田 磊 王世偉 趙 立 楊 倩 陸曉曄 朱長清 楊偉強

復蘇后綜合征(post-resuscitation syndrome，PRS)是心臟驟?；颊咝姆螐吞K成功后死亡的主要原因，多器官功能障礙是其常見表現(xiàn)，系統(tǒng)性缺血再灌注損傷是其主要病理機制[1-2]。急性腎損傷(acute kidney injury, AKI)是心肺復蘇后常見的臟器功能損傷，發(fā)病率>50%，是患者心肺復蘇成功后死亡的獨立危險因素[3-4]。研究心肺復蘇后患者發(fā)生AKI的防治策略具有重要的臨床意義。

ATP敏感鉀離子通道(ATP-sensitive potassium channel, KATP)可調(diào)節(jié)微循環(huán)障礙，能夠改善缺血再灌注損傷[5]。KATP主要分為兩類，一類為肌膜KATP (sarcolemmal KATP，sarcKATP)，另一類為線粒體KATP(mitochondrial KATP，mitoKATP)。本課題組前期研究[6]結(jié)果顯示，非選擇性KATP激動劑左西孟旦對心肺復蘇后發(fā)生AKI的大鼠具有顯著的保護作用。然而，左西孟旦主要通過何種KATP發(fā)揮作用，尚未完全明確。Grossini等[7]的一項關(guān)于缺血再灌注腎損傷的動物實驗結(jié)果顯示，mitoKATP在腎損傷的治療中具有重要作用 。本研究將通過構(gòu)建心臟驟停-心肺復蘇動物模型，探索mitoKATP在心肺復蘇后AKI中的作用及相關(guān)機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 由中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院唐萬春危重癥實驗室提供無特定病原體(SPF)級雄性Sprague Dawley(SD)大鼠50只，體重為(510.0±6.6) g。實驗用動物生產(chǎn)許可證編號SCXK(粵)2013-0034，動物使用許可證編號SYXK(粵)2017-0081。所有SD大鼠適應性飼養(yǎng)1周后進行實驗。

1.2 試劑與儀器 戊巴比妥購自美國Sigma-Aldrich公司，左西孟旦購自中國齊魯制藥有限公司，mitoKATP抑制劑5-HD購自美國Sigma-Aldrich公司，sarcKATP抑制劑HMR-1098購自德國賽諾菲-安萬特公司，血清肌酐(sCr)和尿素氮(BUN)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所有限公司，多炎癥因子檢測Bio-Plex試劑盒購自美國伯樂公司，麗春紅和酸性品紅購自上海試劑三廠，線粒體復合物酶活性定量檢測試劑盒購自美國Sigma-Aldrich公司，兔抗大鼠GAPDH、剪切的半胱氨酸蛋白酶3(cleaved caspase 3)單克隆抗體購自艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司。

1.3 心臟驟停-心肺復蘇動物模型建立及分組處理 將SD大鼠隨機分為左西孟旦治療(levo)組、mitoKATP激動(mito)組、sarcKATP激動(sarc)組、空白對照組(control)組和假手術(shù)(sham)組，每組各10只。

大鼠在實驗前12 h禁食，采用3%戊巴比妥按照45 mg/kg濃度行腹腔內(nèi)注射麻醉，術(shù)中間斷予以10 mg/(kg·h)靜脈麻醉。對大鼠右側(cè)股動脈和靜脈予以置管，監(jiān)測血壓和靜脈給藥通路，二導聯(lián)心電監(jiān)護記錄大鼠心電變化。levo組、mito組和sarc組大鼠采用封堵氣管插管的方法，制造窒息環(huán)境，同時監(jiān)測大鼠心率和心電變化。當平均動脈壓≤20 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)時，記作心臟驟停，并再重新計時6 min。在大鼠心臟驟停5 min 30 s時，予以吸痰并行呼吸機通氣，通氣頻率200次/min，氧濃度100%。心臟驟停6 min時，立即于劍突上2.8 cm行胸外按壓，按壓頻率200次/min，按壓深度1 cm，按壓過程維持冠狀動脈灌注壓(22±2) mmHg。復蘇后平均動脈壓≥60 mmHg，持續(xù)5 min，視為自主循環(huán)恢復。持續(xù)按壓20 min，仍不能恢復自主心律，視為復蘇失敗。sham組大鼠僅予置管，記錄各項指標，不進行心肺復蘇操作。

levo組、mito組和sarc組大鼠在心臟驟停5 min 30 s時，予快速靜脈注射左西孟旦12 μg/kg，復蘇后予以0.3 μg/(kg·min)靜脈維持。mito組在左西孟旦給藥前予3 mg/kg HMR-1098靜脈注射；sarc組在左西孟旦給藥前予5 mg/kg 5-HD 靜脈注射；control組和sham組在相同時間點注射等劑量0.9%氯化鈉溶液。

