白 雪，董巧云，趙 麗，姚 彥，王 博（滄州市中心醫(yī)院神經內五科，河北滄州 061000）

帕金森病（Parkinson's disease，PD）是一種神經系統(tǒng)變性疾病，全球發(fā)病率0.3%左右[1]，臨床主要表現(xiàn)為靜止性震顫、運動遲緩、肌強直、姿勢步態(tài)異常等癥狀。PD 發(fā)病原因是中腦內黑質多巴胺能神經元變性或死亡伴路易體（lewy bodies，LB）出現(xiàn)，從而阻礙黑質紋狀體通路[2]，而LB 主要成分是α-突觸核蛋白（α-synuclein，α-Syn）。

α-Syn 是一種主要存在于突觸前末端的酸性蛋白，其單體在游離狀態(tài)下是未折疊結構，與生物膜結合時變?yōu)棣?螺旋結構，當其表達增強或變異時，可轉變?yōu)槔w維樣的β-折疊結構，形成寡聚體和多聚體[3]。大量研究發(fā)現(xiàn)PD 患者腦組織中存在大量失調的微小核糖核酸（microRNA，miRNA），其通過結合目標mRNA 的3’-非翻譯區(qū)，導致靶mRNA不穩(wěn)定或被切割從而干擾翻譯，是細胞增殖分化重要轉錄后調節(jié)因子。有研究表明miR-7 在PD 患者黑質多巴胺能神經元中廣泛表達[4]，與PD 的發(fā)生、發(fā)展亦有密切聯(lián)系。隨著對PD 研究的不斷進展和深入，越來越多的學者發(fā)現(xiàn)除了其經典的運動癥狀外，認知功能等非運動癥狀也為其重要的臨床表現(xiàn)。

認知障礙在早期PD 患者中較為常見，本研究通過檢測PD 患者血清中miR-7 和α-Syn 表達水平，探究兩者與PD 患者認知功能障礙的關系。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選取2020 年1 月～2022 年1 月滄州市中心醫(yī)院收治的PD 患者106 例作為PD 組，其中男性45 例，女性61 例，年齡64.75±3.46 歲；文化程度：初中及以下18 例，高中及以上88 例。本組患者均符合中國帕金森病治療指南(第三版)[5]相關標準。Hoehn-Yahr 分級：1 級12 例，2 級20 例，2.5 級24 例，3 級10 例，4 級30 例，5 級10 例。隨機選擇同期性別、年齡相匹配的106 例健康體檢者作為對照組，其中男性50 例，女性56 例，年齡65.20±4.47 歲；文化程度：初中及以下24 例，高中及以上82 例。兩組受試者年齡、性別及文化程度差異無統(tǒng)計學意義（χ2/t=0.477，0.820，1.069，P=0.490，0.413，0.301）。PD 組納入標準：①本研究所有PD 患者均符合相關診斷標準，均伴有運動遲緩、姿勢步態(tài)障礙、靜止性震顫等癥狀；②依從性好；③未進行過抗抑郁或抗精神病治療。對照組納入標準：①本組受試者經體檢正常者，無PD家族史；②生活習慣以及飲食結構與PD 組患者相似。排除標準：①并發(fā)顱內器質性疾病者；②由內科疾病或藥物導致的認知功能障礙者；③并發(fā)有慢性炎性反應或各種感染者；④繼發(fā)性帕金森綜合征；⑤無法配合研究者；⑥嚴重肝、腎、心功能不全者。本研究經本院倫理委員會批準，且所有受試者或其家屬均簽署參加本研究的知情同意書。

1.2 儀器與試劑 紫外分光光度計（型號：N4S/N4，杭州諾丁科學器械公司），酶標儀（型號：F50，江蘇博美達生命科學公司），Trizol 試劑（貨號：GMS12279，上海杰美基因醫(yī)療公司），miRNA 反轉錄試劑盒（貨號：K1622，武漢科昊佳生物科技公司），人α-Syn 酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（貨號：F00000，上海西唐生物科技公司）。

1.3 方法

1.3.1 血清獲?。河赑D 組患者入院第二天早晨及對照組健康體檢時采集肘靜脈血5 ml，而后放于冷凍離心機內以3 000 r/min 離心10 min，再將上層血清樣本移至新的離心管中，放-80℃冰箱冷凍備用。

