吳憲文 陳 燁 徐國恒,2

(北京大學醫(yī)學部1.實驗動物科學部;2.基礎醫(yī)學院生理學與病理生理學系,北京 100191)

光照是動物設施中需要考慮的一個關鍵因素,光不僅支持著動物對周圍環(huán)境的認知及活動,同時也對體內激素平衡、神經(jīng)反應、晝夜節(jié)律及繁殖等調節(jié)具有重要影響[1]。光照過強易導致動物視覺損傷,雌鼠作窩差,有時出現(xiàn)哺乳不良甚至吃仔,導致仔鼠成活率低,而光照過弱則動物性周期不穩(wěn)定[2-3]。因此動物飼養(yǎng)室內的光照環(huán)境是動物飼養(yǎng)和研究中的一個重要變量,科學家和設施管理人員都需要了解光照對實驗動物的影響,以改善動物飼養(yǎng)設施和實驗室設施的照明,使動物處于最佳健康與生殖狀態(tài),利于動物福利。實驗大小鼠是生物醫(yī)學研究的常用動物,有報道稱小鼠和大鼠約占美國生物醫(yī)學研究動物的95%[4]。本文綜述了光照對不同品系大小鼠繁殖性能的影響,對大小鼠飼養(yǎng)設施的光照方式進行思考討論和展望。

1 大小鼠設施光照要求及現(xiàn)狀

NIH《實驗室動物護理和使用指南》(第八版)建議,距地面約1 m的光照度約400 Lx,一般已足夠應用于動物的飼養(yǎng)管理,且不會引起白化大鼠的光毒性視網(wǎng)膜病的臨床癥狀[5]?！?00 Lx時則會引起 SD 大鼠視網(wǎng)膜光損傷[6]。日本實驗動物設施標準規(guī)定,在室內中央距地面40～85 cm處光強度為150～300 Lx[2]。這些與國內的光照標準有所不同,目前中國國家標準規(guī)定大小鼠生產(chǎn)間和實驗間的工作光照強度以≥200 Lx為宜,動物照度為15～20 Lx。中國各地方標準與國標基本相同。通常動物操作人員工作時開工作照明,工作結束后只留動物照明,因此國內實驗動物在明周期內所處的光照環(huán)境實際上一半為工作照明的強度即≥200 Lx,一半為動物照明的強度即15～20 Lx,或兩種強度時間比例不確定。國標對于光照節(jié)律的規(guī)定為12 h明/12 h暗或10 h明/14 h暗,而Jackson實驗室的操作指南中推薦光照節(jié)律為14 h明/10 h暗[7],它們認為這對動物發(fā)情是有利的。目前國內多數(shù)實驗動物設施設置的光照節(jié)律為12 h明/12 h暗,關于節(jié)律與動物繁殖性狀的關系未見到更多的不同結論。不同的飼養(yǎng)環(huán)境及設施條件會對相同品系的實驗動物產(chǎn)生不同的影響。有許多因素可影響動物對光照的需求,在確定室內飼養(yǎng)動物照明水平時應當注意這些因素,其中包括光照度、光線波長、光照時間、動物的光照經(jīng)歷、動物的體表色澤、晝夜節(jié)律、動物的體溫、激素水平、年齡、種類、性別和品系等[5]。很可能光照、食物、水以及溫度等因素都影響實驗動物大小鼠的繁殖,但在這些變量中光照條件最難控制,也最容易被忽視。