1.4 腎功能及炎癥指標檢測 大鼠心肺復蘇后6 h經(jīng)股靜脈采血，300×g離心10 min，留取血清。應用試劑盒檢測各組大鼠sCr和BUN水平。同時，通過多炎癥因子Bio-Plex試劑盒檢測血清IL-1β、IL-6和TNF-α 水平。

1.5 腎組織病理檢查 大鼠心肺復蘇后6 h，以苯巴比妥腹腔內(nèi)注射麻醉，取其左側(cè)腎臟，甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋。制作5 μm石蠟切片，行H-E染色。200倍光鏡下觀察各組大鼠腎組織病理學改變。采用Jablonski評分標準對腎臟H-E染色切片進行形態(tài)學評估[8]。判斷標準：隨機挑選10個以上包括皮質(zhì)和外髓質(zhì)在內(nèi)的高倍鏡視野，計算每個視野中受損腎小管的百分比并行病理評分，取均值。病理評分標準：正常腎小管計0分；腎小管損傷程度≤25%計1分；腎小管損傷程度26%～50%計2分；腎小管損傷程度51%～75%計3分；腎小管損傷程度≥76%計4分。

1.6 采用分光光度法檢測腎組織線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ、Ⅱ活性 取各組大鼠腎臟組織，稱重并按重量體積比(1∶5)加入Tris-HCl緩沖液勻漿，制成10%的組織勻漿液，2 000×g、15 min低溫離心2次，棄沉淀，將2次所得上清液混合，12 000×g、15 min低溫離心2次，棄上清液所得沉淀制成線粒體懸浮液。采用比色法測定線粒體呼吸鏈復合物 Ⅰ、Ⅱ活性。在20 μL線粒體懸浮液中加入反應緩沖液(10 mmol Tris-HCl，pH值為8.0)，隨后分別加入輔酶Q(80 μmol)、小牛血清白蛋白(BSA, 1 mg/mL)、疊氮鈉(NaN3，0.25 mmol)、抗霉素A(0.4 μmol)，混勻后37 ℃孵育3 min，再加入NADH 200 μmol啟動反應。3 min內(nèi)連續(xù)測定波長為340 nm處NADH吸光度(A)的變化[摩爾吸光系數(shù)ε=3.3 L/(mmol·cm)]，根據(jù)每分鐘A340 nm值的變化評估線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ的活性。將20 μL線粒體懸浮液加入pH值為7.4的 50 mmol磷酸鉀緩沖液，隨后分別加入二氯酚靛酚(50 μmol)、NaN3(2 mmol)、魚藤酮(2 μg/mL)、抗霉素A(2 μg/mL)、輔酶Q(25 μmol)，混勻后37 ℃孵育3 min，再加入琥珀酸鈉(20 μmol)啟動反應。3 min內(nèi)連續(xù)測定波長為600 nm處A的變化[摩爾吸光系數(shù)ε=13.0 L/(mmol·cm)]，根據(jù)每分鐘A600 nm值的變化評估線粒體呼吸鏈復合物Ⅱ的活性。

1.7 免疫印跡實驗 取大鼠腎組織，勻漿，提取蛋白質(zhì)，進行濃度定量。各組取50 μg蛋白質(zhì)經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜上，室溫封閉1 h 后分別與兔抗大鼠GAPDH和cleaved caspase 3抗體(稀釋度1∶1 000)結(jié)合，洗膜后再結(jié)合辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔二抗抗體(1∶5 000 TBST稀釋)，增強化學發(fā)光顯影試劑反應后，應用免疫印跡自動成像儀掃描并獲得顯影圖像。應用Image J軟件分析蛋白質(zhì)的灰度值。

