姚劉旭, 李玉紅, 蔣宗明

1.紹興市人民醫(yī)院 麻醉科，浙江 紹興 312000； 2.紹興文理學(xué)院 醫(yī)學(xué)院，浙江 紹興 312000；3.浙江樹人大學(xué)樹蘭國際醫(yī)學(xué)院附屬樹蘭(杭州)醫(yī)院 麻醉科，浙江 杭州 310004

結(jié)直腸癌(colorectal cancer, CRC)已經(jīng)成為世界上第三大常見的惡性腫瘤，病死率排名第二[1]。目前腫瘤診斷的金標(biāo)準(zhǔn)是組織活檢，但由于其有創(chuàng)性，患者依從性差，存在一定的局限性。而常用的兩種血液生物標(biāo)志物：癌胚抗原(carcinoma embryonic antigen, CEA)和碳水化合物抗原19-9(carbohydrate antigen 19-9, CA19-9)，由于敏感性和特異性不高，不是理想的早期診斷指標(biāo)[2]。因此，尋找敏感性及特異性更高的生物標(biāo)志物用于早期檢測CRC，提高患者的生存率具有重要意義。近年來，可重復(fù)的無創(chuàng)性檢查方法如液體活檢受到了研究者的廣泛關(guān)注。

液體活檢是對從生物液體中收集的各種類型的細胞和分子進行取樣和分析，分析的細胞和分子包括各種RNA、蛋白質(zhì)、肽、代謝產(chǎn)物和外泌體等，液體活檢可以獲得多種多樣的信息， 有助于不同疾病(包括癌)的診斷、預(yù)后，顯示出巨大的臨床潛力[3]。已有幾種類型的液體活檢證明了它們在CRC診斷、預(yù)后和治療預(yù)測中的潛在作用，如循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumor DNA, ctDNA)[4]。外泌體是存在于生物體液中的天然載體，其含量豐富，在循環(huán)中穩(wěn)定存在，包含多種生物活性物質(zhì)，可作為生物標(biāo)志物及治療靶點，既往研究已經(jīng)證實外泌體可在多種疾病中發(fā)揮不同的調(diào)控作用[5]。長鏈非編碼RNA(long-chain non-coding RNA，lncRNA)由于其常在包括惡性腫瘤在內(nèi)的各種疾病類型中發(fā)生表達改變，已經(jīng)成為近年來的研究熱點[6]。越來越多的研究顯示液體活檢中外泌體lncRNA可應(yīng)用于CRC早期診斷和預(yù)后的檢測。

本文中對外泌體lncRNA在CRC進展中發(fā)揮作用的分子機制，以及其在液體活檢中作為CRC生物標(biāo)志物的作用進行綜述，并探討外泌體在臨床應(yīng)用中存在的不足和挑戰(zhàn)。

1 外泌體和lncRNA簡介

胞外囊泡(extracellular vesicles, EVs)是存在于血液、唾液、尿液等生物液體中的細胞分泌的納米顆粒，具有細胞間通訊的作用[7]。外泌體是直徑<100 nm的胞外囊泡，含有多種生物活性物質(zhì)，主要是蛋白質(zhì)、核苷酸和脂類。這些生物活性物質(zhì)通過自分泌、旁分泌和內(nèi)分泌方式從供體細胞轉(zhuǎn)移到受體細胞，并發(fā)揮特殊功能。外泌體的磷脂雙層膜包裹外泌體中的多種生物活性物質(zhì)，避免其被細胞外液中的蛋白酶降解，使外泌體中生物活性物質(zhì)能夠被穩(wěn)定檢測[8]。外泌體可以保護其內(nèi)容物免受外界環(huán)境的影響。有些外泌體已顯示出單獨檢測CRC的早期診斷潛力，能夠作為CRC不良預(yù)后和化療耐藥預(yù)測的生物標(biāo)志物。

lncRNA是一個長度在200～10 000 nt的長鏈非蛋白編碼RNA家族，具有進化保守性，其表達受到嚴格調(diào)控，并能夠調(diào)控基因的表達[9]。作為最大的一類非編碼轉(zhuǎn)錄本，lncRNA具有廣泛的功能。通過與DNA、RNA和蛋白質(zhì)的不同相互作用，在染色體重構(gòu)[10]、組蛋白修飾[11]、DNA甲基化[12]等方面發(fā)揮著重要作用。LncRNA參與腫瘤發(fā)生和進展的各個階段，包括腫瘤發(fā)生的啟動、腫瘤細胞的增殖、凋亡和遷移、侵襲轉(zhuǎn)移、血管生成。lncRNA通過調(diào)控Wnt/catenin[13]、EMT[14]、AKT/mTOR[15]等多種致癌信號通路發(fā)揮作用?？傊?，lncRNA的表達改變影響了許多生物學(xué)功能，在腫瘤形成過程中起著關(guān)鍵作用。