2 光照時間及晝夜節(jié)律對大小鼠繁殖的影響

哺乳動物的生理和行為都受到下丘腦視交叉上核相關的中樞及外部生物鐘控制系統(tǒng)調節(jié),該系統(tǒng)是由視網(wǎng)膜感知光信號從而調節(jié)晝夜節(jié)律,晝夜節(jié)律時鐘系統(tǒng)整合到下丘腦-垂體-性腺軸中,調節(jié)激素基因表達、激素分泌以及生殖系統(tǒng)中的生物節(jié)律[8-9]。松果體分泌的褪黑素(melatonin)在該過程中起到關鍵的作用,褪黑素的分泌呈晝夜變化,暗周期中分泌較多,作用于下丘腦并抑制垂體釋放促性腺激素。光周期中褪黑素分泌少,可促進促性腺激素的分泌[10-11]。許多野生動物、家養(yǎng)動物及實驗動物,都是季節(jié)性繁殖動物,這意味著它們的繁殖狀態(tài)取決于光照的持續(xù)時間以及由此產(chǎn)生的褪黑素[12]。然而,實驗小鼠的繁殖狀態(tài)不會隨著日照長度的變化而出現(xiàn)季節(jié)性變化[13],有研究指出野生小鼠和一些野生來源的近交系小鼠的松果體中有褪黑素,但一些實驗室小鼠的近交系(例如C57BL/6J)的松果體中檢測不到褪黑素。遺傳分析表明,C57BL/6J小鼠的褪黑激素缺乏是由兩個獨立分離的常染色體隱性基因n-乙酰轉移酶(NAT)和羥基吲哚-O-甲基轉移酶(HIOMT)突變引起的,經(jīng)檢測C57BL/6J小鼠的松果體中這兩種酶活性均缺失[14]。隨后Goto等[15]對 36個近交品系小鼠的研究表明,除CBA/Ms、C3H/He、Mol-A、Mol-Nis、MOM 5個近交品系的松果體褪黑素含量夜間高,白天低,其他31個品系包括BALB/c和C57BL/6J均缺乏褪黑素。即便如此,光照仍然可以影響這些動物的晝夜節(jié)律及繁殖相關性狀,晝夜節(jié)律紊亂的老鼠能夠有規(guī)律的交配周期,但是其中一些是不育的(如BMAL1 KO小鼠)[16],這就是說對于多數(shù)近交系小鼠而言光照不能直接通過影響褪黑素的分泌調節(jié)其生殖,但能夠通過影響晝夜節(jié)律而間接影響其繁殖性能。

不同品系的大小鼠對于光照長度也有不同的適應性,有研究指出半屏障系統(tǒng)內每天給予KM小鼠14 h 光照,其體質量和部分生殖器官重量以及雌鼠繁殖能力都明顯高于10 h 光照組。也有數(shù)據(jù)顯示8和12 h光照長度裸鼠的平均育成率和離乳育成率均高于16 h光照組,而不同的光照長度對裸鼠生長發(fā)育無顯著影響,因此作者認為中光照和短光照更加適合裸鼠的繁育[17]。而對大鼠的研究則顯示,神經(jīng)系統(tǒng)完好的SD大鼠(30～110日齡)暴露在8 h/d和16 h/d的光照下,其生殖系統(tǒng)、交配行為和后代數(shù)量不受光照暴露時間的影響,但短光照組大鼠的體質量、睪丸、精囊重量及血漿睪酮水平顯著降低[18],這表明過短的光照可能影響大鼠的生長發(fā)育。對于長期飼養(yǎng)的種群來說,這也可能影響后續(xù)的生殖器官等性狀的遺傳,不利于種群的質量保持。也就是說實驗大鼠在合適的光照周期條件下才能具有最佳的生殖能力和種群延續(xù)。

因此在動物繁育設施中有條件做到不同品系分開不同的房間飼養(yǎng)時,可以將房間的照明節(jié)律按照不同品系的最適節(jié)律來進行調整,以保證繁育的最佳狀態(tài)。而在實驗設施中通常很難做到某個房間只放置單一品系的實驗大小鼠,但可考慮設置遮擋簾布等用于分區(qū)飼養(yǎng),當然這可能會增加勞動和照明設置的復雜度,不過分區(qū)飼養(yǎng)是值得嘗試的方法。

3 光線波長對大小鼠繁殖的影響

小鼠視網(wǎng)膜包含三種視覺色素:桿狀視蛋白,最大靈敏度為498 nm;中波長視蛋白,最大靈敏度為508 nm;紫外視蛋白,最大靈敏度約為360 nm,因此小鼠對紫外線更加敏感,對600 nm的紅光不太敏感,但這并不意味著老鼠不能探測到這樣的光,在紅光足夠明亮的條件下,老鼠依然能夠對這種長波長的刺激做出反應[19]。目前,動物設施的照明已從熒光燈為主過渡到固態(tài)LED照明,LED照明的優(yōu)勢在于其節(jié)能、產(chǎn)熱少,而且不需要頻繁更換燈泡[6],其光譜更多的出現(xiàn)在可見光譜的藍色部分(波長465～485 nm)[1]。動物內在光敏性視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞(ipRGCs)暴露在波長約480 nm的藍光下反應最大,而對長波長的紅色光反應最小[20-21],并且動物設施中所使用的光的波長也會影響動物的生理變化和生物節(jié)律。研究者發(fā)現(xiàn)大鼠在藍色的鼠籠中暴露于冷白色熒光(與透明的鼠籠相比)后,夜間血液褪黑素水平的峰值振幅要高出6倍以上,且對動物的健康與福利相關參數(shù)有積極影響[22]。也有研究表明近交系小鼠在紅色光譜,光照強度15 Lx,光周期12 h明/12 h暗環(huán)境下,受孕率提高20%左右[23]。這樣看來一些特殊的光線波長設置對大小鼠的繁殖性能是有利的,如果要將這些實驗結果應用于實際生產(chǎn)中,可能還需要精準的時間和條件控制以及多方面的因素考慮,但值得思考的是,這樣生產(chǎn)出的實驗動物再用于節(jié)律相關實驗和光感實驗時是否會對實驗結果有較大的影響。實驗動物終歸是為了服務于實驗,其繁育性能的提升固然重要,但其自身的固有屬性、特點及穩(wěn)定性應該是更為重要的。

