習(xí)必鑫 胡 群 劉愛(ài)國(guó)

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院兒童血液科（湖北武漢 430030）

范可尼貧血（Fanconi anemia，F(xiàn)A）是一種罕見(jiàn)的常染色體隱性遺傳或X連鎖遺傳的骨髓衰竭（bone marrow failure，BMF）綜合征，與DNA 損傷修復(fù)缺陷和染色體不穩(wěn)定密切相關(guān)，在人群中的發(fā)病率為（1～5）/100 萬(wàn)，新生兒患病率約為（0.5～2.5）/10萬(wàn)，全球范可尼貧血基因的攜帶頻率約為1/300[1]。兒童范可尼貧血的臨床特征包括進(jìn)行性骨髓衰竭、先天性軀體異常、對(duì)DNA 交聯(lián)劑高度敏感和易發(fā)展為惡性腫瘤[2]。進(jìn)行性骨髓衰竭是FA 的主要特征，多見(jiàn)于5～10歲的患兒，且血小板減少或白細(xì)胞減少通常早于貧血癥狀的出現(xiàn)。15 歲的FA 患者中有80%會(huì)出現(xiàn)進(jìn)行性造血功能衰竭，而年齡≥40歲的FA患者發(fā)生骨髓衰竭的風(fēng)險(xiǎn)超過(guò)90 %[1-2]。先天性軀體異?？梢?jiàn)于60 %～70 %的范可尼貧血患兒，其中骨骼異常（髖部、脊柱側(cè)凸、肋骨異常）、小眼癥、皮膚色素沉著（咖啡斑）、性腺功能減退、身材矮小或生長(zhǎng)發(fā)育遲緩、生育能力低下和腎臟異常等出現(xiàn)頻率較高[1]。FA 還具有惡性腫瘤易感性[1-2]，比如FANCD1或FANCN突變的FA患兒可能在5歲之前就死于急性髓系白血病或者骨髓異常增生綜合征或者其他兒童實(shí)體腫瘤。年齡在5～15歲的FA患兒容易發(fā)展為急性髓系白血病，其發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)約是普通患兒的800 倍；而年齡＞15 歲的FA 患兒發(fā)生頭頸部/食管鱗狀細(xì)胞癌、肝癌或者婦科惡性腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)更高。

兒童FA 的治療主要包括異基因造血干細(xì)胞移植、口服雄激素、粒細(xì)胞集落刺激因子注射、輸注血制品等，其中異基因造血干細(xì)胞移植是目前唯一可以治愈范可尼貧血的治療方式，但是移植相關(guān)的并發(fā)癥，比如移植物抗宿主病、病毒感染、繼發(fā)惡性腫瘤等，仍然嚴(yán)重影響著患者的生活質(zhì)量和遠(yuǎn)期預(yù)后[2]。近些年來(lái)，隨著基因治療技術(shù)的不斷發(fā)展與完善，越來(lái)越多的研究證實(shí)它不僅可以改善FA患兒的血液學(xué)異常，還可以克服異基因造血干細(xì)胞移植治療的諸多局限。本文通過(guò)FA基因治療的相關(guān)文獻(xiàn)及臨床研究進(jìn)行回顧，分析總結(jié)近30 年兒童FA 基因治療的研究歷程與進(jìn)展。

1 FA基因治療的概述

1.1 基因治療的定義

基因治療是通過(guò)載體或非載體途徑對(duì)患者體內(nèi)異常的遺傳物質(zhì)（DNA 或RNA）進(jìn)行修改或補(bǔ)償，實(shí)現(xiàn)矯正基因的持久表達(dá)，從而達(dá)到改善或治愈疾病的目的[3]。與傳統(tǒng)的治療方式相比，基因治療具有靶向性好、毒副作用小、治療更徹底、住院時(shí)間短等優(yōu)勢(shì)，是一種應(yīng)用前景廣闊的新型治療策略[3]。