1.3.2 qRT-PCR 法檢測血清miR-7 水平：將預冷的PBS 加入血清中洗滌兩次，再把洗滌過的血清倒進研缽中加入Trizol 試劑，以提取總RNA，提取過后用紫外分光光度計檢測RNA 的純度。選擇吸光值在1.8～2.1 的血清樣品，用miRNA 反轉錄試劑盒對所得RNA 進行反轉錄，獲得cDNA。取cDNA模板2μl，加入通用后端引物1μl，miR-7 特異前端引物1μl，2×SYBR GREEN Master Mix 1 μl，再加入無菌蒸餾水至20 ml。反應條件設置為95℃10 min，95℃ 15s，60℃ 30s，40 個循環(huán)。用2-ΔΔCt法計算miR-7 表達量。

1.3.3 ELISA 法檢測血清α-Syn 水平：采用雙抗夾心ELISA 法檢測α-Syn 水平，嚴格按照人α-Syn ELISA 試劑盒說明進行操作。

1.3.4 認知功能評估：采用簡易精神狀態(tài)量表（mini-mental state examination，MMSE）和蒙特利爾認知評估量表（montreal cognitive assessment，MoCA）對PD 患者的認知功能進行評估。其中MMSE 評分＜27 分存在認知功能障礙，27～30分認知功能正常；而MoCA 評分＜26 分存在認知功能障礙，26～30 分認知功能正常。均由神經內科?？漆t(yī)生按國內標準完成測評，分數(shù)越低認知功能越差。

1.4 統(tǒng)計學分析 采用統(tǒng)計學軟件SPSS 22.0 分析數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q法檢驗，計數(shù)資料采用n（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。采用Spearman 法分析血清miR-7，α-Syn 水平與MMSE 評分、MoCA 評分的相關性；采用Pearson法分析PD 患者血清miR-7 與α-Syn 水平的相關性。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組對象血清miR-7 和α-Syn 水平比較 PD組血清miR-7 水平明顯低于對照組（6.95±1.74 vs 8.21±1.35），血清α-Syn水平明顯高于對照組（6.28±1.05μg/L vs 3.52±0.56μg/L），差異具有統(tǒng)計學意義（t=5.890，23.879，均P=0.000）。

2.2 不同Hoehn-Yahr 分級患者血清miR-7 和α-Syn水平比較 PD 患者Hoehn-Yahr 1 級、2 級、2.5 級、3 級、4 級和5 級血清miR-7（8.03±0.99，7.65±0.76，7.12±1.06，6.64±0.65，6.31±0.73，5.93±0.82） 水平逐漸降低，α-Syn（3.79±0.39，4.29±0.81，5.48±1.07，6.37±0.82，7.55±1.34，9.01±0.76 μg/L）水平逐漸升高，差異具有統(tǒng)計學意義（F=13.201，55.330，均P＜0.05）。2.5 級、3 級、4 級、5 級PD 患者血清miR-7，α-Syn 水平均低于1 級患者（q=4.263～16.923,均P＜0.05）；3 級、4 級、5 級PD 患者血清miR-7 水平均低于2 級患者，2.5 級、3 級、4 級、5 級血清α-Syn 水平均高于2 級患者（q=4.319～16.917，均P＜0.05）；4 級、5 級PD患者血清miR-7，α-Syn 水平均高于2.5 級患者（q=4.899～13.019，均P＜0.05）；4 級、5 級PD患者血清α-Syn 水平均高于3 級患者（q=4.486，18.194，均P＜0.05），且5 級PD 患者血清α-Syn水平高于4 級患者（q=5.550，均P＜0.05），差異具有統(tǒng)計學意義。

2.3 PD 患者血清miR-7，α-Syn 水平與MMSE 評分、MoCA 評分的相關性及血清miR-7 與α-Syn水平的相關性 Spearman 法分析顯示，PD 患者血清miR-7 水平和MMSE 評分呈正相關（r=0.574，P=0.000），血清α-Syn 水平和MMSE 評分呈負相關（r=-0.550，P=0.000）。Spearman 法分析顯示，PD 患者血清miR-7 水平和MoCA 評分呈正相關（r=0.597，P=0.000），血清α-Syn 水平和MoCA評分呈負相關（r=-0.537，P=0.000）。Pearson 法分析顯示，PD 患者血清miR-7 與α-Syn 水平呈負相關（r=-0.608，P=0.000）。

