陳婷 林金輝 劉鑫銘 雷龑

DOI：10.20023/j.cnki.2095-5774.2023.05.001

收稿日期：2023-05-26

基金項(xiàng)目：福建省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2020J011362）；福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院訪學(xué)研修項(xiàng)目（2021）；福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)

項(xiàng)目（CXTD2021009-2）

作者簡(jiǎn)介：*為通訊作者，雷龑（1979-），男，副研究員，博士，主要從事果樹(shù)育種與栽培技術(shù)研究工作，E-mail：lxmy2010@163.com。

陳婷（1985-），女，助理研究員，碩士，主要從事葡萄育種與栽培技術(shù)研究工作，E-mail：tingch2022@163.com

摘要要：【目的】生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子（Growth regulatory factors，GRF）是植物特異性轉(zhuǎn)錄因子，在植物生長(zhǎng)和各種非生物脅迫調(diào)控中起關(guān)鍵作用，因此有必要對(duì)GRF基因家族開(kāi)展鑒定及表達(dá)分析，為GRF基因家族在植物響應(yīng)病原菌侵染的機(jī)制研究提供基礎(chǔ)?！痉椒ā客ㄟ^(guò)對(duì)葡萄GRF基因家族進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建、基因結(jié)構(gòu)與保守基序分析、順式作用元件預(yù)測(cè)以及基于轉(zhuǎn)錄組的炭疽病脅迫下表達(dá)模式分析。【結(jié)果】系統(tǒng)發(fā)育分析和基因結(jié)構(gòu)分析表明，所有GRF成員均包含QLQ結(jié)構(gòu)域和WRC結(jié)構(gòu)域，且大部分成員含有Rmic結(jié)構(gòu)域。GRF啟動(dòng)子中含有與生長(zhǎng)發(fā)育、脅迫和激素響應(yīng)相關(guān)的元件，暗示在各種脅迫中可能起作用。通過(guò)對(duì)GRF基因家族在炭疽病菌侵染后的表達(dá)模式分析，發(fā)現(xiàn)VvGRF4在葡萄炭疽病菌侵染的過(guò)程中響應(yīng)，表明該基因可能參與葡萄響應(yīng)炭疽病的免疫反應(yīng)?！窘Y(jié)論】該研究為GRF基因家族的進(jìn)化和表達(dá)模式的研究提供了新的思路，對(duì)未來(lái)葡萄炭疽病脅迫生物學(xué)的功能研究具有重要意義。

關(guān)鍵詞：葡萄；GRF；炭疽??；表達(dá)模式

中圖分類號(hào)：S663.1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文章編號(hào)：2095-5774（2023）05-0321-07

Identification and Expression Analysis of the GRF Gene Family in Vitis vinifera

Chen Ting，Lin Jinhui，Liu Xinming，Lei Yan*

（Fruit Research Institute，F(xiàn)ujian Academy of Agricultural Sciences，Research Center for Engineering Technology

of Fujian Deciduous Fruits，F(xiàn)uzhou，F(xiàn)ujian 350013，China）

Abstract：【Objective】Growth regulatory factors （GRF） are plant-specific transcription factors that play pivotal roles in plant growth and various abiotic stresses regulation. Its necessary to identify and analyse the GRF family，which provided a foundation of studying the response mechanism of GRF gene family to pathogen infection in plants. 【Method】We performed the phylogenetic tree analysis，gene structures and conserved motif analysis，cis-acting element prediction and transcriptome-based analysis of the expression patterns of GRF gene family responded to grape ripe rot infection. 【Result】Phylogenetic and gene structure analysis revealed that QLQ domain and WRC domain were identified in all GRF gene family members and Rmic domain was identified in most of the members. Growth and development，stress and hormone response elements were included in GRF promoters，suggesting a possible role in various stress. The expression pattern analysis of GRF gene family responded to grape ripe rot infection showed that VvGRF4 responded to grape ripe rot infection，indicating that this gene may be involved in the immune response to Grape ripe rot. 【Conclusion】This study provides new insights into evolution in the GRF gene family，together with expression patterns valuable for future functional researches of grape ripe rot stress biology.

