程靜雯 曹磊 張艷敏 葉倩 陳敏 譚文松 趙亮，

（1.華東理工大學生物反應器工程國家重點實驗室，上海 200237；2.上海倍諳基生物科技有限公司，上海 201203）

CHO 細胞作為目前生物制藥工業(yè)領(lǐng)域生產(chǎn)重組蛋白的“主力軍”，擁有諸多優(yōu)勢，如生長快速、易于適應無血清懸浮培養(yǎng)、易于放大、生產(chǎn)工藝成熟、易轉(zhuǎn)染以及安全性高等［1-3］。盡管CHO 細胞獲得了廣泛的應用，但其存在代謝效率低、代謝行為難以調(diào)控、產(chǎn)品質(zhì)量控制困難、細胞株遺傳不穩(wěn)定等諸多特點［4-8］，在某種程度上限制了治療性重組蛋白工業(yè)化生產(chǎn)效率的進一步提升。長期以來，建立適合工業(yè)應用的高效表達重組蛋白的CHO 工程細胞株面臨著重大挑戰(zhàn)。近來，人們經(jīng)常在基因組上引入有利于細胞生長維持或目標蛋白表達的基因來提高CHO 細胞的性能［9］。但傳統(tǒng)隨機整合的方法存在許多根本性問題，如整合位點不可控而帶來的不確定性。通過定點整合（site-specific integration, SSI）將目的基因（gene of interest, GOI）整合在基因組特異性位點處，能夠有效避免隨機整合帶來的不穩(wěn)定性。隨著基因編輯工具的高速發(fā)展，CRISPR/Cas9技術(shù)憑借成本效益高、易于使用、設(shè)計簡單等優(yōu)點，獲得了廣泛的應用，其中以基因敲入和基因敲除最為常見［10］。由于CHO 細胞生物信息學數(shù)據(jù)的不斷完善，基因組定點編輯在CHO 細胞中已有成功的嘗試［11-13］。

近年來，通過單次基因過表達或破壞基因表達來改變CHO 細胞某個單一功能的工程改造方法日趨成熟。如在提高細胞抗凋亡水平方面，Safari 等［14］在基因組Caspase7位點敲入EGFP基因以破壞Caspase7 蛋白的表達，Tan 等［15］過表達HSP27 蛋白，這兩種方式均獲得了具備抗凋亡能力的細胞株。然而，往往單個基因的改造只能改變單一表型甚至無法改變表型。因此，多基因同步改造成為具有卓越性能的下一代工程細胞株構(gòu)建的必經(jīng)之路。在一項對CHO 細胞懸浮適應的研究中，Lee 等［16］利用CRISPR/Cas9 技術(shù)同步敲除5 個基因，結(jié)果表明Igfbp4基因和AqpI基因的功能缺失加速了CHO-K1細胞的懸浮適應。目前，多基因同步改造主要用于多基因敲除或單基因片段刪除［17］。然而迄今為止，多基因同步改造仍缺少將破壞基因和過表達基因結(jié)合的同步改造方法。目前改造后細胞的特性往往僅源于敲入的基因或敲除的基因，這導致細胞功能單一，并且限制了多基因同步改造的廣泛應用。

本研究選取細胞凋亡途徑中抗凋亡基因Bcl-2和蛋白巖藻糖基化通路中巖藻糖合成的關(guān)鍵酶基因FUT8作為模型基因，以此建立適合工業(yè)應用工程細胞株構(gòu)建的定點同步敲入敲除基因編輯策略，并驗證、評估其應用潛力和可行性。這將促進應用于生物制藥工業(yè)領(lǐng)域的下一代工程細胞株的產(chǎn)生，既可節(jié)省多個重復步驟堆疊的時間，加速工程細胞株改造進程，又能大大提升表型調(diào)控的成功率。