1.2 FA的分子學(xué)特征

FA是由FANC基因突變所引發(fā)的單基因缺陷類疾病。到目前為止，研究人員已經(jīng)鑒定了22種FANC基因[4]，包括FANCA,FANCB,FANCC,FANCD 1/BRCA2,FANCD2,FANCE,FANCF,FANCG/XRCC9,FANCI,FANCJ/BRIP 1,FANCL,FANCM,FANCN/PALB 2,FANCO/RAD 51 C,FANCP/SLX 4,FANCQ/ERCC 4,FANCR/RAD 51,FANCS/BRCA 1,FANCT/UBE 2 T,FANCU/XRCC 2,FANCV/REV 7,FANCW/RFWD 3，其中任何一種常染色體隱性遺傳的純合突變或者X 連鎖遺傳的FANCB突變或者顯性遺傳的FANCR/RAD51突變均可引起FA的發(fā)生。在這些FANC基因中，突變頻率最高的是FANCA、FANCC、FANCG/XRCC 9三種，約60 %的FA 為FANCA突變所引起[1]。這22 種FANC基因編碼的蛋白在FA/BRCA通路中協(xié)同負(fù)責(zé)DNA 鏈間交聯(lián)（interstrand cross-links，ICLs）的修復(fù)，而FANC基因突變則會(huì)導(dǎo)致DNA 損傷修復(fù)的缺陷及對(duì)二環(huán)氧丁烷、絲裂霉素C等DNA鏈間交聯(lián)劑高度敏感，這是范可尼貧血最重要的分子學(xué)特征[1]。因此，通過(guò)基因治療矯正FANC基因突變來(lái)治療范可尼貧血的策略或許是未來(lái)可以替代異基因造血干細(xì)胞移植的一種新型低毒性治療方式。

2 FA基因治療的早期嘗試

2.1 第一階段臨床研究

1992—2007 年的16 年間（表1），通過(guò)攜帶正常FANC基因的γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體對(duì)FA 患者的造血干細(xì)胞進(jìn)行體外基因轉(zhuǎn)導(dǎo)后再體內(nèi)回輸?shù)呐R床試驗(yàn)共3 項(xiàng)。1999 年Liu 等[5]發(fā)表的研究結(jié)果顯示，4 例接受正常FANCC基因治療的患者中，其中3 例（11～14 歲的兒童）外周血和骨髓中FANCC功能正常的細(xì)胞數(shù)量和對(duì)鏈間交聯(lián)劑的耐藥性均表現(xiàn)出短暫的增加，但是并未觀察到造血干細(xì)胞基因缺陷的長(zhǎng)期矯正效應(yīng)。第4 例患者在輸注一次轉(zhuǎn)基因造血干細(xì)胞后+50 d，被診斷為外陰鱗狀細(xì)胞癌。2000 年6 月5 日至2005 年6 月24 日期間在美國(guó)明尼蘇達(dá)大學(xué)進(jìn)行了γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)正常FANCC基因體外轉(zhuǎn)導(dǎo)外周血自體造血干細(xì)胞后治療FA 的臨床試驗(yàn)[6]，目前暫未公布相關(guān)研究結(jié)果。2007年Kelly等[7]發(fā)表的研究結(jié)果顯示，7例FANCA基因型受試者（0.92～15.25 歲）中，只有2 例患兒（FAGT 1001 是0.92 歲，F(xiàn)AGT 1003 是4.5 歲）在輸注了經(jīng)過(guò)體外基因矯正的造血干細(xì)胞后表現(xiàn)出了血紅蛋白含量和血小板計(jì)數(shù)的短暫升高，且未發(fā)生基因治療相關(guān)的嚴(yán)重不良事件；而另外5 例受試者即使在足量粒細(xì)胞集落刺激因子動(dòng)員后也未能采集到足量數(shù)量的CD 34+細(xì)胞。這幾項(xiàng)研究均表明，攜帶正常FANC基因的γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體體外轉(zhuǎn)導(dǎo)造血干細(xì)胞后體內(nèi)回輸雖然可以短暫改善FA 患者的造血功能，但是均未能顯示出任何長(zhǎng)期的臨床療效。

表1 范可尼貧血基因治療的第一階段臨床研究

2.2 γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)基因治療的局限

然而，2004 年Gaspar 等[8]研究人員采用γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒體外轉(zhuǎn)導(dǎo)造血干細(xì)胞的策略對(duì)4例X連鎖重癥聯(lián)合免疫缺陷病患兒進(jìn)行基因治療，治療后所有患兒的臨床和免疫學(xué)特征均明顯改善，而且細(xì)胞免疫和體液免疫也得到了較好恢復(fù)。那么，同樣是采用γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體體外轉(zhuǎn)導(dǎo)造血干細(xì)胞的治療策略，為什么對(duì)FA患者的基因治療最終均失??？可能的原因包括以下4 個(gè)方面[9]：①FANC基因缺陷會(huì)導(dǎo)致所有造血干/祖細(xì)胞的染色體不穩(wěn)定，易凋亡，可以采集的CD 34+數(shù)量非常少。②范可尼貧血患者的造血干細(xì)胞在體外培養(yǎng)的過(guò)程中，多種因素會(huì)導(dǎo)致有限的CD34+細(xì)胞迅速凋亡，比如干擾素γ、腫瘤壞死因子α、白細(xì)胞介素-1B、活性氧及體外培養(yǎng)時(shí)間＞24小時(shí)等，而其他單基因缺陷病的造血干細(xì)胞體外培養(yǎng)條件則與之明顯不同。③逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)效率低下，且僅能轉(zhuǎn)導(dǎo)處于分裂期的造血干細(xì)胞，而不能轉(zhuǎn)導(dǎo)處于靜止期的造血干細(xì)胞。④FA患者的骨髓造血微環(huán)境功能缺陷，也會(huì)導(dǎo)致造血干細(xì)胞的再植入困難。

