王云鷺，李錫勇，劉倫，張鵬，韓鵬飛，李曉東*

(1.長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院研究生院，山西 長(zhǎng)治 046000；2.長(zhǎng)治市第二人民醫(yī)院骨科，山西 長(zhǎng)治 046000；3.長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院附屬和平醫(yī)院骨科，山西 長(zhǎng)治 046000)

據(jù)流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)[1]，前交叉韌帶(anterior cruciate ligament，ACL)損傷的發(fā)病率約為每年20萬(wàn)例，若未及時(shí)治療，患側(cè)膝關(guān)節(jié)易反復(fù)扭傷，進(jìn)而引起關(guān)節(jié)軟骨和半月板等解剖結(jié)構(gòu)的損傷和退變，導(dǎo)致創(chuàng)傷性膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生。根據(jù)形態(tài)學(xué)的特點(diǎn)可將ACL損傷分為3級(jí)，1級(jí)：韌帶的完整性良好；2級(jí)：韌帶的連續(xù)性部分中斷；3級(jí)：韌帶的連續(xù)性完全中斷。其中3級(jí)ACL損傷可導(dǎo)致膝關(guān)節(jié)嚴(yán)重不穩(wěn)定，需要及早一期重建和恢復(fù)膝關(guān)節(jié)穩(wěn)定性，而前交叉韌帶重建術(shù)(anterior cruciate ligament reconstruction，ACLR)是目前ACL損傷或完全斷裂的最佳術(shù)式之一。目前，每年進(jìn)行ACLR手術(shù)患者例數(shù)為6～10萬(wàn)例，其中，大多數(shù)研究報(bào)道目前ACL移植術(shù)后的移植失敗率在0.7%～14%之間[2]。有證據(jù)表明，愈合不良可能是ACLR失敗的主要影響因素之一。van Eck等[3]的一項(xiàng)研究表明，在單束ACLR術(shù)后行翻修手術(shù)時(shí)最常見(jiàn)的ACL斷裂部位是在近端，其次是中段，并且將ACL移植失敗的原因歸結(jié)為手術(shù)技術(shù)、再發(fā)創(chuàng)傷以及移植物不愈合[4]。Group等[5]一個(gè)多中心前瞻性研究，也得到了類(lèi)似的結(jié)論。由于手術(shù)技術(shù)[6]和康復(fù)方法的進(jìn)步[7]，當(dāng)ACLR術(shù)后沒(méi)有再發(fā)創(chuàng)傷性事件卻依然發(fā)生移植物失敗時(shí)，應(yīng)考慮移植物愈合的問(wèn)題。因此，需要更好地理解ACLR生物愈合的過(guò)程。

ACLR術(shù)后移植物愈合過(guò)程通常被分為3個(gè)階段，即早期愈合、浸潤(rùn)增殖和基質(zhì)重塑[8]。移植物早期愈合階段以移植物壞死和細(xì)胞缺乏為特征，沒(méi)有任何明顯的血運(yùn)重建，隨后是細(xì)胞浸潤(rùn)最密集的增殖階段，最后是緩慢的基質(zhì)重塑階段。理想化的ACLR肌腱移植在骨隧道內(nèi)牢固愈合的同時(shí)，需要術(shù)后盡快在關(guān)節(jié)內(nèi)區(qū)域達(dá)到完全“韌帶化”，從而促進(jìn)早期功能鍛煉和快速康復(fù)。因此，如何增強(qiáng)肌腱移植物的愈合對(duì)于ACLR成功與否至關(guān)重要[9]。然而，盡管多年來(lái)，不同的研究嘗試通過(guò)多種生物調(diào)節(jié)方式，以改善移植物的愈合，但是僅觀察到Sharpey纖維通過(guò)纖維軟骨區(qū)，并未獲得真正骨隧道完全閉合和骨化，以及移植物關(guān)節(jié)內(nèi)區(qū)域的“韌帶化”等臨床結(jié)果。

