郭艷，劉肄輝，李華銘，王宇芳，李春霞

慢性乙型病毒性肝炎（CHB）發(fā)病機制復雜，目前尚未完全闡明，乙型肝炎病毒（HBV）引起的免疫反應是肝臟炎癥發(fā)生的主要機制，與細胞免疫密切相關。近年來，CD4+T輔助性（Th）細胞的幾個主要亞群，如Th1、Th2和Th17細胞，已被證明在HBV誘導的肝臟炎癥的發(fā)展中發(fā)揮重要作用[1]。Th9細胞是CD4+T淋巴細胞亞群新成員，研究認為其在CHB中起促炎作用[2]，其在分化與功能上與調節(jié)性T淋巴細胞（Treg細胞）具有一定的相關性。目前研究認為，Treg細胞在CHB中主要起免疫抑制作用[3]，而對Th9/Treg在HBV感染中的變化研究較少。本研究旨在觀察Th9、Treg及Th9/Treg在不同程度CHB患者中的變化趨勢，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2019年1月至2020年12月浙江省杭州市第三人民醫(yī)院收治的HBV感染者150例，分為HBV攜帶組、輕度CHB組、中度CHB組、重度CHB組及乙肝肝硬化組，每組各30例。均符合《慢性乙型肝炎防治指南2019年版》中HBV感染診斷標準[4]。CHB分級標準參考《病毒性肝炎防治方案2000版》[5]：輕度CHB，丙氨酸氨基轉移酶（ALT）≤3 ULN，總膽紅素（TBiL）≤2 ULN；中度CHB，ALT＞3 ULN，5 ULN＞TBiL＞2 ULN；重度CHB，ALT＞3 ULN，TBiL＞5 ULN；乙肝肝硬化，Child-Pugh分級≥5分，診斷為肝硬化。排除甲型肝炎病毒（HAV）、丙型肝炎病毒（HCV）及戊型肝炎病毒（HEV）等感染，排除合并脂肪性、酒精性和遺傳代謝性肝病、失代償性慢性肝病以及自身免疫相關的其他疾病，排除心腦血管、肝、腎和造血系統重大疾病及精神病患者，排除妊娠或哺乳期婦女。所有患者未接受過抗病毒治療或免疫調節(jié)治療。

同時選擇健康志愿者20名作為對照組。本研究經杭州市第三人民醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準同意，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 方法 記錄患者及健康志愿者的性別及年齡，完成HBV血清學標志物、血清肝功能、HBV-DNA、外周血Th9及Treg等指標檢測。

HBV血清標志物采用化學發(fā)光法定量檢測（美國雅培I-2000全自動免疫發(fā)光分析儀），ALT采用全自動生物化學分析儀檢測（日本日立全自動7180生化儀），HBV-DNA采用實時熒光定量PCR檢測（美國ABI公司ABI7000型全自動熒光定量PCR系統）。TBiL參考范圍0～21mol/L，ALT參考范圍0～50 U/L，HBV-DNA最低檢測下限為＜30 IU/ml。

流式細胞儀購自美國Thermo Attune，Anti-Human CD3及FITC購自MultiSciences，Anti-Human CD8及PE-Cy7購自MultiSciences，IL-9 Monoclonal Antibody(MH9D1)及PerCP-eFluor 710購自eBioscience，Human Regulatory T CellStaining Kit購自MultiSciences，PMA/Ionomycin mixture（250X）佛波酯/離子霉素混合物購自MultiSciences，BFA/Monensin Mixture（250X）布雷非德菌素A/莫能霉素混合物購自MultiSciences，Fix&Perm Kit固定破膜劑購自MultiSciences。檢測方法及步驟均按常規(guī)流程進行。

1.3 統計方法 數據采用SPSS 26.0軟件分析，計量資料以均數±標準差表示，多組間比較采用檢驗，多重比較采用LSD-檢驗；計數資料采用2檢驗；相關性分析采用Spearman等級相關分析＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HBV感染組與對照組指標比較 兩組性別比、年齡及Th9/Treg值差異均無統計學意義（均P＞0.05），TBiL、ALT、Th9及Treg水平差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表1。

表1 HBV感染組與對照組指標比較

2.2 不同程度CHB患者Th9及Treg細胞水平變化5組性別比、年齡及HBV-DNA差異均無統計學意義（均P＞0.05），TBiL、ALT、Th9、Treg及Th9/Treg差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表2。