3 FA基因治療的研究現(xiàn)狀

3.1 第二階段臨床研究

從2008年至2021年的近14年間，全球一共有7項(xiàng)一期/二期臨床試驗(yàn)運(yùn)用慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)FANCA基因來(lái)治療FA 患者（表2），其中2 項(xiàng)臨床試驗(yàn)已經(jīng)發(fā)表了相關(guān)研究成果，而另外5 項(xiàng)研究仍在招募FANCA基因型受試者，暫未發(fā)表相關(guān)研究成果。2018年Adair等[10]發(fā)表的研究結(jié)果證實(shí)，只有高表達(dá)CD 34+的造血干細(xì)胞才具有體外增殖和體內(nèi)造血重建的能力；體外清除CD 3+、CD 14+、CD 16+、C D 1 9+的造血干細(xì)胞，不僅可以純化≥6 0 %原始CD 34+細(xì)胞，還不影響體外慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)FANNA基因和異種體內(nèi)植入的效率。2019 年Río等[4]研究人員使用粒細(xì)胞集落刺激因子和普樂(lè)沙福對(duì)FANCA基因型受試者進(jìn)行造血干細(xì)胞動(dòng)員，獲取了足量的CD34+細(xì)胞；然后運(yùn)用攜帶PGK-FANCAWPRE 調(diào)控元件的慢病毒載體在短時(shí)、低氧等條件下體外轉(zhuǎn)導(dǎo)自體造血干細(xì)胞；最后在沒(méi)有進(jìn)行預(yù)處理化療的情況下，將這些造血干細(xì)胞再回輸給FA受試者（4例患兒年齡：3～8歲）。其研究結(jié)果證實(shí)，慢病毒介導(dǎo)的造血干細(xì)胞基因治療不僅可以成功糾正FA患者外周血和骨髓細(xì)胞的特征性表型，還能持續(xù)改善造血干細(xì)胞的體內(nèi)再植入和增殖能力。此外，該研究的FANCA基因插入位點(diǎn)的分析還顯示慢病毒介導(dǎo)的FA基因治療不存在FANCA插入基因相關(guān)的遺傳毒性。

表2 范可尼貧血基因治療的第二階段臨床研究

回顧兒童FA 基因治療的整個(gè)研究歷程[11]，我們發(fā)現(xiàn)在第一階段臨床研究中，有2 項(xiàng)臨床試驗(yàn)的研究對(duì)象均為FANCC基因突變型患者，治療后均未顯示出長(zhǎng)期的臨床益處；而在第二階段臨床研究中，7 項(xiàng)臨床試驗(yàn)的研究對(duì)象均為FANCA基因突變型患者，且其中一項(xiàng)試驗(yàn)已獲得成功。那么，F(xiàn)ANC突變的基因型是否會(huì)影響逆轉(zhuǎn)錄病毒或者慢病毒介導(dǎo)基因治療的效果，目前尚不清楚。Shakeel等[12]發(fā)表的研究結(jié)果顯示，F(xiàn)ANCA蛋白處于范可尼貧血核心蛋白復(fù)合體的外圍，而FANCC蛋白則位于核心蛋白復(fù)合體的內(nèi)部，更靠近DNA復(fù)制叉，F(xiàn)ANCA突變比FANCC突變導(dǎo)致FA核心蛋白復(fù)合體形成受阻的概率小很多。因此，這也可能導(dǎo)致基因治療矯正FANCC突變的成功率比FANCA突變低。