1 移植物的愈合過(guò)程

移植物愈合過(guò)程是炎癥反應(yīng)、移植物壞死、血運(yùn)重建、細(xì)胞再生、骨長(zhǎng)入、膠原重塑和韌帶化等多種生物事件的組合，并可被大致分為三個(gè)不同的階段：即早期愈合、浸潤(rùn)增殖和基質(zhì)重塑階段。

1.1 早期愈合階段 有研究表明，ACLR術(shù)后早期細(xì)胞反應(yīng)涉及宿主炎癥細(xì)胞(中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)的招募和炎癥因子(如白細(xì)胞介素-6、腫瘤壞死因子-α、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β)的釋放。移植物植入后不久，基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)-1、MMP-13水平升高，在消化膠原蛋白的同時(shí)幫助再生的細(xì)胞浸潤(rùn)。同時(shí)，研究人員一致認(rèn)為ACLR移植物早期愈合階段中心部分易發(fā)生缺血性壞死，導(dǎo)致一些細(xì)胞因子被釋放并啟動(dòng)生長(zhǎng)因子的級(jí)聯(lián)。與隧道內(nèi)部分不同，移植物關(guān)節(jié)內(nèi)部分暴露在滑液中，而滑液中含有大量的催化酶、細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子抑制劑，會(huì)進(jìn)一步干擾愈合過(guò)程。這些變化可能導(dǎo)致早期愈合階段缺血壞死、膠原紊亂(崩解或碎裂)、黏液樣變性，如果持續(xù)下去，可能導(dǎo)致移植物愈合失敗。因此，充分了解ACLR術(shù)后早期愈合階段的細(xì)胞和生化反應(yīng)是很重要的。目前，臨床上大多在ACLR術(shù)后立即給予患者環(huán)氧化酶(cyclooxygenase，COX)-2抑制劑或非甾體抗炎藥(nonsteroidal anti-inflammatory drug，NSAID)，在減少術(shù)后的疼痛和腫脹癥狀的同時(shí)，避免移植物早期愈合階段不良因素的影響[10]。

1.2 浸潤(rùn)增殖階段 由于ACL移植物在植入后會(huì)發(fā)生壞死，因此充分的血運(yùn)重建對(duì)移植物愈合過(guò)程中細(xì)胞再生和隨后的基質(zhì)重塑至關(guān)重要。研究人員已經(jīng)證實(shí)了自體移植物的血供和血管重建在維持移植物活力方面的重要性[11]。而血管重建早在植入后3周就完成了，甚至浸潤(rùn)到自體移植物的中心部位[11]。這提示新生的血管可能是從滑膜和髕下脂肪墊發(fā)育而來(lái)，因此在手術(shù)中保留這些組織是非常必要的。也有證據(jù)表明[12]，與標(biāo)準(zhǔn)ACLR相比，術(shù)中保留原有ACL殘端，術(shù)后患者膝關(guān)節(jié)穩(wěn)定性更好，臨床結(jié)果也更好。本體感受信息通過(guò)肌肉、肌腱和關(guān)節(jié)中的感受器記錄，本體感覺(jué)提供有關(guān)身體部位、身體在空間中的位置和運(yùn)動(dòng)情況以及運(yùn)動(dòng)條件變化的信息。ACL本身不僅具有其生物力學(xué)功能，而且還具有一定的本體感覺(jué)功能。與不保留殘端的ACLR相比，保留殘端可最大化保留ACL組織，使殘端包裹移植物的同時(shí)，加快移植物的血運(yùn)重建，更好地封閉骨隧道，減少滑液進(jìn)入導(dǎo)致的骨隧道擴(kuò)大，從而促進(jìn)移植物肌腱-骨之間的愈合，更利于本體感覺(jué)和術(shù)后膝關(guān)節(jié)功能的恢復(fù)。另外，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表達(dá)與重建后血管密度的高低有關(guān)，而在體內(nèi)觀察到VEGF的產(chǎn)生可能是由肌腱移植物的炎癥反應(yīng)引起的[13]。

