驗(yàn)，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 金葡菌基因組中CRISPR 結(jié)構(gòu)分布概況

公共數(shù)據(jù)庫575 株金葡菌中有62 株（11%） 含有確證的CRISPR 位點(diǎn)（CRISPR+），513 株（89%）無或僅含有可疑的CRISPR 結(jié)構(gòu)（CRISPR?）。實(shí)驗(yàn)室6 0 株金葡菌中有1 4 株（ 2 3 % ） 含有確證的CRISPR 位點(diǎn)（CRISPR+），46 株（77%） 無或僅含有可疑的CRISPR 結(jié)構(gòu)（CRISPR?）。

2.2 金葡菌MLST 型別及相關(guān)性分析

對(duì)5 7 5 株金葡菌基因組進(jìn)行M L S T 分型，536 株可以進(jìn)行ST 分型，共得到81 個(gè)ST 型別。對(duì)基因組進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，如圖1A 所示。我們將ST 型別數(shù)量≥10 的菌株標(biāo)注不同的顏色，其他型別菌株以白色顯示，同時(shí)將新ST 型菌株以黑色標(biāo)注。系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，ST8 型別的菌株所占的比例最高，為19%（111/575）；其次是ST5，占比達(dá)到13%（77/575）。在CRISPR+菌株中，最具有代表性的型別是ST398；CRISPR?菌株中，最具有代表性的型別是S T 8 。通過繪制韋恩圖來分析CRISPR+與CRISPR?菌株的關(guān)系，如圖1B 所示，CRISPR+與CRISPR?之間有11 個(gè)共同的ST 型，菌株之間具有相關(guān)性。

2.3 金葡菌耐藥基因的分析

2.3.1 金葡菌耐藥基因分布 公共數(shù)據(jù)庫基因組中，62 株CRISPR+金葡菌中陽性率最高的耐藥基因是tet（38），占比高達(dá)90%（56/62）；其次是blaZ，占比60%（37/62）。與CRISPR+菌株相比，513 株CRISPR?菌株中ant（4'）-Ib、aph（3'）-Ⅲa、aad（6） 和msr（A） 的陽性率高（P<0.05）。CRISPR?菌株耐藥基因的種類多于CRISPR+菌株（表1）。

實(shí)驗(yàn)室菌株基因組中，14 株CRISPR+金葡菌中陽性率最高的耐藥基因是b l a Z ， 占比5 7 %（8/14）。與CRISPR+菌株相比，46 株CRISPR?菌株中ant（6）-Ia、cfr、mecA 的陽性率高（P<0.05）。CRISPR+菌株的耐藥基因種類少于CRISPR?菌株（表2）。

2.3.2 金葡菌耐藥基因數(shù)目 在菌株攜帶耐藥基因的數(shù)量方面，CRISPR+菌株攜帶的耐藥基因數(shù)量更少。公共數(shù)據(jù)庫基因組CRISPR+菌株中，有58%（36/62） 的菌株攜帶耐藥基因的數(shù)量≥10 個(gè)，低于CRISPR?菌株（77%，395/513）；實(shí)驗(yàn)室菌株基因組CRISPR+菌株中，有29%（4/14） 的菌株攜帶耐藥基因的數(shù)量≥10 個(gè)，低于CRISPR?菌株（74%，34/46）（表3）。

同時(shí)，我們分別對(duì)2 組數(shù)據(jù)中CRISPR+和CRISPR?菌株攜帶耐藥基因數(shù)目進(jìn)行箱線圖繪制。公共數(shù)據(jù)庫基因組中，CRISPR+菌株整體攜帶耐藥基因數(shù)量的平均值低于CRISPR?菌株，差異極顯著（P<0.01）（圖2A）。實(shí)驗(yàn)室基因組中，CRISPR+菌株整體攜帶耐藥基因數(shù)量的平均值低于CRISPR?菌株，差異顯著（P<0.05）（圖2B）。

2.4 金葡菌毒力基因的分析

2.4.1 金葡菌毒力基因分布 由表4 可知，公共數(shù)據(jù)庫基因組中，CRISPR+金葡菌陽性率最高的毒力基因是hlgB、hlgC，占比高達(dá)100%（62/62）；其次是aur，占比98%（61/62）。與CRISPR+菌株相比， C R I S P R ?菌株中s p l A 、s p l B 的陽性率高（P<0.05）。CRISPR?菌株毒力基因的種類多于CRISPR+菌株。

實(shí)驗(yàn)室菌株基因組中，CRISPR+金葡菌陽性率最高的毒力基因是aur、hlgA、hlgB 和hlgC，占比71%（10/14）。與CRISPR+菌株相比，CRISPR?菌株中sei、sem、sen、seo 和seu 的陽性率高。CRISPR+菌株的毒力基因種類少于CRISPR?菌株（表5）。

2.4.2 金葡菌毒力基因數(shù)目 在菌株攜帶毒力基因的數(shù)量方面，CRISPR+菌株攜帶的毒力基因更少。公共數(shù)據(jù)庫基因組C R I S P R + 菌株中， 有35%（22/62） 的菌株攜帶毒力基因的數(shù)量≥10 個(gè)，低于CRISPR?菌株（73%，374/513）；實(shí)驗(yàn)室菌株基因組CRISPR+菌株中，有7%（1/14） 的菌株攜帶毒力基因的數(shù)量≥10 個(gè)，低于CRISPR?菌株（41%，19/46）（表6）。