2 結(jié) 果

2.1 mitoKATP開放可改善心肺復蘇后大鼠腎功能 與sham組[sCr水平為(16.89±1.27) μmol/L，BUN水平為(2.77±0.15) mmol/L]比較，control組大鼠心肺復蘇6 h后sCr和BUN水平分別為(81.81±2.48) μmol/L和(6.84±0.28) mmol/L，均顯著升高(P值均<0.05)，提示大鼠心肺復蘇后出現(xiàn)AKI。與control組比較，levo組sCr水平為(33.25±1.03) μmol/L、BUN水平為(4.34±0.27) mmol/L，mito組sCr水平為(35.23±0.85) μmol/L、BUN水平為(4.51±0.29) mmol/L，均顯著降低(P值均<0.05)；而sarc組sCr和BUN水平分別為(80.50±3.50) μmol/L和(6.47±0.32) mmol/L，其差異均無統(tǒng)計學意義(P值均>0.05)。上述結(jié)果提示，左西孟旦能夠改善心肺復蘇后大鼠腎功能，mitoKATP開放可能起主要作用。見圖1。

與sham組比較：①P<0.05。與control組比較：②P<0.05。A 各組大鼠sCr水平比較 B 各組大鼠BUN水平比較圖1 各組大鼠腎功能的比較

2.2 mitoKATP開放能夠減輕心肺復蘇后大鼠腎組織病理損傷程度 H-E染色結(jié)果顯示，與sham組比較，control組大鼠腎小管結(jié)構(gòu)破壞明顯，管腔內(nèi)管狀緣、刷狀緣脫離，大量管型形成。與control組比較，levo組和mito組腎小管輕度擴張，管型明顯減少；而sarc組大鼠腎組織結(jié)構(gòu)變化與control組相似。見圖2。病理評分結(jié)果顯示，與sham組的(0.30±0.14)分比較，control組為(3.60±0.22)分，顯著升高(P>0.05)。與control組比較，levo組和mito組分別為(2.60±0.16)和(2.80±0.20)分，均顯著降低(P值均<0.05)；sarc組為(3.50±0.30)分，與control組比較的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。上述結(jié)果提示，左西孟旦能夠改善心肺復蘇后大鼠腎組織病理損傷，mitoKATP開放起重要作用。

A sham組 B control組 C levo組 D mito組 E sarc組圖2 各組大鼠腎臟組織病理改變的比較(H-E染色，×200)

2.3 mitoKATP開放能夠降低心肺復蘇后大鼠血清炎癥因子水平 與sham組比較，control組大鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α 水平顯著升高(P值均<0.05)；levo組和mito組IL-1β、IL-6和TNF-α 水平較control組顯著降低(P值均<0.05)，而sarc組與control組間的差異均無統(tǒng)計學意義(P值均>0.05)。見表1。上述結(jié)果提示，左西孟旦能夠改善炎癥反應，mitoKATP開放起重要作用。

表1 各組大鼠血清炎癥因子表達情況的比較

2.4 mitoKATP開放能夠改善心肺復蘇后大鼠腎組織細胞凋亡 免疫印跡實驗結(jié)果顯示，與sham組(腎組織cleaved caspase 3相對表達量為0.16±0.01)比較，control組腎組織cleaved caspase 3相對表達量(0.77±0.01)顯著增加(P<0.05)；與control組比較，levo組和mito組腎組織cleaved caspase 3相對表達量分別為(0.37±0.01)和(0.39±0.01)，均顯著減少(P值均<0.05)， 而sarc組腎組織cleaved caspase 3相對表達量(0.77±0.02)，其差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。 見圖3。上述結(jié)果提示，左西孟旦能夠改善腎組織凋亡，mitoKATP開放起主要作用。

1 sham組 2 control組 3 levo組 4 mito組5 sarc組圖3 各組大鼠腎組織cleaved caspase 3蛋白質(zhì)表達情況

2.5 mitoKATP開放能夠改善心肺復蘇后大鼠線粒體功能 與sham組比較，control組、levo組、mito組、sarc組線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ、Ⅱ活性均顯著受到抑制(P值均<0.05)；與control組比較，levo組和mito組線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ、Ⅱ活性均顯著增強(P值均<0.05)，而sarc組線粒體呼吸鏈復合物活性其差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。上述結(jié)果表明，左西孟旦能夠改善心肺復蘇后大鼠腎組織線粒體功能，mitoKATP開放可能起重要作用。