1.3 基質(zhì)重塑階段 骨隧道的微環(huán)境類(lèi)似于骨折的環(huán)境，而骨隧道壁的變化也與軟骨內(nèi)成骨的過(guò)程相似。有研究表明，骨長(zhǎng)入在移植物骨愈合過(guò)程中起著重要的作用，骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP；BMP-2、BMP-7)特異性地參與了導(dǎo)致骨長(zhǎng)入和骨整合的基質(zhì)重塑過(guò)程[14]。一些研究已經(jīng)證實(shí)，除BMP-2、BMP-7以外，骨傳導(dǎo)劑如鈣-磷酸鹽骨水泥以及破骨細(xì)胞抑制劑也已被認(rèn)為可用于改善肌腱移植周?chē)巧L(zhǎng)的潛在應(yīng)用[15]。

在上述整個(gè)愈合過(guò)程中，Smith等[16]通過(guò)進(jìn)行前抽屜試驗(yàn)，隨訪觀察ACLR使用同種異體脛前肌肌腱移植術(shù)后12個(gè)月中每月膝關(guān)節(jié)松弛度的增加情況。結(jié)果顯示，術(shù)后6個(gè)月時(shí)膝關(guān)節(jié)松弛度增量最大，這與移植物骨愈合過(guò)程的時(shí)間軸(早期愈合階段結(jié)束和浸潤(rùn)增殖階段開(kāi)始之間)吻合。而在浸潤(rùn)增殖后期和隨后的基質(zhì)重塑期，膝關(guān)節(jié)松弛度并沒(méi)有再增加。因此，根據(jù)3個(gè)不同的階段(早期愈合、浸潤(rùn)增殖和重塑成熟)和2個(gè)不同部位(關(guān)節(jié)內(nèi)部分和骨隧道部分)出現(xiàn)不同的宿主和移植物反應(yīng)，從反應(yīng)發(fā)生的時(shí)間和地點(diǎn)上更好地理解和區(qū)分移植物愈合過(guò)程，對(duì)于理解和促進(jìn)ACLR移植物愈合等相關(guān)研究大有裨益。

在早期愈合階段，宿主的炎癥反應(yīng)和移植物的細(xì)胞壞死在ACLR術(shù)后立即發(fā)生。在下一階段浸潤(rùn)增殖的過(guò)程中，根據(jù)移植物周?chē)沫h(huán)境，不同類(lèi)型的細(xì)胞被招募到骨隧道內(nèi)(成骨細(xì)胞)和關(guān)節(jié)內(nèi)(成纖維細(xì)胞)。這些細(xì)胞通過(guò)新生血管重新浸潤(rùn)填充壞死的移植物組織以獲得營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)。隨后的重塑成熟階段，這些再生細(xì)胞在機(jī)械負(fù)荷和生物化學(xué)的影響下，介導(dǎo)移植物不同區(qū)域(骨隧道內(nèi)的肌腱-骨界面愈合和關(guān)節(jié)內(nèi)區(qū)域的韌帶化)內(nèi)的基質(zhì)重塑過(guò)程。

與ACLR術(shù)后移植物愈合的傳統(tǒng)概念相反，作者強(qiáng)調(diào)移植物周?chē)h(huán)境的區(qū)域性差異影響了基質(zhì)重塑過(guò)程。因此生物調(diào)節(jié)也應(yīng)針對(duì)有利于細(xì)胞再生或基質(zhì)重塑方面進(jìn)行研究，以盡可能恢復(fù)ACL的原始生物學(xué)功能。

2 移植物愈合的生物調(diào)節(jié)