目前認為在大小鼠圍產(chǎn)期夜間消除所有光照對動物福利和實驗數(shù)據(jù)以及繁育單位所關注的繁殖指標較好且易于操作,但對于研究人員來說有時會不可避免的在暗周期進行實驗,或者繁育設施有些也會進行夜間巡查,這種情況下利用昏暗的紅光可能是維持實驗動物晝夜節(jié)律的有效選擇,因此目前在動物設施的建造設計中通常會安裝紅光燈,然而我們也應意識到,紅色的燈泡并不一定只發(fā)出紅色光譜中的光,因此,在動物設施使用之前,應先用光度計確定各種光源的光譜。

4 其他因素對大小鼠繁殖的影響

首先,許多光污染可能對大小鼠的繁殖性能產(chǎn)生影響,研究表明在動物的暗周期有必要保持絕對的黑暗,雖然老鼠的視力極差,但僅僅0.2 Lx的光照即可以改變其晝夜節(jié)律[24]。嚙齒動物通常在夜間繁殖,正常的晝夜節(jié)律和褪黑激素信號可以保證較高的群體繁殖力[4]。而夜間暴露在光照下(即使是昏暗的光線)可以改變嚙齒動物夜間活動的時間,并將覓食的時間轉移到白天。長時間夜間光污染可造成雌性大鼠發(fā)情周期紊亂、雄激素分泌、卵泡發(fā)育及排卵異常[25]。急性光照會顯著增加皮質酮水平[26],從而增加動物壓力水平,而孕鼠受到壓力事件刺激會導致仔鼠出生體質量偏低,繁殖力下降[28]。在實際生產(chǎn)中大家可能會忽略許多常見的光污染,如電源指示燈、通風設備控制屏上的燈、生物安全柜的顯示屏以及小型電子設備等。目前國產(chǎn)多個品牌IVC設備在使用期間工作人員未操作時能夠保持屏幕休眠狀態(tài),這是很好的設計及解決方式,而對于上述的其他小光源來說,用簡單的物理遮擋都可實現(xiàn)。此外,動物飼養(yǎng)室通常設有觀察窗,目前國內一些設施使用紅膜進行遮擋,這能夠很大程度上減少走廊光線對動物的影響,但仍無法完全避免走廊照明帶來的光污染,對此,有研究[28]認為可以將房間設計一個前廳或者在室外門外安裝了一個遮光簾,均可將光污染降低到無法檢測到的水平?？梢燥@著減少黑暗周期中的光污染。

另外,異常的明暗周期特別是極端的異常情況如持續(xù)光照、持續(xù)黑暗或者明暗周期反轉,可導致孕鼠體質量增長較緩慢,仔鼠體質量較輕,孕鼠早產(chǎn)、并影響小鼠卵母細胞的成熟和激活能力[29-30]。持續(xù)的黑暗條件可抑制大鼠的生殖過程使卵巢重量減輕,持續(xù)光照則導致大小鼠出現(xiàn)永久性陰道角化,多數(shù)卵泡達到排卵前期但不形成黃體[3]。大鼠在妊娠期暴露在持續(xù)的光線下會損害成年期雄性后代的生殖系統(tǒng),發(fā)生睪丸組織病理學損傷和體視學改變[31]。因此實驗或繁育設施內應盡量避免異常光照周期、急性光照以及不必要的光污染。