1 材料與方法

1.1 材料

pSpCas9（BB）-2A-Puro（PX459）V2.0 來 源 于Addgene，E.coliDH5α 感受態(tài)購自擎科生物科技有限公司，所需引物均由擎科生物科技有限公司合成，CHO-K1 細胞系源自美國ATCC 公司，血液/組織/細胞基因組提取試劑盒、無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提中量試劑盒、普通瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒均購自天根生化科技有限公司，BbsI-HF、NotI-HF、XmaI-HF、AflII-HF、MfeI-HF、T7EI、T4 連接酶均購自NEB，DMEM 培養(yǎng)基購自上海倍諳基生物科技有限公司，胎牛血清購自上海BIOSUN 公司，胰酶購自美國GIBCO 公司，高保真酶DNA 聚合酶、無縫重組克隆試劑盒均購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司，Annexin V-Alexa Fluor 647/PI 凋亡檢測試劑盒、cDNA 合成試劑盒、通用型qPCR 預混液、CCK-8 試劑盒均購自翌圣生物科技股份有限公司，LCA Dylight 649 購自美國Vectorlab 公司，重組Anti-Bcl-2 抗體購自Abcam 公司，HRP-labeled Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）、嘌呤霉素、上樣緩沖液均購自碧云天生物技術(shù)有限公司，10% SDS-PAGE、ECL 發(fā)光液均購自上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 sgRNA/Cas9 表達質(zhì)粒構(gòu)建及sgRNA 基因編輯效率檢測 由NCBI 網(wǎng)站在線工具（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）查找到CHO-K1 細胞基因組FUT8基因序列（Gene ID: 100751648），選擇FUT8基因外顯子1 和外顯子2 作為靶序列。根據(jù)網(wǎng)站（http://crispr.mit.edu/）中CRISPOR 系統(tǒng)對sgRNA 有效性與潛在脫靶位點的預測，設(shè)計了3 條sgRNA 并合成相應寡核苷酸鏈，如表1 所示。先將寡核苷酸鏈退火結(jié)合，再用BbsI-HF 酶切PX459 質(zhì)粒載體，利用T4連接酶將退火產(chǎn)物和酶切載體連接起來，經(jīng)轉(zhuǎn)化和測序得到陽性單菌落，擴大培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，即得sgRNA/Cas9 表達質(zhì)粒。將構(gòu)建好的sgRNA/Cas9 表達載體轉(zhuǎn)染CHO-K1 細胞，獲得轉(zhuǎn)染細胞池。提取該細胞池的基因組，以提取到的基因組為模板進行PCR 擴增反應，PCR 所用引物如表2 所示。將PCR產(chǎn)物進行退火反應，在退火產(chǎn)物中加入1 μLT7EI酶，于37℃下反應30 min，反應產(chǎn)物使用瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表1 sgRNA 寡核苷酸鏈Table 1 sgRNA oligos

表2 T7E I 酶切實驗引物Table 2 PCR primers for T7E I enzymatic digestion assay

1.2.2 供體表達盒的設(shè)計與構(gòu)建 供體表達盒中各元件包括啟動子、目的基因、報告基因、連接子、轉(zhuǎn)錄終止信號和靶點上下約800 bp 同源序列。人源Bcl-2基因（Gene ID: 596）由基因合成所得，其他各元件片段均采用高保真DNA 聚合酶進行PCR 擴增反應獲取，片段與酶切載體之間連接均采用無縫重組克隆試劑盒中重組酶進行，再經(jīng)轉(zhuǎn)化、測序后提取質(zhì)粒。同源序列選取sgRNA2 5′-ATAAAACAATAAGGTCCCCC-3′引導Cas9 切割位置的上下游長約800 bp 片段，稱之為同源臂（arm）。供體表達盒的結(jié)構(gòu)為5′arm-CMV（E+P）-Bcl2 -T2AEGFP-bGH poly（A）-3′arm，質(zhì)粒圖譜如圖1 所示。