同時(shí)，我們分別對(duì)2 組數(shù)據(jù)中CRISPR+和CRISPR?菌株攜帶毒力基因數(shù)目進(jìn)行箱線圖繪制。公共數(shù)據(jù)庫基因組中，CRISPR+菌株整體攜帶毒力基因數(shù)目的平均值低于CRISPR?菌株，差異極顯著（P<0.01）（圖3A）。實(shí)驗(yàn)室基因組中，CRISPR+菌株整體攜帶毒力基因數(shù)目的平均值低于CRISPR?菌株，差異顯著（P<0.05）（圖3B）。

2.5 原噬菌體和接合質(zhì)粒的比對(duì)分析

實(shí)驗(yàn)室60 株金葡菌基因組原噬菌體比對(duì)結(jié)果顯示，CRISPR+金葡菌中原噬菌體的攜帶率為29%（4/14），CRISPR?金葡菌中原噬菌體的攜帶率為67%（31/46）。CRISPR?菌株攜帶更多的原噬菌體序列，與CRISPR+菌株之間差異顯著（P<0.05）。接合質(zhì)粒的分析結(jié)果顯示，CRISPR+金葡菌中接合質(zhì)粒的攜帶率為86%（12/14），CRISPR?金葡菌中接合質(zhì)粒的攜帶率為8 0 % （ 3 7 / 4 6 ）。C R I S P R ?和CRISPR+菌株基本一致，無顯著差異（P>0.05）。

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

CRISPR/Cas 系統(tǒng)作為原核生物的一種適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，能抵御外來基因元件如噬菌體、質(zhì)粒的入侵，保持細(xì)菌自身遺傳結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。日本學(xué)者于1987 年首次在大腸埃希菌中發(fā)現(xiàn)該結(jié)構(gòu)[17]，Barrangou等[13] 首次用試驗(yàn)證明CRISPR/Cas 系統(tǒng)具有抵御外來噬菌體干擾的功能。本研究結(jié)果顯示，CRISPR+金葡菌菌株大多含有較少的耐藥基因和毒力基因，CRISPR 結(jié)構(gòu)能夠限制耐藥基因、毒力基因的水平轉(zhuǎn)移，使細(xì)菌的遺傳結(jié)構(gòu)保持穩(wěn)定[18]。

但是，從進(jìn)化的角度看，基因的水平轉(zhuǎn)移可以使細(xì)菌獲取新的遺傳物質(zhì)，有利于細(xì)菌在復(fù)雜的環(huán)境中生存[19-20]。本研究在對(duì)毒力基因進(jìn)行分析的過程中發(fā)現(xiàn)，極少數(shù)CRISPR+金葡菌攜帶的毒力基因數(shù)目高于CRISPR?菌株，這與Palmer 等[21] 的研究一致，說明在外源基因獲取壓力下，CRISPR/Cas 系統(tǒng)往往處于失活狀態(tài)。

細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生主要依賴于耐藥基因的水平轉(zhuǎn)移，CRISPR/Cas 系統(tǒng)是否能夠限制耐藥、毒力基因的水平轉(zhuǎn)移，不同研究有不同的報(bào)道。有研究表明，一些種類的細(xì)菌幾乎不攜帶CRISPR/Cas 系統(tǒng)[22]；同時(shí)，也有相關(guān)研究表明，宿主菌可以通過丟失CRISPR 結(jié)構(gòu)來獲得高度有益的外源DNA[23]。

Touchon 等[24] 分析了263 株大腸埃希菌的CRISPR/Cas 系統(tǒng)，對(duì)CRISPR 結(jié)構(gòu)與耐藥性的關(guān)系進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，CRISPR 結(jié)構(gòu)的存在并不能阻止耐藥基因和質(zhì)粒的水平轉(zhuǎn)移。洪麗娟等[25] 發(fā)現(xiàn)志賀菌中CRISPR 結(jié)構(gòu)對(duì)菌株耐藥基因和耐藥表型均無影響。然而，張蒙蒙等[16] 發(fā)現(xiàn)葡萄球菌基因組中CRISPR/Cas 系統(tǒng)攜帶率低，且基因座、Cas 基因的結(jié)構(gòu)和功能均不完善，僅較少的菌株中含有完整的CRISPR/Cas 系統(tǒng)，完整的葡萄球菌CRISPR/Cas 系統(tǒng)可能限制mecA 基因的水平轉(zhuǎn)移。Palmer 等[21] 發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas 系統(tǒng)的存在限制了糞腸球菌中來自可移動(dòng)元件的耐藥基因間的水平傳播。Marraffini等[15] 通過試驗(yàn)證明葡萄球菌RP62a 的CRISPR/Cas系統(tǒng)能夠抵御噬菌體的入侵。同時(shí)，Watson 等[26] 研究表明CRISPR/Cas 系統(tǒng)可以通過轉(zhuǎn)導(dǎo)增強(qiáng)基因的水平轉(zhuǎn)移。對(duì)于CRISPR 結(jié)構(gòu)與毒力基因的關(guān)系，Wiedenheft 等[27] 研究表明銅綠假單胞菌CRISPR/Cas 系統(tǒng)的存在與小鼠中某些毒力基因的表達(dá)密切相關(guān)。

3.2 結(jié)論

本研究通過對(duì)公共數(shù)據(jù)庫金葡菌基因組中CRISPR/Cas 系統(tǒng)、耐藥基因和毒力基因進(jìn)行比對(duì)分析，并利用實(shí)驗(yàn)室金葡菌基因組進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)金葡菌中CRISPR 結(jié)構(gòu)的存在可能影響金葡菌耐藥、毒力基因的水平轉(zhuǎn)移。CRISPR?菌株攜帶更多的原噬菌體序列，表明CRISPR?菌株更容易受到噬菌體和可移動(dòng)質(zhì)粒的干擾。本研究結(jié)果對(duì)進(jìn)一步研究金葡菌耐藥基因和毒力基因的傳播有參考意義。

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【責(zé)任編輯 李慶玲】