3 討論

PD 是由于腦內黑質多巴胺能神經元病變伴隨路易小體（lewy body，LB）出現(xiàn)，導致神經系統(tǒng)變性的疾病，在中老年人群中較常見。中國55 歲以上人群患PD 概率大約是1.7%，且隨著老齡化加劇，PD 患病率呈上升趨勢[6]。醫(yī)學界普遍認為PD發(fā)病和LB 有關，是通過polo 樣激酶2 促進α-Syn第129 位絲氨酸磷酸化[7]，被磷酸化的α-Syn 形成寡聚體，組成中腦內的LB，LB 阻礙黑質紋狀體通路導致發(fā)病[8]。α-Syn 形成的寡聚體和多聚體具有細胞毒性[3]，可通過多種途徑致黑質多巴胺能神經元損傷；可通過Toll 樣受體4 使受體神經元周圍的膠質細胞活化[9]，進而促進一氧化氮和過氧化物等有毒物質釋放至胞外，加重黑質多巴胺能神經元損傷；α-Syn 聚集物通過結合Tau 蛋白，降低微管蛋白合成，使細胞骨架發(fā)生改變，進而導致神經元損傷[10]；α-Syn 寡聚體也可通過形成細胞膜上跨膜小孔，使完整細胞膜發(fā)生破壞，從而發(fā)揮其毒性作用。也有研究認為，α-Syn 磷酸化后能產生更多寡聚體和不溶性成分[11]，使泛素-蛋白酶系統(tǒng)降解發(fā)生障礙，導致胞漿內LB 形成及黑質多巴胺神經元凋亡，引發(fā)PD。楊清等[12]研究發(fā)現(xiàn)，PD 患者血清α-Syn水平顯著高于對照組，且隨著病情加重不斷升高[13]。本研究結果與楊清等[12]研究結果基本一致，可能是由于PD 是一種蛋白降解障礙性疾病，而α-Syn是存在神經元細胞的突觸前蛋白，其與神經元發(fā)育、形成以及突觸功能密切相關，但是突變的α-Syn過度聚集將會造成泛素-蛋白酶系統(tǒng)降解障礙，產生毒性，從而導致細胞內蛋白降解障礙、聚集，最終造成PD 的發(fā)生。另外本研究結果還顯示，隨著Hoehn-Yahr 分級的增加，血清α-Syn 水平逐漸升高，且PD 患者血清α-Syn 水平與MMSE 評分、MoCA 評分均呈現(xiàn)負相關，此結果說明隨著PD 患者疾病嚴重程度增加，血清α-Syn 水平也呈現(xiàn)增高的趨勢，而α-Syn 的聚集將會損傷多巴胺能神經元，從而導致患者認知功能障礙的發(fā)生。

大量研究發(fā)現(xiàn)PD 患者或動物模型腦組織中存在大量失調的miRNA，miRNA 參與PD 發(fā)病的各個過程，是一種很好的診斷標志物，具有較高敏感度和特異度[14-15]。王一帆等[16]研究表明，miR-7 可在百草枯誘導多巴胺能神經元損傷中抑制α-Syn蛋白表達，從而發(fā)揮神經元保護作用。TITZE-DEALMEIDA 等[17]研究表明，PD 患者多巴胺能神經變性相關的大腦區(qū)域中miR-7 水平明顯降低。黑質中miR-7 的消耗和α-Syn 的積累，與多巴胺能細胞的丟失以及紋狀體中多巴胺的減少有關。CHOI等[18]研究表明miR-7 可通過調控α-Syn mRNA的3’-非翻譯區(qū)抑制α-Syn 的蛋白水平。本研究結果表明，PD 患者血清miR-7 水平下降，且隨著病情加重而逐漸降低，與上述結果相似。推測可能是由于miR-7 誘導的α-Syn 下調可保護細胞免受氧化應激，miR-7 起到調節(jié)α-Syn 和多巴胺的作用。本研究結果還顯示，PD 患者血清miR-7 水平和MMSE 評分、MoCA 評分均呈正相關，提示血清miR-7 水平變化與PD 患者認知功能有關，血清miR-7 水平降低可能通過影響MMSE 評分、MoCA評分而參與認知功能障礙的發(fā)生。另外，Pearson 法分析顯示，PD 患者血清α-Syn 水平與miR-7 水平呈負相關，因此認為miR-7 和α-Syn 可能共同通過影響PD 的發(fā)展進程從而影響PD 患者認知功能障礙。

綜上所述，隨著PD 患者病情加重，血清miR-7 水平逐漸降低，α-Syn 水平逐漸升高，二者均與認知功能評分具有顯著相關性，推測miR-7 在調節(jié)α-Syn 和多巴胺的生理中具有重要作用，并可能為研究PD 的病理學提供新的范例。但是由于本研究納入樣本量相對較少，未通過分子學角度及基礎實驗進行分析其內在的作用機制，導致本研究存在諸多不足之處，還有待更深入研究。