圖1 供體質(zhì)粒的圖譜Fig. 1 Map of donor plasmid

1.2.3 細胞轉(zhuǎn)染及穩(wěn)定細胞株構(gòu)建 將細胞提前以4×105cells/well 接種于六孔板中。待細胞匯合度約80%-90%，將供體表達盒線性化片段和sgRNA/Cas9表達質(zhì)粒以摩爾比1∶1 共轉(zhuǎn)染CHO-K1 細胞。供體表達盒線性化片段是以Bcl-2 供體質(zhì)粒為模板進行PCR 擴增反應獲得的，經(jīng)純化后使用。細胞轉(zhuǎn)染48 h 后傳2-3 代，收集細胞，利用流式分選儀將表達增強綠色熒光蛋白的（enhanced green fluorescent protein, EGFP）單克隆細胞分選出來，接種至96 孔板里，每孔含有200 μL 生長培養(yǎng)基。

1.2.4 基因分子水平檢測 提取EGFP 陽性單克隆細胞基因組，以提取的基因組為模板，反應條件如下：95℃ 3 min；35X：95℃ 15 s；62℃ 15 s；72℃ 45 s/kb；72℃ 5 min，進行5′ junction PCR、3′ junction PCR 和out-out PCR 三輪PCR 鑒定，所需引物如表3 所示。5′junction PCR 和3′ junction PCR 是檢測基因定點整合情況，out-out PCR 是鑒定單克隆細胞是純合子還是雜合子。

表3 定點整合驗證所需引物Table 3 Primers for site-specific integration

提取目標單克隆細胞的總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以GAPDH基因為內(nèi)參，利用qPCR 檢測內(nèi)源性Bcl-2基因、外源性Bcl-2基因和FUT8基因的mRNA 相對表達量。所需引物如表4 所示，結(jié)果使用2-△△CT計算得到mRNA 的相對表達量。

表4 qPCR 引物序列Table 4 Primers for qPCR

1.2.5 目的蛋白表達水平檢測 使用流式細胞術(shù)分析熒光比例及強度對EGFP 蛋白表達進行檢測，均以野生型CHO-K1 細胞為陰性對照。流式細胞術(shù)檢測前，細胞需用PBS 緩沖溶液洗滌幾遍，并用其重懸至密度約為1×106cells/mL。Bcl-2 蛋白檢測采用Western blot 方法。取100 μL 裂解液裂解1×106個細胞沉淀，4℃ 12 000 r/min 離心30 min，收上清。樣品于95℃沸水煮5 min。將制備好的樣品加進10% SDS-PAGE 膠孔里，濃縮膠80 V 跑15 min，分離膠恒壓120 V跑75 min。電泳結(jié)束后，以恒壓120 V，100 min 的條件進行轉(zhuǎn)膜。PVDF 膜于封閉液中室溫下緩慢搖晃1 h。之后，一抗孵育2 h，4℃過夜。次日，二抗孵育1 h，最后用多功能凝膠成像分析儀獲得圖像。

1.2.6 無血清條件培養(yǎng)下細胞活力檢測 以每孔8 000 個細胞接種在96 孔板中，每孔100 μL 培養(yǎng)基，以野生型CHO-K1 細胞作為對照組，設(shè)置不加細胞的空白組。培養(yǎng)18 h，將培養(yǎng)基更換為無血清培養(yǎng)基，連續(xù)培養(yǎng)72 h 和96 h，用CCK-8 試劑檢測72 h和96 h 的細胞活率。

1.2.7 細胞FUT8 蛋白酶功能檢測 利用小扁豆凝集素（lens culinaris lectin, LCA）與細胞膜N-聚糖上的核心巖藻糖特異性的結(jié)合驗證FUT8 蛋白酶功能。以每孔4×105個細胞接種于六孔板中培養(yǎng)18-24 h。每孔加入終濃度為20 μg/mL 熒光標記的小扁豆凝集素（Dylight 649-LCA），室溫反應45 min。反應結(jié)束，使用流式熒光術(shù)檢測熒光比例。

