蔣 譽(yù)

(長安大學(xué)，陜西 西安 710064)

韌帶損傷是體育運(yùn)動中較常見的情況。特別是籃球、足球等具有沖撞性的體育運(yùn)動，稍不注意，就可能導(dǎo)致韌帶的挫傷、撕裂或斷裂，若不及時(shí)處理，就可能引發(fā)相關(guān)的骨關(guān)節(jié)炎癥，進(jìn)而對運(yùn)動員造成不可挽回的傷害。但受韌帶特殊生理結(jié)構(gòu)的影響，韌帶受損后，自愈能力較低，因此在臨床治療的過程中，通常使用移植人工韌帶，幫助韌帶重建的方法。但傳統(tǒng)人工韌帶受其材料的影響，存在力學(xué)性能不足，降解速率較快，生物相容性較差的問題，使得人工韌帶的使用存在很多的局域性。為解決目前人工韌帶存在的問題，有學(xué)者研究了以納米材料為修飾材料制備人工韌帶的實(shí)用性，結(jié)果表明，納米材料修飾后，人工韌帶的粘附環(huán)境增加,促進(jìn)細(xì)胞增殖，提供相對理想的力學(xué)強(qiáng)度[1]；但大部分納米材料皆不具備可降解性，對韌帶恢復(fù)造成一些影響。還有以絲素纖維為原材料，制作了可降解的仿生結(jié)構(gòu)的人工韌帶，并用對材料表面進(jìn)行低溫氧等離子體處理，增加了絲素纖維基人工韌帶的細(xì)胞相容性[2]；但絲素纖維基人工韌帶的力學(xué)性能無法滿足膝關(guān)節(jié)的日常所需，因此需要進(jìn)一步對絲素纖維基人工韌帶進(jìn)行改性。基于此，本文文獻(xiàn)[2]的研究基礎(chǔ)上，以聚氨酯-納米羥基磷灰石為修飾材料，增強(qiáng)其力學(xué)性能，尋找一種適用于臨床的人工韌帶材料。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

主要材料：柞蠶絲(復(fù)絲),永發(fā)繭產(chǎn)品;碳酸鈉(AR)，恒業(yè)化工產(chǎn)品;納米羥基磷灰石(粒徑60～80 nm),星新型碳材料;二甲基甲酰胺(DMF，AR),輝安化工;聚氨酯(PU,CP)，廣源新材料科技。

主要設(shè)備：24錠高速編織機(jī)(GBG)，鴻源機(jī)械；HRD-818全自動繞紗機(jī)，南海榮鉅機(jī)械；AS-24常溫振蕩染色機(jī)，元茂儀器；AJL-1004超聲波清洗機(jī)，愛潔樂超聲波自動化設(shè)備；78-1恒溫磁力攪拌器，科瑞永興化玻儀器；CT-C電熱鼓風(fēng)干燥箱，裕昌干燥工程；SQ-HZT-1003電子天平，順強(qiáng)機(jī)電設(shè)備；ZX500TR體式顯微鏡，眾尋光學(xué)儀器；YG004D醫(yī)用紡織品多功能強(qiáng)力儀，中纖檢測儀器設(shè)備；FD-1A-50冷凍干燥機(jī)，爭巧科學(xué)儀器。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1絲素纖維基人工韌帶的成型

本文制備的絲素纖維基人工韌帶主要從仿生學(xué)角度考慮，以ACL結(jié)構(gòu)為參照對人工韌帶進(jìn)行設(shè)計(jì)。膠原纖維取向排列和ACL雙束結(jié)構(gòu)分別通過編織結(jié)構(gòu)和2條內(nèi)芯與一層外殼結(jié)構(gòu)進(jìn)行模擬；具體編織過程：

(1)用HRD-818型全自動繞紗機(jī)在用于編織機(jī)錠子上卷繞柞蠶絲，共24個(gè)；

(2)將卷繞了柞蠶絲的錠子依次安裝在GBG型高速編織機(jī)上，編織2條“內(nèi)芯”；

(3)將制作的2條內(nèi)芯并列，置于編織機(jī)中央當(dāng)芯紗，繼續(xù)編織“外殼”，得到編織人工韌帶，具體流程如圖1所示。

圖1 人工韌帶編織流程圖Fig.1 Flow chart of artificial ligament weaving

1.2.2人工韌帶的脫膠處理

(1)將制作的人工韌帶放入裝有濃度為5%的Na2CO3溶液的錐形瓶中，確保人工韌帶完全浸沒在溶液中。將錐形瓶放入AS-24型常溫振蕩染色機(jī)中進(jìn)行振蕩脫膠處理，振蕩速率，脫膠溫度和時(shí)間分別為60 r/min、95 ℃和30 min；