表2 不同程度CHB患者中Th9及Treg細胞水平變化

2.3 Th9及Treg水平與TBiL、ALT及HBV-DNA的相關性 Th9與Treg呈負相關（r=-0.485，P=0.000）；Th9細胞與ALT呈正相關（r=0.364，P=0.000），與TBIL呈正相關（r=0.407，P=0.000），與HBV-DNA呈負相關（r=-0.076，P=0.353）；Treg細胞與ALT呈負相關（r=-0.188，P=0.02），與TBIL呈負相關（r=-0.146，P=0.075），與HBV-DNA呈負相關（r=-0.035，P=0.667）。

3 討論

先天免疫細胞和適應性免疫細胞在控制HBV感染中發(fā)揮關鍵作用，但它們也可引起炎癥，并隨后導致肝臟病理。在HBV感染的初始階段，先天免疫被觸發(fā)，導致抗病毒細胞因子的產生，隨后適應性免疫系統被激活并在肝內招募，從而成功清除病毒，若免疫系統未能清除病毒則轉為HBV感染。HBV感染的發(fā)病機制較為復雜，迄今尚未完全闡明，HBV不直接殺傷肝細胞，病毒引起的免疫反應是一把雙刃劍，它通過破壞病毒感染細胞來抵抗感染，同時引起肝臟炎癥，加重肝臟損傷，是導致肝細胞損傷及炎癥壞死的主要機制[6]，HBV特異性（適應性）免疫應答在清除HBV中起主要作用。越來越多的證據表明，CD4+T細胞亞群在肝臟炎癥的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，CD4+T細胞反應不足可導致持續(xù)性HBV感染及慢性炎癥，CD4+T細胞包括Th1、Th2、Th17、Th9及Treg等。

Th9是以分泌IL-9為特征的CD4+T細胞亞群，諸多研究認為其參與了CHB的發(fā)病機制[2]。魏金剛等[7]認為HBV感染者外周血Th9較健康對照組明顯升高，Th9細胞與HBV持續(xù)性感染及高復制狀態(tài)有關。本研究發(fā)現外周血Th9在HBV感染者中較健康對照組明顯升高，與筆者前期研究及多數研究一致[2，7-8]，但Cui等[9]的研究認為HBV感染患者外周血Th9細胞頻率明顯降低，Yu等[10]研究發(fā)現CHB外周血Th9細胞與健康對照組差異無統計學意義。出現這種差異的原因可能與入組病例不同及樣本數量有關。進一步的研究發(fā)現，隨著CHB損傷程度的加重，Th9細胞頻率逐步升高，5組差異有統計學意義（均P＜0.05）；相關性分析Th9與TBIL、ALT均呈正相關，提示Th9可能起促炎作用，其與HBV-DNA載量呈負相關，但差異無統計學意義（P＞0.05），Cui等的研究也認為Th9細胞與HBVDNA載量呈負相關，這說明Th9細胞促炎作用的雙重反應，即炎癥反應同時也促進了病毒的清除。

而另一類CD4+T細胞亞群Treg細胞被認為通過抑制各種類型的細胞，包括樹突狀細胞（DC）、自然殺傷細胞（NK）、CD4+T和CD8+T細胞，在免疫耐受的發(fā)展和維持中發(fā)揮關鍵作用[11]。在急性HBV感染期間，Treg保護肝臟免受免疫介導的肝損傷，而在慢性HBV感染中，Treg參與了肝硬化的發(fā)展以及進一步向肝癌的轉化和轉移，提示Treg在不同疾病階段發(fā)揮不同的作用[12]。本研究發(fā)現，慢性HBV感染者外周血Treg較健康對照組明顯升高，與其他研究一致[13-14]。與Th9不同，隨著肝損傷程度的加重，Treg逐漸降低，5組差異有統計學意義（均P＜0.05）；相關性分析提示，Treg與ALT呈負相關，Tre g可能通過抑制Th9細胞起抗炎作用。本研究結果Treg與HBV-DNA無明顯相關性，但詹愛琴等[13]研究認為Treg水平與HBV-DNA載量呈正相關。

有諸多研究認為，Th17/Treg平衡失衡是導致CHB患者持續(xù)病毒感染的重要機制[15]。本研究結果提示，慢性HBV感染者Th9/Treg與對照組差異無統計學意義，與筆者前期研究不一致[8]，可能與入組樣本不同有關。進一步的研究發(fā)現，Th9/Treg隨著肝臟損傷程度的增加而升高，與CHB損傷程度有關，Th9及Treg兩者之間可能存在動態(tài)變化，從而出現肝臟的免疫耐受或免疫激活，是否影響預后尚需進一步研究。

利益沖突 所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明 郭艷、劉肄輝：實驗操作、論文撰寫；王宇芳、李春霞：數據整理、統計學分析；李華銘：研究指導、論文修改、經費支持