1.2.8 細胞抗凋亡性能評估 嘌呤霉素可以應用于誘導細胞凋亡。以每孔3×105個細胞接種于六孔板中培養(yǎng)18-24 h，更換培養(yǎng)基為帶有終濃度為10 μg/mL 嘌呤霉素的新鮮培養(yǎng)基。24 h 后，消化收集細胞，通過雙染法檢測細胞凋亡分布的比例。

2 結(jié)果

2.1 sgRNA基因編輯有效性檢測

在CHO-K1 細胞基因組FUT8基因外顯子1 和外顯子2 共設(shè)計了3 條sgRNA。通過T7EI 酶切實驗檢測sgRNA 在CHO-K1 細胞內(nèi)實際基因編輯效率。若細胞池內(nèi)發(fā)生了基因編輯事件，那么Cas9切割雙鏈DNA 形成了缺口，在缺口處會發(fā)生堿基錯配，則T7EI 酶能特異性識別并切割錯配的雙鏈DNA。T7EI 酶切產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖2，每個泳道中紅色箭頭標注的條帶即為T7EI 酶切后形成，說明sgRNA 在靶點處能夠有效編輯。對圖中條帶灰度值進行分析，得到sgRNA 的有效編輯效率，分別為9.85%、10.1%和3.02%，因此后續(xù)均使用sgRNA2 進行實驗。

圖2 sgRNA 基因編輯效率檢測結(jié)果Fig. 2 Results of sgRNA gene editing efficiency

2.2 定點同步敲入敲除基因編輯策略的建立

2.2.1 定點同步雙敲細胞株的獲得 根據(jù)定點同步敲入敲除基因編輯策略原理圖（圖3），通過該策略成功發(fā)生定點整合事件的細胞株能夠表達綠色熒光，未發(fā)生定點整合事件的細胞株則無法表達綠色熒光。將供體表達盒線性化片段與sgRNA/Cas9 表達載體共轉(zhuǎn)染細胞，收集共轉(zhuǎn)染后的細胞株，利用流式分選儀分選出EGFP 陽性的單克隆細胞，接種于96 孔板中，培養(yǎng)12-14 d。

圖3 定點同步敲入敲除基因編輯策略原理圖Fig. 3 Schematic diagram of the site-specific synchronous knock-in and knock-out gene editing strategy

在熒光顯微鏡下標記表達綠色熒光的單克隆細胞并提取其基因組DNA。以提取的基因組為模板，進行5′ junction PCR、3′ junction PCR 和out-out PCR 3 輪PCR 擴增反應。通過3 輪反應，從36 個表達綠色熒光的單克隆細胞中，篩選出3 個在FUT8 靶基因處成功整合供體表達盒片段的單克隆細胞，故成功實現(xiàn)定點整合的占比為8.3%，剩下33 個表達綠色熒光的單克隆細胞為隨機整合細胞，占比為91.7%。如圖4 所示為其中一株成功實現(xiàn)定點整合的單克隆細胞株的鑒定結(jié)果，從圖中可知，該單克隆細胞的基因組DNA 經(jīng)5′ junction PCR 和3′ junction PCR 均擴增出一條明顯條帶。由測序結(jié)果顯示5′端同源臂以及CMV（E+P）片段缺失了部分序列，但剩余CMV（E+P）片段仍能作為啟動子使用。3′junction PCR 擴增產(chǎn)物的序列基本符合預期設(shè)計。由此驗證了供體表達盒片段被精確整合到FUT8基因靶點處。Out-out PCR 產(chǎn)物的電泳結(jié)果顯示，野生型細胞擴增片段大約2 200 bp，成功定點整合的單克隆細胞擴增片段約4 700 bp，符合預期擴增產(chǎn)物的大小且條帶單一、明亮，表明該單克隆細胞株為純合子，即為通過定點同步敲入敲除基因編輯策略構(gòu)建的工程細胞株，簡稱為定點同步雙敲細胞株。