此外籠子的放置位置及籠子的材料也會對動物接收到的光照產(chǎn)生較大影響,有研究認為頂層籠子的光照是底層籠子的3～19倍[32],這是較大的差異,在慢性毒性研究中由于籠子位置的不同,BALB/c小鼠和Fischer 344大鼠視網(wǎng)膜病變的產(chǎn)生顯著差異[33-34]。KM小鼠在SPF環(huán)境的繁殖群中透明盒開放式飼養(yǎng),其產(chǎn)仔數(shù)、離乳數(shù)及乳鼠成活率均高于琥珀色IVC籠具飼養(yǎng)的個體,其原因可能跟IVC光照不足密切相關,具體原因包括琥珀色籠盒的透光度低、高壓次數(shù)增加導致籠盒透明度降低、多層疊加降低透光度以及盒蓋遮擋水瓶飼料添加遮擋等[35]。這些研究表明,籠子的位置可以顯著影響動物數(shù)據(jù),在研究中應考慮到這一因素[4]。同時不同顏色的標準鼠籠的光譜透射率顯著影響大小鼠的晝夜節(jié)律、生理、代謝和生殖[36-38]。

因此,實驗動物設施建造及動物飼養(yǎng)時也應同時考慮到光污染、籠子位置及籠盒顏色等情況,實驗動物設施負責人及科研員應掌握準確的光照數(shù)據(jù),包括不同層的籠子內部光照強度,因為不同品牌和型號IVC籠盒材質和顏色也不盡相同,為了穩(wěn)定的控制管理光照,建議同一設施最好采購同一品牌的同一材質籠盒,并在籠盒老化后及時更換新籠盒或者增加光照。

5 大小鼠設施光照設置的思考及展望

隨著科學的進展,人們不斷發(fā)現(xiàn)以前沒有意識到的一些實驗變異來源,可能影響實驗結果的可重復性[39]。許多研究論文沒有提供任何關于動物設施照明數(shù)據(jù),只是暗示在默認范圍內,然而現(xiàn)實中不同國家、地域、機構等默認的光照度指導規(guī)范卻不盡相同,相信這也對很多實驗的可重復性帶來了一定的困難,尤其是神經(jīng)及內分泌相關的研究。而對于大小鼠繁育機構,相互間的交流度較低,對于群體繁育數(shù)據(jù)的影響因素分析及論文較為少見,這對于提升大小鼠飼養(yǎng)繁殖質量、效率及解決工作中的問題是不利的。因此建議:①國家及地方標準對于光照的要求中增加更多不同品種和品系的細節(jié)規(guī)定及研究數(shù)據(jù);②繁育單位間增加技術交流,重視群體數(shù)據(jù)的分析及發(fā)表;③研究人員在今后的論文撰寫中標明動物設施的光照設置,這樣也會增加結果的可重復性。

針對目前設施都會涉及到的光照分布不均勻問題,有繁育人員提出可把IVC籠架設計成“階梯型”[35]。在空間充足的情況下這是很好的建議,但實際生產(chǎn)中的大部分地區(qū)設施空間有限,因此對該設計也存在一定的限制性。國產(chǎn)某品牌的EVC籠架沿著架子縱向設置了氛圍燈,并且會不停的變色,這種在架子上添加縱向光照的設計確實是改善光源平均分布的好辦法,但不停變色的設計可能并不一定能對大小鼠起到積極的作用,這種方案的應用可能還需要進一步的實驗驗證。我們認為對于底層籠架光照較低的問題可以在動物設施設計之初讓專業(yè)人員設計墻壁上及地面上的燈帶,同時降低單一來自頭頂?shù)墓庠磸姸?使整個房間光線分布均勻。對于已建造好的設施可以在兩個IVC籠架間或者地面上增加幾處可移動光源來補充低層籠架光照的不足,但這樣的補充可能也會帶來一定的麻煩,如占用工作空間以及增加了房間熱源,需重新調整空調溫度等,這可能需要多次實驗及驗證工作才能用于設施運行,不過這是補充光源最簡便的思路。

無論是動物實驗設施還是繁育設施,除必要的物理環(huán)境外對動物帶來較大影響的應是工作人員,因此對工作人員的培訓和教育、制訂明確的光照度操作規(guī)程很重要,要認識到突然開燈對動物帶來的損害以及對動物繁殖的干擾,飼養(yǎng)及技術人員應盡量在動物的光周期內完成相應的工作,在工作結束后遮擋多余光源。改善光照條件,合理分布光源,提高工作人員對光照的知識,有利于提升動物健康、生殖及福利。關于照明對實驗動物視覺影響的研究有些已經(jīng)較深入,但如何改善設施建設,控制照明平均分布以及照明對實驗動物生長繁殖的影響,還需更多的研究與實踐驗證。