3.2 慢病毒介導(dǎo)基因治療的發(fā)展與困境

現(xiàn)階段范可尼貧血基因治療的最重要技術(shù)進(jìn)步包含以下3 個(gè)方面：①攜帶有自我滅活序列和調(diào)控正常FANC基因表達(dá)元件的人類免疫缺陷病毒-1（HIV-1）慢病毒載體不僅可以轉(zhuǎn)導(dǎo)處于分裂期的造血干細(xì)胞，還可以轉(zhuǎn)導(dǎo)處于靜止期的造血干細(xì)胞，且轉(zhuǎn)導(dǎo)效率顯著提高[9]。②造血干細(xì)胞體外培養(yǎng)條件的改進(jìn)[9]，比如體外培養(yǎng)時(shí)間＜24 小時(shí)，培養(yǎng)基中加入抗腫瘤壞死因子α 抗體、抗干擾素γ 抗體、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β 抑制劑、抗氧化劑，低氧（氧濃度＜5%）等可以明顯降低體外范可尼貧血基因缺陷細(xì)胞的凋亡。③粒細(xì)胞集落刺激因子和普樂(lè)沙福的應(yīng)用[13]，有效增加了可采集的CD34+細(xì)胞數(shù)量。盡管目前運(yùn)用慢病毒載體體外糾正FANC基因缺陷的技術(shù)日臻完善，但是體外矯正基因缺陷仍始終面臨著轉(zhuǎn)導(dǎo)效率低、造血干細(xì)胞凋亡增加及體內(nèi)再植入困難等難題。因此，設(shè)計(jì)更完善的載體結(jié)合更高效的體內(nèi)靶向轉(zhuǎn)導(dǎo)策略將有助于徹底解決這些難題，也將為FA基因治療開辟更廣闊的前景。

4 FA基因治療的展望

自2016年以來(lái)，歐洲和美國(guó)藥品管理局先后批準(zhǔn)了6種用于基因治療的產(chǎn)品[3]，其中2種是治療B系淋巴細(xì)胞白血病的嵌合抗原受體T細(xì)胞（chimeric antigen receptor T cells，CAR-T）免疫治療產(chǎn)品；另外4 種產(chǎn)品則用于治療單基因缺陷引發(fā)的疾病，包括輸血依賴型β-地中海貧血、脊髓性肌萎縮癥、遺傳性視網(wǎng)膜營(yíng)養(yǎng)不良和重癥聯(lián)合免疫缺陷癥。目前，CAR-T治療在國(guó)內(nèi)發(fā)展迅速，已被廣泛用于治療兒童難治復(fù)發(fā)的B 系急性淋巴細(xì)胞白血病、非霍奇金淋巴瘤等惡性腫瘤性疾病，顯著改善了患兒的預(yù)后。此外，全球尚有800多種基因治療處于I期/II期臨床試驗(yàn)階段[3]，治療范圍涵蓋了多種以前無(wú)法治愈的疾病，比如杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥、亨廷頓氏病、血友病、FA等。

目前，F(xiàn)A基因治療的臨床研究仍處于體外矯正基因缺陷的階段，雖然部分臨床試驗(yàn)已經(jīng)獲得了成功，但是體外矯正缺陷基因的策略始終面臨著轉(zhuǎn)導(dǎo)效率低、造血干細(xì)胞凋亡率高及體內(nèi)再植入困難等難題。因此，F(xiàn)A基因治療的第三階段臨床研究主要集中于將攜帶正常FANC基因的高選擇性的慢病毒載體直接注射到動(dòng)物模型體內(nèi)進(jìn)行基因治療[6]，且已經(jīng)取得了部分進(jìn)展，該基因治療策略完善后將逐步過(guò)渡到范可尼貧血體內(nèi)矯正基因缺陷的階段。未來(lái)通過(guò)CRISPR/Cas 9 技術(shù)與攜帶有SCF-RD 114 包膜的非整合型SIN-LV 載體的結(jié)合來(lái)進(jìn)行體內(nèi)基因矯正或許能成為第四階段范可尼貧血基因治療的理想策略[14]見(jiàn)表3。

表3 范可尼貧血基因治療的臨床研究

綜上所述，基因治療是一種未來(lái)可以替代異基因造血干細(xì)胞移植治療FA 的新型低毒性治療方式，但是目前仍然面臨著諸多安全風(fēng)險(xiǎn)[15]和倫理風(fēng)險(xiǎn)。其中基因治療的安全性問(wèn)題主要來(lái)自機(jī)體對(duì)病毒載體或遞送的遺傳物質(zhì)的免疫反應(yīng)及插入基因異常整合引發(fā)新腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)。而基因治療的倫理學(xué)問(wèn)題則主要體現(xiàn)在基因信息的隱私侵犯、基因歧視及基因武器化等風(fēng)險(xiǎn)，其中基因武器威脅人類和平，甚至可能引發(fā)災(zāi)難。因此，基因治療任重而道遠(yuǎn)，仍需要我們共同努力來(lái)解決其面臨的各種挑戰(zhàn)和爭(zhēng)議。