表2 各組大鼠線粒體功能比較

3 討 論

缺血再灌注損傷是心肺復蘇后AKI的主要病理機制[5，9-10]。多個圍繞心肌細胞缺血再灌注損傷的研究[5,11-12]證實，激活KATP能夠改善心肌細胞缺血再灌注損傷。Yurdakul等[13]的研究結(jié)果顯示，KATP開放能夠改善腎臟缺血再灌注損傷。一項多中心隨機對照雙盲臨床研究[14]結(jié)果顯示，非選擇性KATP激動劑左西孟旦能夠預防CKD患者接受二尖瓣置換術(shù)后AKI的發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)，左西孟旦能夠改善心肺復蘇后大鼠腎功能，這與以往的研究結(jié)果一致。同時，本研究分別采用mitoKATP和sarcKATP抑制劑進行干預，并進一步發(fā)現(xiàn)左西孟旦主要是通過激活mitoKATP發(fā)揮腎臟保護作用。這提示mitoKATP在大鼠心肺復蘇后的AKI中起重要作用。

腎臟是人體除大腦之外氧耗最多的器官，線粒體與腎臟缺血再灌注損傷有密切關(guān)聯(lián)[15]。mitoKATP參與維持正常的線粒體功能[16]。關(guān)于帕金森病的基礎(chǔ)研究[17]結(jié)果顯示，mitoKATP參與調(diào)節(jié)線粒體動力學。近期一項關(guān)于心臟缺血再灌注損傷的研究[18]提示，異氟烷能夠通過開放mitoKATP以調(diào)節(jié)線粒體呼吸鏈進而發(fā)揮臟器保護作用。本研究發(fā)現(xiàn)，心臟驟停大鼠心肺復蘇后，腎組織中線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ、Ⅱ活性明顯下降，提示心肺復蘇后大鼠腎組織線粒體呼吸鏈受損。mitoKATP開放后線粒體呼吸鏈復合物活性得以改善，大鼠腎損傷也得到緩解，提示mitoKATP可能通過調(diào)節(jié)線粒體功能進一步改善大鼠心肺復蘇后的AKI。

炎癥因子參與PRS，大量炎癥因子釋放介導心肺復蘇后缺血再灌注損傷的發(fā)生，其中IL和TNF起重要作用[19]。一項關(guān)于大鼠缺血再灌注所致AKI的研究[20]顯示，成纖維細胞因子2能夠改善5-HD對mitoKATP的抑制作用，進而降低腎組織炎癥因子(IL-1、IL-6和TNF-α)表達水平，發(fā)揮腎臟保護作用。該研究結(jié)果提示，mitoKATP可能參與炎癥調(diào)節(jié)。本研究發(fā)現(xiàn)，心肺復蘇后AKI大鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平增高，左西孟旦能夠降低血清炎癥因子水平，而mitoKATP開放起主要作用。本研究結(jié)果與既往的研究結(jié)論基本一致。

細胞凋亡在AKI的發(fā)生中起重要作用[21]。mitoKATP與凋亡的關(guān)系已有多個報道。一項關(guān)于吸煙與中樞感受器受損的研究[22]結(jié)果表明，mitoKATP開放能夠降低凋亡相關(guān)蛋白質(zhì)表達水平，抑制凋亡發(fā)生。Arabian等[23]關(guān)于缺血再灌注引起海馬損傷的研究結(jié)果顯示，mitoKATP開放能夠抑制細胞凋亡，進而發(fā)揮神經(jīng)保護作用。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，mitoKATP開放能夠抑制cleaved caspase 3蛋白質(zhì)的表達，改善大鼠心肺復蘇后AKI。結(jié)合以往的研究，本課題組推測mitoKATP開放具有抗凋亡作用。

綜上所述，mitoKATP開放能夠抑制炎癥反應，減輕腎組織細胞凋亡，改善腎臟線粒體功能，進而緩解大鼠心肺復蘇后AKI。mitoKATP有望成為心肺復蘇后AKI的防治靶點。