圖4 定點同步雙敲細胞分子鑒定結(jié)果Fig. 4 Molecular identification results of the site-specific synchronous double-knock cell

2.2.2 定點同步雙敲細胞株敲入和敲除基因的表達水平 供體表達盒片段成功整合于CHO-K1 細胞FUT8基因靶點處，可通過qPCR、Western blot 和流式細胞術(shù)鑒定表達盒中基因的表達水平。由圖5-A-C結(jié)果顯示（****P<0.000 1，**P<0.01，n=3），當內(nèi)源性Bcl-2基因mRNA 轉(zhuǎn)錄水平幾乎無差異時，細胞外源性Bcl-2基因的mRNA 表達量遠高于野生型CHO-K1 細胞，說明外源Bcl-2基因在CHO-K1 細胞內(nèi)成功過表達。由于供體表達盒上存在轉(zhuǎn)錄終止信號元件，故FUT8基因靶點后序列沒有成功轉(zhuǎn)錄。經(jīng)過Western blot 和流式細胞術(shù)檢測，如圖5-D, E 所示，說明了EGFP 綠色熒光蛋白和Bcl-2 蛋白過表達成功。

當細胞中FUT8 酶的功能喪失后，細胞就不能正常合成含有核心巖藻糖的N-聚糖的膜蛋白，則不能與LCA 結(jié)合。如圖5-F 所示，與野生型CHO-K1細胞相比，定點同步雙敲細胞無法與LCA 相結(jié)合，在熒光通道下不顯示熒光，F(xiàn)UT8 酶蛋白功能性喪失，F(xiàn)UT8基因敲除成功。

圖5 定點同步雙敲細胞基因表達水平Fig. 5 Gene expressions of the site-specific synchronous double-knock cell

2.3 定點同步敲入敲除基因編輯策略的可行性評估

2.3.1 定點同步雙敲細胞株基因表達穩(wěn)定性評估 對細胞連續(xù)傳代培養(yǎng)，利用流式熒光儀對傳代40 d 和60 d 的細胞的綠色熒光蛋白表達比例與熒光強度定量分析。如圖6 結(jié)果所示，定點雙敲細胞表達綠色熒光蛋白的比例及熒光強度經(jīng)傳代培養(yǎng)維持穩(wěn)定，表明通過定點同步敲入敲除基因編輯策略構(gòu)建的工程細胞株能夠至少維持60 d 基因表達穩(wěn)定。

圖6 基因表達穩(wěn)定性結(jié)果Fig. 6 Stability results of gene expression

2.3.2 定點同步雙敲細胞株在無血清培養(yǎng)基下的活力 在無血清培養(yǎng)條件下，如圖7 所示，定點同步雙敲細胞的活細胞比例均比野生型細胞提高了約30%（*P<0.05，n=3）。可見在無血清條件下，定點同步雙敲細胞由于Bcl-2 蛋白過表達賦予了細胞在缺少生長因子時的自我保護能力，展現(xiàn)出對血清剝奪的耐受度更強。

圖7 無血清條件下細胞活率Fig. 7 Cell viability under serum-free condition

2.3.3 定點同步雙敲細胞株抗凋亡性能鑒定 將細胞處于10 μg/mL 嘌呤霉素條件下誘導培養(yǎng)24 h 后，如圖8 結(jié)果所示（*P<0.05，**P<0.01，n=3），定點同步雙敲細胞無論是晚期凋亡還是早期凋亡水平，均低于野生型細胞。在活細胞水平上，定點同步雙敲細胞高于野生型細胞約30%。該結(jié)果表明，Bcl-2蛋白過表達能夠使細胞抵御由凋亡誘導劑引發(fā)的細胞凋亡，對于細胞具有一定程度抗凋亡的保護作用。

圖8 定點同步雙敲細胞抗凋亡性能評估Fig. 8 Evaluation on the anti-apoptotic properties of the site-specific synchronous double-knock cell