Key words：Grape；GRF；Grape ripe rot；Expression pattern

葡萄（Vitis spp.）在世界范圍內(nèi)廣泛種植，在全球果樹(shù)構(gòu)成及產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)方面具有重要地位。然而葡萄栽培生產(chǎn)過(guò)程中的病害威脅影響著產(chǎn)業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展，如霜霉病、白腐病、灰霉病等，尤其是葡萄炭疽?。╣rape ripe rot），主要侵染葡萄果實(shí)，在轉(zhuǎn)色期至成熟期發(fā)病，給葡萄產(chǎn)量和品質(zhì)帶來(lái)巨大損失。葡萄炭疽病對(duì)我國(guó)南方夏季葡萄鮮果生產(chǎn)危害尤為嚴(yán)重，目前對(duì)其防治主要依賴大量的農(nóng)藥噴施，但也造成葡萄果實(shí)、土壤以及地下水的污染，危害人體健康，長(zhǎng)期使用農(nóng)藥還會(huì)導(dǎo)致炭疽病菌小種變異，產(chǎn)生抗藥性，引起病害的擴(kuò)大和蔓延［1，2］。阮仕立等［3］發(fā)現(xiàn)刺葡萄作為野生資源，在響應(yīng)抗炭疽病的侵染過(guò)程中具有較強(qiáng)的抗性。因此，利用中國(guó)野生葡萄抗病種質(zhì)資源，挖掘其中的抗炭疽病基因，可為開(kāi)展抗病育種提供基因資源，利于解決葡萄炭疽病問(wèn)題。

生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子（Growth regulatory factors，GRF）是一種植物特異性轉(zhuǎn)錄因子，在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起著重要作用。已確定的GRF基因家族的第一個(gè)成員是OsGRF1，它在赤霉素誘導(dǎo)的莖伸長(zhǎng)中起調(diào)節(jié)作用［4］；GRF轉(zhuǎn)錄因子在N端區(qū)域有兩個(gè)保守結(jié)構(gòu)域：QLQ （Gln、Leu和Gln）和WRC （Trp、Arg和Cys） ［5］；GRF基因通常在積極生長(zhǎng)和發(fā)育的組織中強(qiáng)烈表達(dá)，如發(fā)芽的種子、穗、芽、花蕾和幼葉［6，7］；擬南芥的AtGRF1/AtGRF2/AtGRF3三聯(lián)體突變體通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞的擴(kuò)增，促進(jìn)葉片和子葉的變小，AtGRF5與AtGRF1共同正向調(diào)節(jié)葉片原基的發(fā)育［8，9］；水稻OsGRF4通過(guò)調(diào)控細(xì)胞分裂素氧化酶/脫氫酶基因（CKX1和CKX5）的表達(dá)來(lái)增加穗長(zhǎng)［10］；木薯MeGRF4對(duì)低溫和鹽脅迫有響應(yīng)［11］；高溫脅迫下，草莓FvGRF4和FvGRF9均上調(diào)表達(dá)［12］。這些研究表明植物GRF轉(zhuǎn)錄因子在植物響應(yīng)非生物脅迫以及在生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程中扮演著重要的角色，而對(duì)于其在響應(yīng)病原菌侵染中未見(jiàn)報(bào)道。

1 材料與方法

1.1葡萄GRF基因鑒定與理化特性預(yù)測(cè)

從釀酒葡萄基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//plants.ensembl.org/hmmer/index.html）獲取葡萄的全基因組文件以及植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//planttfdb.gao-lab.org）下載GRF基因信息?；贕RF家族成員的蛋白結(jié)構(gòu)域，使用HMMER3.1軟件（http：//hmmer.org）鑒定葡萄GRF家族基因。利用ProtParam在線網(wǎng)站（https：//web.expasy.org/protparam）分析GRF基因家族成員的蛋白特性，包括相對(duì)分子量、等電點(diǎn)（PI）等。

1.2葡萄GRF蛋白保守基序分析

使用MEME 5.3.0工具（http：//meme-suite.org/tools/meme）在線分析GRF蛋白的保守基序，保守位點(diǎn)的寬度設(shè)置為10～100個(gè)氨基酸，保守基序鑒定數(shù)目設(shè)置為10個(gè)。