2.1 自/異體移植物的愈合差異 自體肌腱具有優(yōu)異的生物力學(xué)特性，其結(jié)構(gòu)更接近于健康A(chǔ)CL的解剖結(jié)構(gòu)，具有較強(qiáng)的固定強(qiáng)度。隨著肌腱-骨愈合過(guò)程的進(jìn)行，骨在骨隧道內(nèi)逐漸與移植肌腱相結(jié)合，同時(shí)在肌腱與骨之間形成膠原纖維，這些纖維類(lèi)似于正常固定在肌腱-骨之間的Sharpey纖維，使肌腱牢固固定于骨上。肌腱-骨經(jīng)過(guò)24周后組織上顯示正常的過(guò)渡帶，提示移植物愈合[17]。肌腱-骨連接處的力學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，12周內(nèi)兩者之間的結(jié)合強(qiáng)度逐漸增加，此后肌腱-骨連接處的強(qiáng)度停止增加[17]。

由于ACL具有特殊的膠原纖維排列及卷曲結(jié)構(gòu)、獨(dú)特的起止點(diǎn)幾何外形及韌帶-骨移行區(qū)，異體肌腱移植后只能部分恢復(fù)ACL的功能。異體肌腱在移植后4～6周內(nèi)發(fā)生滑膜樣變過(guò)程，其中移植物內(nèi)的缺血帶發(fā)生缺血壞死，而新生血管化的滑膜組織則包裹著移植物[18]。在缺血壞死和血運(yùn)重建階段，移植物膜樣組織為其血運(yùn)重建提供來(lái)源，從髕下脂肪墊和滑膜穿出的骨血管為其血運(yùn)重建提供支架，異體肌腱在骨隧道內(nèi)經(jīng)歷韌帶化過(guò)程，通過(guò)致密結(jié)締組織固定在骨隧道壁上，最終移植物愈合[17]。盡管異體肌腱的血運(yùn)重建過(guò)程需要20周，但由于異體肌腱具有免疫原性，與自體肌腱相比具有相應(yīng)較長(zhǎng)的炎癥期過(guò)程，其重塑過(guò)程則需要更長(zhǎng)時(shí)間(大于自體肌腱移植物愈合的24周)[18]。

2.2 生物調(diào)節(jié)部位 間充質(zhì)干細(xì)胞、生長(zhǎng)因子、生物材料和物理干預(yù)等這些生物調(diào)節(jié)方式或物質(zhì)已被多項(xiàng)研究報(bào)道，應(yīng)用于改善ACLR術(shù)后移植物的愈合結(jié)果，且絕大部分靶向作用于骨隧道區(qū)域內(nèi)的肌腱-骨界面愈合[19]。然而據(jù)臨床報(bào)道，ACLR移植物斷裂最常發(fā)生部位在股骨插入處，其次是關(guān)節(jié)內(nèi)中間區(qū)域[3]。動(dòng)物研究也顯示出同樣的結(jié)果[20]。ACL重建成功與否取決于移植物和骨隧道之間的愈合過(guò)程。早期愈合過(guò)程中的薄弱環(huán)節(jié)是骨和肌腱之間的附著部位(肌腱-骨界面)，纖維血管組織在移植物和骨隧道內(nèi)壁之間的界面處形成，膠原纖維隨后附著在肌腱-骨界面處，肌腱和骨骼通過(guò)特征錨定纖維(Sharpey樣纖維)直接連接。移植物的缺氧狀態(tài)可能導(dǎo)致潛在的骨隧道增寬和移植物松弛，限制康復(fù)和恢復(fù)活動(dòng)。肌腱-骨愈合在ACL重建中界面的整合過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。因此，需要更多關(guān)注如何通過(guò)調(diào)節(jié)生物事件來(lái)改善移植物關(guān)節(jié)內(nèi)中間部分的愈合效果。

2.3 生物調(diào)節(jié)的理想化目標(biāo) 移植物模擬天然ACL的力學(xué)強(qiáng)度作為影響ACLR手術(shù)最重要的結(jié)果之一，學(xué)者們總是在努力但從未達(dá)到過(guò)理想化目標(biāo)。McFarland等[21]建立的犬ACLR模型，術(shù)后4個(gè)月的移植物強(qiáng)度僅為天然對(duì)照組的40%。Ng等[22]檢測(cè)了山羊ACLR術(shù)后3年的生物力學(xué)數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示移植物的強(qiáng)度和剛度分別僅為天然ACL的44%和49%。Clancy等[23]對(duì)恒河猴ACLR模型的研究顯示，肌腱移植物的抗拉強(qiáng)度約為轉(zhuǎn)移前的80%。而Fu等[20]在大鼠、Blickenstaff等[24]在新西蘭白兔等動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)，與天然ACL相比，ACLR移植物的強(qiáng)度僅為20%左右。

