蘇文悅 李 鑫 褚雄燕 包 才 何旻霞 黃澤軍 國艷梅 王孝宣 杜永臣 劉 磊李君明*

（1中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，蔬菜生物育種全國重點實驗室，北京 100081；2新疆康美瑞農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司，新疆昌吉 831502）

我國鹽漬土總面積占可利用土地的4.88%，6.62%的耕地出現(xiàn)鹽漬化問題（楊勁松，2008）。土壤鹽堿化和次生鹽堿化限制作物生長，降低土地利用率，已成為我國農(nóng)業(yè)發(fā)展的重要障礙。同時，淡水資源的逐年減少，也迫使作物耐鹽堿遺傳改良愈加重要（陳皓煒 等，2021；劉東讓 等，2021）。

植物耐鹽能力具有階段特異性，即不同發(fā)育階段的耐鹽性無顯著關(guān)聯(lián)（Foolad &Chen，1999），植物芽期和苗期對鹽脅迫更為敏感（代明龍 等，2015）。目前絕大多數(shù)耐鹽堿研究集中在植物苗期或成株期，如已在擬南芥、水稻、番茄等模式植物中定位到許多調(diào)控植株苗期響應(yīng)鹽脅迫和調(diào)控植株耐鹽性的轉(zhuǎn)錄因子（Lu et al.，2011；Neily et al.，2011；Xie et al.，2011；Yang et al.，2019；Wang et al.，2020）。研究還發(fā)現(xiàn)，相同的基因參與了番茄種子在低溫、鹽脅迫、干旱脅迫下萌發(fā)率的加性效應(yīng)，在脅迫條件下選擇發(fā)芽率高的材料能夠更顯著地提高非脅迫條件下的發(fā)芽率（Foolad et al.，2003a），因此芽期耐鹽性研究不僅具有實際應(yīng)用價值，而且能為深入揭示作物的耐鹽機制提供必要的科學(xué)依據(jù)。

大多數(shù)栽培種番茄在生長發(fā)育階段對鹽脅迫具有中等耐性（Foolad，2004），而野生種則表現(xiàn)更好的耐鹽性，是番茄作物耐鹽遺傳改良的寶貴資源（Jones，1986）。在鹽、低溫等非生物脅迫條件下，番茄野生資源種子快速萌發(fā)的能力主要由多基因控制，表現(xiàn)為加性遺傳效應(yīng)（Foolad &Jones，1991），目前已在潘那利番茄（Solanum pennellii）LA0716、醋栗番茄（S.pimpinellifolium）LA0722等野生資源中定位了耐鹽QTL（Foolad et al.，1998；Foolad et al.，2007），但相關(guān)研究僅集中在有限的遺傳資源，對野生資源的廣泛挖掘十分有限。

野生醋栗番茄資源廣泛分布于南美不同區(qū)域，具有豐富的遺傳多樣性，表現(xiàn)較好的耐鹽能力，與栽培種可以直接雜交轉(zhuǎn)育。中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所番茄遺傳育種課題組收集了來自全球的600 余份野生醋栗番茄遺傳資源，對每份資源進行了多代嚴格自交純化，并基于全基因組數(shù)據(jù)信息，分析了該遺傳群體，構(gòu)建了41 份醋栗番茄核心種質(zhì)。通過對其芽期耐鹽性進行評價，以期深入了解醋栗番茄資源耐鹽的遺傳多樣性，為番茄耐鹽遺傳改良提供信息。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2020 年9 月至2021 年1 月在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所組培室中進行。試驗材料包括41 份野生醋栗番茄核心種質(zhì)，分別來自美國番茄遺傳資源中心（TGRC）、亞洲蔬菜研究中心（AVRDC）和荷蘭遺傳資源中心（NL CGN）（表1）。對照為栽培種番茄Moneymaker（核心種質(zhì)編號MM）和M82，來自TGRC。

表1 41 份醋栗番茄核心種質(zhì)信息

1.2 試驗方法

1.2.1 種子滅菌 參照Foolad 等（2003b）的滅菌方法，用0.5% NaClO 溶液浸泡種子，表面滅菌10 min 后，用無菌水沖洗3 次，去除種子表面殘留的NaClO，之后用無菌濾紙擦拭滅菌后的種子，吸干種子表面水分，以上全部操作在超凈工作臺進行。

1.2.2 種子催芽 采用紙床發(fā)芽法（劉冰 等，2010），在直徑90 mm 塑料培養(yǎng)皿中墊入兩張無菌濾紙制備雙層濾紙培養(yǎng)基，每個鹽處理加入5 mL 150 mmol·L-1NaCl 溶液；每個非鹽脅迫處理加入5 mL 無菌水。種子用10%商業(yè)漂白劑溶液表面消毒10 min，然后用無菌蒸餾水沖洗。每份材料取50 粒種子放置于雙層濾紙培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿為1 個重復(fù)，每處理共設(shè)3 次重復(fù)。將培養(yǎng)皿放置于（25 ± 1）℃恒溫黑暗條件下對種子進行催芽，催芽周期為14 d（葉鑫 等，2021）。