1.3 葡萄GRF基因家族系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建

從TAIR數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)站（https：//www.arabidopsis.org）下載擬南芥GRF基因家族蛋白序列文件。采用ClustalW對(duì)比擬南芥GRF和葡萄GRF家族蛋白的序列，將對(duì)比結(jié)果輸入MEGA7.0軟件（https：//www.megasoftware.net），采用鄰接法（neighbor-joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，bootstrap值為1 000。

1.4葡萄GRF基因家族啟動(dòng)子順式元件分析

從葡萄基因組文件中提取GRF家族基因起始密碼子上游2000 bp作為啟動(dòng)子區(qū)域，使用PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html）進(jìn)行啟動(dòng)子順式元件分析。采用TBtools軟件繪制葡萄GRF啟動(dòng)子區(qū)域不同順式作用元件的數(shù)量圖。

1.5 葡萄GRF基因表達(dá)分析

供試材料為刺葡萄，采自福建寧德福安，以成熟果粒未接種炭疽病菌為對(duì)照（CK），并以成熟果粒離體接種炭疽病菌處理的1、2、4、6 d收集果粒樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。提取接種后不同時(shí)間的果實(shí)樣本總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，連接adaptor，最后利用Illumina進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序完成后，使用RSEM軟件分析接種后不同時(shí)間的果粒樣本GRF表達(dá)量及表達(dá)差異，繪制差異基因表達(dá)熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄GRF基因鑒定與理化特性分析

利用轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//planttfdb.gao-lab.org）及HMMER3.3.2（ http：//hmmer.org）軟件共鑒定獲得8個(gè)葡萄GRF家族基因，并命名為VvGRF1L、VvGRF1-7（表1）。GRF基因編碼序列長(zhǎng)度為639～1812 bp，分子量23.32～63.70 KD，編碼213～604個(gè)氨基酸，等電點(diǎn)6.25～9.36，預(yù)測(cè)基因分別定位于第18、11、9、2、16、8、16條染色體上。

2.2 葡萄GRF的系統(tǒng)進(jìn)化分析

為探究葡萄GRF家族成員之間的發(fā)育關(guān)系，將葡萄和擬南芥的8個(gè)GRF蛋白序列進(jìn)行比對(duì)，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖1）。結(jié)果表明，這些蛋白被分為5組（I-V），擬南芥和葡萄的GRF成員在各組均有分布。其中3個(gè)葡萄GRF蛋白聚在第V組，2個(gè)聚在第Ⅳ組，其余每個(gè)組均有一個(gè)葡萄GRF蛋白。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，大部分的葡萄GRF成員與擬南芥家族同源性都較高，說(shuō)明植物的GRF在進(jìn)化上具有較高保守的結(jié)構(gòu)。

2.3 葡萄GRF基因家族保守基序分析

通過(guò)MEME在線工具，鑒定到葡萄GRF蛋白序列中出現(xiàn)10個(gè)保守基序（Motif1-10）。結(jié)果如圖2所示，除了VvGRF3不含Motif4外，其余的葡萄GRF家族成員均含有Motif1、Motif2和Motif4，說(shuō)明葡萄GRF家族的成員具有相似的基序類型。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，所有成員在N端是高度保守的，而在C端是不保守的。利用Pfam網(wǎng)站對(duì)Motif1和Motif2進(jìn)行注釋，發(fā)現(xiàn)Motif1屬于WRC結(jié)構(gòu)域，Motif2屬于QLQ結(jié)構(gòu)域。以上結(jié)果表明，C端的不保守可能導(dǎo)致了不同GRF成員間的功能分化。

2.4葡萄GRF基因啟動(dòng)子順式元件分析

使用PlantCARE網(wǎng)站分析葡萄GRF基因的啟動(dòng)子序列，鑒定到多種參與激素、脅迫響應(yīng)以及生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的順式作用元件（圖3）。其中響應(yīng)生物與非生物脅迫相關(guān)作用元件數(shù)量最多，參與激素響應(yīng)相關(guān)作用元件次之，生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)作用元件最少。不同基因含有不同類型的作用元件，如VvGRF2含有10個(gè)響應(yīng)脫落酸以及9個(gè)光響應(yīng)相關(guān)作用元件，且其順式元件最多達(dá)到52個(gè)；VvGRF4含有7個(gè)干旱脅迫以及4個(gè)響應(yīng)脫落酸等相關(guān)作用元件，并且含有多個(gè)與病原菌響應(yīng)相關(guān)的水楊酸和茉莉酸激素元件，說(shuō)明VvGRF4很可能是響應(yīng)干旱脅迫及對(duì)病原菌的免疫反應(yīng)。