2.4 生物調(diào)節(jié)措施 以細(xì)胞補(bǔ)充為例，移植物愈合的增殖階段是通過(guò)移植物中的細(xì)胞浸潤(rùn)和再生來(lái)完成的。為了增強(qiáng)細(xì)胞再生，既往研究使用了間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSC)、脂肪源性干細(xì)胞(adipose derived stem cells，ADSC)、ACL源性細(xì)胞、滑膜細(xì)胞和骨膜祖細(xì)胞，并研究了它們對(duì)ACLR移植物愈合的影響[25]。其中，最常用的干細(xì)胞生物調(diào)節(jié)方法是直接在關(guān)節(jié)內(nèi)區(qū)域和/或骨隧道內(nèi)注射或包埋入纖維蛋白膠中[25]。而Hur等[26]的研究表明，與直接注射或纖維蛋白膠技術(shù)相比，細(xì)胞薄片技術(shù)是一種更優(yōu)越的將干細(xì)胞輸送到ACLR移植物的操作技術(shù)。此外，為了實(shí)現(xiàn)愈合過(guò)程中生長(zhǎng)因子的持久和穩(wěn)定的表達(dá)，學(xué)者們還將基于干細(xì)胞的基因治療引入了ACLR愈合相關(guān)研究中[27]。VEGF是一種內(nèi)皮有絲分裂原，可促進(jìn)血管生成，增加血管通透性，并在ACLR術(shù)后早期促進(jìn)肌腱-骨纖維整合。從間充質(zhì)組織(即骨髓)獲得的MSC可以分化為再生不同組織(如骨、軟骨、肌腱、韌帶和脂肪)所需的各種細(xì)胞類(lèi)型(即成骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞)。生長(zhǎng)因子也顯示出能夠調(diào)節(jié)和改善細(xì)胞增殖、分化和基質(zhì)沉積，并影響MSC分化為成纖維細(xì)胞以修復(fù)撕裂的韌帶。生長(zhǎng)因子對(duì)改善ACL愈合所需的各種生物過(guò)程顯示出積極作用。通過(guò)自分泌或旁分泌作用靶向細(xì)胞的MSC的增殖，增強(qiáng)了骨誘導(dǎo)并最終促進(jìn)了肌腱-骨愈合。

3 移植物愈合的監(jiān)測(cè)技術(shù)

3.1 核磁共振(magnetic resonance imaging，MRI) 在臨床上，MRI是最常用的監(jiān)測(cè)ACLR術(shù)后移植物愈合過(guò)程的影像學(xué)技術(shù)。Howell等[28]進(jìn)行了一項(xiàng)前瞻性研究，連續(xù)觀察ACL自體移植物術(shù)后1年的MRI表現(xiàn)。結(jié)果顯示，MRI移植物信號(hào)增強(qiáng)具有時(shí)間依賴(lài)性，移植術(shù)后3個(gè)月形態(tài)良好，術(shù)后1年時(shí)MRI信號(hào)增強(qiáng)，且被認(rèn)為與移植物水腫有關(guān)。另外，通過(guò)T1加權(quán)像下給藥Gd-DPTA造影劑后MRI增強(qiáng)掃描來(lái)評(píng)估移植物血運(yùn)重建程度，結(jié)果顯示盡管韌帶周?chē)浗M織血管豐富，但ACL移植物在植入2年期間沒(méi)有明顯的血供[29]。然而，Li等[30]評(píng)估了ACL移植物的MRI信號(hào)/噪聲系數(shù)(signal/noise quotient，SNQ)，在術(shù)后3、6和12個(gè)月以及9年ACLR移植物SNQ值與術(shù)后時(shí)間呈顯著負(fù)相關(guān)。如上所述，由于廣泛異質(zhì)性的存在，各項(xiàng)移植物愈合的MRI研究結(jié)果存在很大差異，未來(lái)需要進(jìn)一步客觀定量研究移植物愈合過(guò)程的MRI生物標(biāo)志物的出現(xiàn)。