以胚芽萌發(fā)長度達到種子長度1/2 為發(fā)芽標準（范翠枝 等，2021），每隔12 h 記錄種子發(fā)芽粒數(shù)，連續(xù)觀測14 d，統(tǒng)計相對發(fā)芽率?？紤]到參試種子中存在無活力種子，以非鹽脅迫下種子發(fā)芽粒數(shù)作為參試種子數(shù)，計算不同種質(zhì)的相對發(fā)芽率。以番茄栽培種Moneymaker、M82 為對照，分析醋栗番茄各種質(zhì)間相對發(fā)芽率、耐鹽性的差異。

1.2.3 進化樹分析 課題組前期已對41 份醋栗番茄核心種質(zhì)進行了全基因組重測序（由貝瑞和康生物技術(shù)有限公司于2019 年完成），平均測序深度為10 ×。2 份栽培種番茄重測序數(shù)據(jù)為已發(fā)表的公共數(shù)據(jù)（Zhu et al.，2018）。挑選均勻分布于全基因組上的10 000 個高質(zhì)量SNPs 進行聚類分析，構(gòu)建進化樹。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Microsoft Excel 2016 軟件整理試驗數(shù)據(jù)，利用SAS 9.4 軟件對相對發(fā)芽率進行方差分析；利用FastTree 軟件構(gòu)建進化樹，并用iTOL 軟件對進化樹進行美化。

2 結(jié)果與分析

2.1 醋栗番茄核心種質(zhì)芽期耐鹽性鑒定

2.1.1 醋栗番茄核心種質(zhì)發(fā)芽結(jié)果 在無菌水非鹽脅迫條件下，栽培番茄（Moneymaker、M82）和醋栗番茄野生種質(zhì)普遍于24～48 h 內(nèi)開始萌發(fā)，132 h 內(nèi)基本完全萌發(fā)（圖1）。而在150 mmol ·L-1NaCl 脅迫條件下，栽培番茄Moneymaker 和M82 分別于192 h 和132 h 開始萌發(fā)；醋栗番茄在48～132 h 內(nèi)開始萌發(fā)，一直到300 h 仍有種子萌發(fā)（圖2）。由此可以明顯看出，在鹽脅迫下栽培番茄和醋栗番茄的萌發(fā)均明顯推遲，萌發(fā)整齊度明顯下降，且栽培番茄Moneymaker 的萌發(fā)速度明顯較醋栗番茄更慢。N5、N7、N23、N27、N31、N34、N35、N38、N39、N41 等10 份材料在鹽脅迫下5 d 內(nèi)種子發(fā)芽粒數(shù)較多，且萌發(fā)整齊度高。其中N27、N34、N35、N38、N39 等5 份種質(zhì)在第5 天的相對發(fā)芽率達到45%以上，特別是N35、N39 種質(zhì)在150 mmol·L-1NaCl 鹽脅迫下仍能在60 h 內(nèi)開始萌發(fā)，并分別于228 h 和108 h 相對發(fā)芽率達到97%，萌發(fā)時間明顯早于其他材料，具有優(yōu)異的芽期耐鹽性狀。

圖1 非鹽脅迫條件下醋栗番茄核心種質(zhì)發(fā)芽情況

圖2 鹽脅迫條件下醋栗番茄核心種質(zhì)發(fā)芽情況

2.1.2 醋栗番茄核心種質(zhì)相對發(fā)芽率及芽期耐鹽性鑒定結(jié)果 對兩個栽培種Moneymaker、M82 和41份野生醋栗番茄核心種質(zhì)進行芽期耐鹽性比較，發(fā)現(xiàn)Moneymaker 和M82 在150 mmol·L-1NaCl 脅迫下的相對發(fā)芽率分別為28.67%和38.67%，無顯著差異（表2）。以栽培種Moneymaker 和M82 作為判斷醋栗番茄耐鹽性的標準，對41 份醋栗番茄核心種質(zhì)芽期耐鹽性進行評價：耐鹽（T），相對發(fā)芽率顯著高于兩個栽培種番茄；中等耐鹽（M），相對發(fā)芽率和栽培種Moneymaker 或M82 無顯著差異；鹽敏感（S），相對發(fā)芽率顯著低于兩個栽培種番茄。