2 外泌體lncRNA在CRC中的作用

2.1 UCA1促進CRC細胞的增殖、轉(zhuǎn)移、耐藥

lncRNA UCA1(urothelial carcinoma-associated 1, UCA1)與包括CRC在內(nèi)的多種疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。既往研究顯示UCA1在CRC患者血清外泌體中表達增高，通過外泌體轉(zhuǎn)移至CRC細胞，增強細胞的增殖和遷移能力。UCA1作為競爭內(nèi)源性RNA(ceRNA)，競爭結(jié)合miR-143調(diào)節(jié)肌球蛋白Ⅵ(myosin Ⅵ, MYO6)的表達，進而促進CRC的惡化[16]。然而有研究得出不一致的結(jié)論，UCA1在CRC患者的腫瘤組織中增高，血清外泌體中降低[17]。UCA1的不對稱分布可能是由于CRC細胞通過限制外泌體的分泌以減少UCA1形成。UCA1通過控制ceRNA網(wǎng)絡(luò)而成為CRC進展的RNA調(diào)節(jié)因子。在UCA1轉(zhuǎn)錄起始位點上游存在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(transcription factor-binding sites, TFBSs)，其中UCA1可以通過與轉(zhuǎn)錄因子CCAAT/增強劑結(jié)合蛋白(CCAAT/enhancer-binding protein beta,CEBPB)結(jié)合來控制轉(zhuǎn)錄。此外，UCA1還能與miRNA相互作用，保護mRNA不被降解，與mRNA 3′-UTRs結(jié)合提高mRNA的穩(wěn)定性，促進CRC細胞的增殖。UCA1可能參與化療耐藥，UCA1在西妥昔單抗耐藥的CRC細胞及其外泌體中表達明顯升高，外泌體可將UCA1從西妥昔單抗耐藥細胞轉(zhuǎn)移到敏感細胞，來自西妥昔單抗耐藥細胞的外泌體可將耐藥性傳遞給敏感細胞并改變敏感細胞的UCA1表達水平，導(dǎo)致敏感細胞對西妥昔單抗耐藥更大。UCA1在CRC進展期患者中的表達明顯高于部分緩解或完全緩解患者，血液中含有UCA1的外泌體可預(yù)測CRC患者西妥昔單抗治療的臨床結(jié)果，這說明外泌體lncRNA UCA1可作為CRC患者西妥昔單抗耐藥的分子標(biāo)志物[18]?？傊?，UCA1可用于CRC診斷、預(yù)后和耐藥的標(biāo)志物，亦可作為治療靶點，但關(guān)于外泌體中l(wèi)ncRNA UCA1在CRC中更多的作用機制還不完全清楚，需要進一步的臨床和基礎(chǔ)研究。

2.2 CRNDE促進CRC增殖和預(yù)后價值

lncRNA CRNDE[19](colorectal neoplasia differentially expressed, CRNDE)存在多個亞型，在正常結(jié)直腸組織中低表達，但在結(jié)直腸腺瘤和腺癌中均高表達。CRNDE-p是CRNDE的一個亞型，CRNDE-p和miR-217表達存在負相關(guān)，且高水平CRNDE-p引起CRC患者不良預(yù)后，CRC患者血清外泌體中CRNDE-p水平在化療前后發(fā)生改變，其中的潛在機制需要進一步的研究來闡明。外泌體CRNDE對CRC的診斷能力檢測顯示，其敏感性和特異性優(yōu)于CEA，具有作為CRC患者的診斷和預(yù)后標(biāo)志物的潛力。CRNDE-h是另外一種亞型，豐富存在于CRC外泌體中，CRNDE-h與RAR相關(guān)受體-γt(RAR-related orphan receptor, RORγt)結(jié)合，通過抑制其與E3泛素連接酶Itch的結(jié)合，抑制RORγt的泛素化和降解，以增加Th17(T helper 17)細胞比例、RORγt表達和IL-17啟動子活性，促進Th17細胞分化，進一步促進CRC細胞增殖[20]。

2.3 RPPH1促進CRC細胞增殖、轉(zhuǎn)移和診斷價值

lncRNA RPPH1(ribonuclease P RNA component H1, RPPH1)是核糖核酸酶P(RNase P)的RNA成分，在多種疾病中發(fā)揮作用。RPPH1在體內(nèi)外均可促進CRC轉(zhuǎn)移，RPPH1通過與miRNA β-Ⅲ微管蛋白(TUBB3)相互作用，誘導(dǎo)CRC細胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)。過表達或敲低CRC細胞來源的外泌體中RPPH1水平與親代細胞中變化一致。CRC細胞來源的外泌體將RPPH1轉(zhuǎn)運至巨噬細胞，介導(dǎo)巨噬細胞M2極化，巨噬細胞吞噬外泌體后，抗炎因子水平上升，促炎因子水平下降，通過增加循環(huán)腫瘤細胞(circulating tumor cells, CTCs)的數(shù)量進而促進CRC細胞的增殖和轉(zhuǎn)移。CRC患者手術(shù)前血清外泌體RPPH1水平較高，而腫瘤切除后則較低。與傳統(tǒng)的腫瘤標(biāo)志物CEA和CA199相比，CRC血清外泌體RPPH1具有更好的診斷價值(AUC=0.86)，有望成為新的治療靶點和診斷標(biāo)志物[14]。