2.5 葡萄GRF基因在響應(yīng)炭疽病侵染的表達(dá)模式分析

葡萄應(yīng)答炭疽菌侵染的防御反應(yīng)在很大程度上受轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)，各種轉(zhuǎn)錄因子可能在葡萄抗炭疽病中起著重要調(diào)節(jié)作用，剖析這些轉(zhuǎn)錄因子的功能和作用機(jī)制是闡明葡萄抗炭疽病分子機(jī)制的重要途徑。如圖4所示，刺葡萄在接種炭疽病菌后，VvGRF7在接種炭疽病的早期（1d）表達(dá)水平相比于CK有稍微上升但是不明顯，VvGRF4在炭疽病菌侵染后初期具有較高表達(dá)，其表達(dá)倍數(shù)是CK的近4倍（3.99）。其余GRF家族成員在炭疽病處理后表達(dá)水平均無(wú)明顯變化，這可能由于GRF轉(zhuǎn)錄因子主要功能與植物生長(zhǎng)發(fā)育有關(guān)，在響應(yīng)炭疽病病原菌侵染過(guò)程中表現(xiàn)不明顯。

3 討論

GRF家族轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)控制細(xì)胞分裂參與調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的各種生命過(guò)程［13，14］。研究表明在模式植物擬南芥、水稻、番茄中GRF基因家族成員數(shù)目分別為9個(gè)［15］、12個(gè)［16］和13個(gè)［17］。在本研究中共鑒定到8個(gè)GRF家族成員，系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析表明葡萄大部分的GRF成員與擬南芥家族同源性都較高，說(shuō)明植物的GRF在進(jìn)化上具有較高保守的結(jié)構(gòu)，為研究GRF基因家族在植物中的功能奠定基礎(chǔ)，并為今后GRF基因家族的比較和功能基因組研究提供生物信息學(xué)信息和功能參考。

已有研究報(bào)道GRF蛋白具有兩個(gè)保守基序：QLQ和WRC［4，13］。本研究在葡萄GRF所有成員的C端均含有QLQ結(jié)構(gòu)域和WRC結(jié)構(gòu)域，以及大部分成員的N端含有Rmic結(jié)構(gòu)域，即QLQ參與蛋白-蛋白相互作用，WRC可調(diào)控DNA結(jié)合C端的轉(zhuǎn)錄，這些結(jié)果表明葡萄GRF蛋白在植物中具有進(jìn)化保守性。

GRF是植物生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)鍵調(diào)控因子［18，19］，并應(yīng)答非生物脅迫逆境，而對(duì)于其在響應(yīng)病原菌的防御反應(yīng)中鮮有報(bào)道。順式作用元件參與基因表達(dá)的調(diào)控，與基因功能密切相關(guān)。通過(guò)對(duì)葡萄GRF順式作用元件分析表明，GRF成員可以在干旱、病原菌等不同脅迫下轉(zhuǎn)錄表達(dá)，并受水楊酸、脫落酸以及茉莉酸或其衍生物刺激信號(hào)調(diào)控。本研究表明，GRF基因家族在葡萄接種炭疽菌后幾乎不表達(dá)，僅有VvGRF4在病原菌處理中期受誘導(dǎo)表達(dá)，表明植株受到病原菌脅迫時(shí)，可能通過(guò)VvGRF4的表達(dá)以激活下游防御相關(guān)基因或者其他與激素相關(guān)或病原菌防御相關(guān)基因（比如說(shuō)R基因等）的表達(dá)，使植株在炭疽病脅迫環(huán)境下獲取更多能量以維持生存和生長(zhǎng)，但具體調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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（責(zé)任編輯：黃雄峰）