表2 醋栗番茄核心種質(zhì)相對發(fā)芽率及芽期耐鹽性鑒定結(jié)果

由表2 可知，在150 mmol·L-1NaCl 脅迫下，醋栗番茄N10、N12、N13、N21、N25、N30、N36、N37 與栽培種番茄Moneymaker 或M82 的相對發(fā)芽率不存在顯著差異，為中等耐鹽種質(zhì)；N5、N7、N15、N23、N26、N27、N31、N32、N34、N35、N38、N39、N41 等13 份醋栗番茄的相對發(fā)芽率顯著高于Moneymaker 和M82，耐鹽性相對較強，為耐鹽種質(zhì)；N1、N2、N3、N4、N6、N8、N9、N11、N14、N16、N17、N18、N19、N20、N22、N24、N28、N29、N33、N40 等20 份醋栗番茄的相對發(fā)芽率顯著低于Moneymaker 和M82，耐鹽性相對較弱，為鹽敏感種質(zhì)。并且，在耐鹽種質(zhì)中，N23、N27、N34、N35、N38、N39、N41 等7份醋栗番茄材料第14 天的相對發(fā)芽率大于85%，符合GB 16715.3—2010 規(guī)定的番茄種子質(zhì)量最低要求。其中，N27、N34、N35、N38、N39、N41 等6 份材料相對發(fā)芽率顯著高于其他參試材料，在150 mmol·L-1NaCl 脅迫第14 天時，相對發(fā)芽率高達95%以上。

2.2 醋栗番茄核心種質(zhì)進化樹分析

由圖3 可知，43 份參試材料可分為3 個大類，第一大類（紅色）共14 份材料，均為醋栗番茄，其中4 份（N15、N26、N34、N35）為耐鹽材料，4 份（N16、N18、N19、N20）為鹽敏感材料；第二大類（綠色）共7 份材料，均為醋栗番茄，其中1 份（N7）為耐鹽材料，4 份（N14、N17、N22、N24）為鹽敏感材料；第三大類（藍色）共22 份材料，包括醋栗番茄和栽培番茄，其中8 份（N5、N23、N27、N31、N32、N38、N39、N41）為耐鹽材料，11 份（N1、N2、N3、N4、N6、N9、N11、N28、N29、N33、N40）為鹽敏感材料。

圖3 醋栗番茄核心種質(zhì)進化樹分析結(jié)果

3 討論與結(jié)論

在鹽脅迫下，雖然醋栗番茄種子的開始萌發(fā)時間和相對發(fā)芽率等發(fā)芽指標均較非鹽脅迫環(huán)境表現(xiàn)出明顯的下降趨勢，但部分野生醋栗番茄材料仍明顯優(yōu)于栽培種。通過篩選發(fā)現(xiàn)有6 份材料（N27、N34、N35、N38、N39、N41）耐鹽性較好，平均開始萌發(fā)時間為76 h，較栽培種（162 h）提前了86 h；相對發(fā)芽率可達95%以上，平均相對發(fā)芽率（96.89%）較栽培種（33.67%）提高了63.22 百分點。同時還發(fā)現(xiàn)不同醋栗番茄種質(zhì)的耐鹽性也存在較大差異，遺傳多樣性豐富，20 份材料表現(xiàn)芽期鹽敏感，萌發(fā)開始時間與栽培種相近，相對發(fā)芽率低于10%，較栽培種平均降低了32.34 百分點，其中14 份材料在鹽脅迫下不萌發(fā)。通過利用重測序數(shù)據(jù)進化樹分析，將41 份野生醋栗番茄資源分為三大類，結(jié)果與Rao 等（2012）的研究一致，而耐鹽材料卻分布在不同類群，推測耐鹽性狀受有限的數(shù)量性狀位點控制，而且這些位點可能也不相同。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)N41 和N11 種質(zhì)遺傳距離極小，基因組極其相似，但分別表現(xiàn)出明顯的耐鹽和鹽敏感，有利于借助基因組數(shù)據(jù)進行耐鹽基因的挖掘。

雖然目前番茄均已采用育苗移栽，其芽期受到鹽脅迫的概率大大降低，但在淡水資源日益缺乏的現(xiàn)狀下，篩選芽期耐鹽遺傳種質(zhì)，為將來較好地利用海水資源提供了良好的技術(shù)支撐。Foolad 等（2003a）發(fā)現(xiàn)，在逆境下選擇發(fā)芽率高的材料可以顯著提高其在正常栽培條件下的發(fā)芽率，芽期耐鹽遺傳種質(zhì)無疑會為提高番茄商品種的發(fā)芽率和出苗整齊度奠定一定的遺傳基礎(chǔ)；另外，目前對于作物耐鹽性的階段性機制尚不明確，芽期耐鹽資源也為深入了解作物耐鹽調(diào)控機制提供了必要的材料。