2.4 H19促進CRC細胞的干性和耐藥性

lncRNA H19最初被定義為癌胚抗原轉(zhuǎn)錄本，在多種惡性腫瘤中發(fā)揮致癌作用。CRC患者成纖維細胞(CAFs)來源的外泌體中H19的水平高于相應(yīng)纖維母細胞(NFs)來源的外泌體，H19可從CAFs轉(zhuǎn)移到CRC細胞中并促進CRC細胞的干性。與NFs來源的外泌體相比，CAFs來源的外泌體catenin蛋白水平顯著提高，而敲除H19則catenin蛋白水平降低，且H19與miR-141存在相互作用，說明CAFs來源的外泌體中H19通過在CRC中作為miR-141的ceRNA，進一步激活Wnt/β-catenin通路。來自CAFs的外泌體能夠促進CRC細胞對奧沙利鉑的耐藥性，從而證實CAFs通過轉(zhuǎn)移外泌體H19促進CRC腫瘤干細胞的干性和化療耐藥性[21]。然而，CRC患者血清來源外泌體中H19的低表達與不良預(yù)后相關(guān)，這與H19的促癌作用相反[22]。因此，有關(guān)H19在CRC發(fā)生發(fā)展中的分子機制及其預(yù)后作用還有待進一步探究。

2.5 其他外泌體lncRNAs在CRC中的診斷和預(yù)后作用

lncRNA LINC02418在CRC患者外泌體中顯著高表達，敲除LINC02418通過誘導(dǎo)細胞周期阻滯和促進細胞凋亡抑制CRC細胞增殖，LINC02418作為ceRNA激活母系胚胎亮氨酸拉鏈蛋白激酶(maternal embryo leucine zipper protein kinase, MELK)，通過降低MELK抑制劑miR-1273g-3p水平發(fā)揮致癌作用[23]。血清外泌體中的lncRNA HOTTIP(HOXA transcript at the distal tip, HOTTIP)和HULC(highly upregulated in liver cancer，HULC)的低表達與CRC的不良預(yù)后相關(guān)，具有作為CRC不良預(yù)后生物標(biāo)志物的潛力[22]。lncRNA CCAT2[24](colon cancer-associated transcript 2, CCAT2)在CRC患者血清外泌體中高表達，且與不良臨床表現(xiàn)及預(yù)后相關(guān)，CCAT2在外泌體中穩(wěn)定表達，與血清中表達水平無明顯差異，提示外泌體是CCAT2在血清中穩(wěn)定性的潛在保護因子。外泌體lncRNA在CRC中的作用需要更廣泛及深入的基礎(chǔ)和臨床研究證實。

3 問題與展望

液體活檢打破了傳統(tǒng)檢查方法的局限，非侵入性檢查將成為腫瘤診斷篩查的新趨勢。越來越多的證據(jù)表明，外泌體lncRNA在CRC的腫瘤發(fā)生發(fā)展和治療耐藥中具有不同作用。外泌體中的lncRNA由于其包膜結(jié)構(gòu)可以避免外界環(huán)境的影響，作為腫瘤生物標(biāo)志物比無包膜lncRNA更具優(yōu)勢。從血液樣本中分離的外泌體顯示出對疾病早期的診斷潛力，具有特異性的TNM分期預(yù)后潛力，以及對CRC臨床常見治療方案耐藥的預(yù)測潛力。

目前分離外泌體的技術(shù)仍存在一定局限性，最常用的分離外泌體的方法是超速離心法[25]，為了獲得更高純度的外泌體，也可以使用蔗糖梯度離心法和免疫分離法，再使用流式細胞術(shù)驗證外泌體表面蛋白，但這種方法只能分離出特定的外泌體，并且需要大量的工作，耗時長，且測定效率不高，無法廣泛地應(yīng)用于臨床。而一些研發(fā)的外泌體分離試劑盒使用聚乙二醇等聚合物破壞外泌體膜，不能分離出完整的顆粒，從而限制了定性和定量分析。研發(fā)出更簡便更靈敏的技術(shù)分離純化外泌體，有助于外泌體lncRNA檢測早日投入臨床應(yīng)用。建立用于分離、純化和鑒定外泌體的指南，確保臨床前研究轉(zhuǎn)化為臨床試驗是仍需攻克的難題。