3.2 計(jì)算機(jī)斷層掃描(computerized tomography，CT) 鑒于普通X線片通常難以可靠地識(shí)別和測(cè)量ACLR骨隧道的寬度，故CT已被推薦用于評(píng)估ACL移植物愈合過(guò)程中的骨隧道變化。Suzuki等[31]通過(guò)CT掃描對(duì)使用骨-髕腱-骨移植物進(jìn)行的ACLR手術(shù)評(píng)估，發(fā)現(xiàn)術(shù)后8周移植物幾乎完全融入股骨矩形隧道。Fink等[32]使用CT連續(xù)監(jiān)測(cè)ACLR術(shù)后2年內(nèi)骨隧道的變化過(guò)程，發(fā)現(xiàn)術(shù)后6周隧道變化明顯高于其他時(shí)間，而1年后隧道寬度基本穩(wěn)定。對(duì)于自體腘繩肌腱行ACLR，術(shù)后平均隨訪10個(gè)月，CT掃描顯示股骨隧道直徑增加3%，并可顯示硬化的隧道邊界。因此，隨著CT技術(shù)的不斷發(fā)展，其可以準(zhǔn)確地評(píng)估ACLR術(shù)后骨組織和軟組織的變化。

3.3 膝關(guān)節(jié)鏡復(fù)檢與組織活檢 由于MRI和CT等非侵入性方法可以獲得的移植物愈合信息仍然有限，ACLR術(shù)后的膝關(guān)節(jié)鏡復(fù)檢成為較可靠的移植物愈合監(jiān)測(cè)方式，能夠提供ACL移植物滑膜化和血管化等有價(jià)值的信息。Nakamae等[33]在ACLR術(shù)后18個(gè)月通過(guò)關(guān)節(jié)鏡復(fù)檢證實(shí)移植物的滑膜覆蓋范圍明顯改善。滑膜化在移植物愈合中起著重要作用，并被認(rèn)為對(duì)移植物的存活有積極的影響。此外，關(guān)節(jié)鏡還可通過(guò)獲取活檢樣本進(jìn)行組織學(xué)檢查來(lái)研究ACL移植物的愈合過(guò)程[34]。有研究表明[35]，ACLR術(shù)后6個(gè)月時(shí)移植物表面血流量明顯高于對(duì)照組，12個(gè)月時(shí)達(dá)到平穩(wěn)期，并保持與正常ACL相當(dāng)?shù)乃?。雖然膝關(guān)節(jié)鏡復(fù)檢與組織活檢可以顯示移植物愈合過(guò)程中滑膜、血管和其他組織水平的變化，但限于是一種侵入性技術(shù)，故不能作為常規(guī)手段對(duì)愈合過(guò)程進(jìn)行隨訪。

綜上所述，盡管通過(guò)三個(gè)階段(早期愈合階段、浸潤(rùn)增殖階段和基質(zhì)重塑階段)，以及宿主和移植物在兩個(gè)不同部位(關(guān)節(jié)內(nèi)和骨隧道內(nèi))的反應(yīng)，更清晰地描繪了ACLR移植物的愈合過(guò)程，但是如何更精確地在特定的時(shí)間段和部位通過(guò)生物調(diào)節(jié)發(fā)揮其在改善ACLR移植物愈合方面的潛力并獲得預(yù)期成果，未來(lái)仍需要更多高質(zhì)量的深入研究(精確調(diào)節(jié)愈合目標(biāo)階段)來(lái)進(jìn)一步印證并提供新的思路。