3 討論

近年來，關(guān)于如何進一步提升CHO 細胞工業(yè)化生產(chǎn)效率的問題，研究員們已經(jīng)進行了多方面的嘗試。其中，通過各類基因工程技術(shù)改變宿主細胞特性以獲得更強健的工程細胞株的方式，獲得了廣泛應用。但經(jīng)基因工程改造后的細胞株仍可能存在各種問題，例如，表型沒有明顯變化導致無法達到預期效果、穩(wěn)定性欠佳等，這些問題成為限制其進一步工業(yè)化應用的主要障礙。本研究通過合理的設(shè)計，建立了可行的適合工業(yè)應用工程細胞株構(gòu)建的定點同步敲入敲除基因編輯策略，該策略中敲入和敲除的基因均能夠發(fā)揮作用，一次操作賦予細胞多個新的特性。

對于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)治療性蛋白而言，將CHO 細胞適應于無血清懸浮培養(yǎng)是一個必不可少的環(huán)節(jié)。本研究構(gòu)建的定點同步雙敲細胞株具備較好的抗凋亡性能，該細胞株對血清剝奪的耐受性更高，有望在細胞懸浮適應中表現(xiàn)出更大的優(yōu)勢，有應用于工業(yè)化生產(chǎn)的潛力。FUT8 蛋白是哺乳動物細胞中巖藻糖合成途徑的關(guān)鍵酶，破壞FUT8 蛋白表達有利于細胞表達低巖藻糖或無巖藻糖的重組抗體。據(jù)報道，巖藻糖的存在會抑制抗體重鏈 Fc 區(qū)與NK細胞膜上FcγRIIIa 受體的結(jié)合，可顯著影響抗體依賴性細胞介導的細胞毒性作用（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC）的活性［18］，而去除巖藻糖的重組抗體則擁有更高的ADCC 活性。因此，定點同步雙敲細胞株可應用于生產(chǎn)低巖藻糖或無巖藻糖的治療性蛋白，由此也說明定點同步敲入敲除基因編輯策略具有可行性與潛在的應用價值。

本研究結(jié)果表明，定點同步雙敲細胞株5′端表達盒和同源臂部分的連接屬于不完整連接，其丟失了表達盒的部分序列。這種不完整連接可能是由于使用了線性化DNA 片段轉(zhuǎn)染細胞，而在核酸外切酶的作用下以及染色體末端切除，可能會導致在細胞內(nèi)供體表達盒DNA 片段末端發(fā)生降解，因此，基于避免不完整連接發(fā)生的基因敲入方式的研究具有重要意義。除了通過同源定向修復（homology-dependent recombination, HDR）介導實現(xiàn)了基因敲入外［19］，Wang 等［20］以非同源末端連接（non-homologous end joining, NHEJ）介導的方式也能夠達到基因敲入的目的，實現(xiàn)多基因整合。與HDR 途徑相比，NHEJ 途徑可活躍于整個細胞周期內(nèi)［21］，但應用于基因敲入時可能會存在表達盒插入方向的問題［22］，故用于提高基因敲入效率的基于不同修復途徑的供體載體模板的設(shè)計仍待進一步優(yōu)化。除了供體載體的優(yōu)化能夠影響基因整合效率外［23-24］，使用如NHEJ 途徑抑制劑等化學處理方式通過影響NHEJ 途徑或HDR 途徑，從而改善基因敲入水平［25］。但有研究表明，化學處理并沒有改善HDR 介導的靶向整合［26］，說明CHO 細胞對這類試劑不敏感，因此對于調(diào)節(jié)通路的試劑還可以進一步篩選與嘗試。

4 結(jié)論

本研究建立了定點同步敲入敲除基因編輯策略，該策略構(gòu)建的CHO 雙功能細胞株，不僅具備較好的抗凋亡性能，且FUT8 蛋白酶功能也遭到破壞。由此表明該策略具備較好的可行性和實際工業(yè)應用潛力。