(2)取出錐形瓶置于AJL-1004型超聲波清洗機(jī)內(nèi)進(jìn)行超聲清洗，清洗時(shí)間為10 min，倒掉Na2CO3溶液，在去離子水中超聲清洗20 min，取出人工韌帶進(jìn)行搓洗，置于常溫條件下晾干。

1.2.3聚氨酯-納米羥基磷灰石復(fù)合涂層的制備

(1)在DMF中以質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%溶入聚氨酯顆粒，置于78-1型恒溫磁力攪拌器上勻速攪拌，直至聚氨酯顆粒在溶液內(nèi)分布均勻，攪拌速率為250 r/min；

(2)將少量DMF與納米羥基磷灰石混合，置于AJL-1004型超聲波清洗機(jī)中進(jìn)行超聲分散，分散時(shí)間為15 min，得到均勻的納米羥基磷灰石分散液；

(3)用注射器將納米羥基磷灰石分散液緩慢滴加至聚氨酯溶液中，并在78-1型恒溫磁力攪拌器的作用下使之分散均勻，滴加速度和攪拌速度分別為0.1 mL/s和250 r/min，得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%的聚氨酯-納米羥基磷灰石分散液(N-Hap/PU)；

(4)將直徑為1.2 mm的不銹鋼芯棒襯入人工韌帶內(nèi)，確保在涂層過程中其形狀不發(fā)生改變。在人工韌帶上用毛刷均勻涂覆聚氨酯-納米羥基磷灰石分散液，置于CT-C型電熱鼓風(fēng)干燥箱中烘干，烘干溫度和時(shí)間分別為40 ℃和2 h；

(5)用SQ-HZT-1003型電子天平對烘干后人工韌帶進(jìn)行稱重，記錄涂層前后人工韌帶質(zhì)量變化，重復(fù)上述涂層烘干過程3次，得到聚氨酯-納米羥基磷灰石涂層人工韌帶(N-Hap/PU+SF)。具體制備流程如圖2所示。

圖2 聚氨酯-納米羥基磷灰石涂層制備流程圖 Fig.2 Preparation flow chart of polyurethane nano hydroxyapatite coating

1.3 性能測試

1.3.1表面觀察

用ZX500TR型體式顯微鏡觀察拍攝0～3次，觀察N-Hap/PU涂層人工韌帶表面差異，顯微鏡放大倍數(shù)為20。

1.3.2力學(xué)性能

(1)斷裂拉伸性能：用多功能強(qiáng)力儀對測試人工韌帶樣品的斷裂拉伸性，測試參數(shù)結(jié)果如表1所示。

表1 強(qiáng)力儀測試參數(shù)Tab.1 Test parameters of strength tester

斷裂強(qiáng)度表達(dá)式[3]：

(1)

式中:σ為斷裂強(qiáng)度；F為斷裂強(qiáng)力；S為樣品橫截面積。

楊氏模量表達(dá)式[4]：

(2)

式中:E為楊氏模量；ε為應(yīng)變。

(2)彈性回復(fù)性能測試：用YG004D型醫(yī)用紡織品多功能強(qiáng)力儀對長度為5 cm樣品彈性回復(fù)率進(jìn)行測定；按表1參數(shù)對樣品進(jìn)行預(yù)處理，然后進(jìn)行極限載荷下單次急彈性回復(fù)測試，測試條件如表2所示。

表2 單次急彈性回復(fù)測試條件Tab.2 Single rapid elastic recovery test conditions

彈性回復(fù)率表達(dá)式[5]：

(3)

式中:ER為彈性回復(fù)率；L為總伸長；L′為殘余伸長。

1.3.3細(xì)胞相容性

以SF織物(空白對照)、PU涂層和N-Hap/PU 涂層人工韌帶進(jìn)行試驗(yàn)。樣品表面細(xì)胞活性和增殖用CKK-8試劑盒評價(jià)，細(xì)胞數(shù)量表征是通過吸光度值對產(chǎn)物顏色的深淺進(jìn)行量化。細(xì)胞銀光染色后，用顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，評價(jià)細(xì)胞在材料表面粘附生長情況。

1.3.4降解性能

將樣品置于降解液(此處為規(guī)定的無菌酶溶液)中進(jìn)行降解試驗(yàn)，每隔3 d更換一次降解液[6]。設(shè)置取樣點(diǎn)為0、14、28、56和84 d，去離子水沖洗3次樣品，吸干表面水分置于密封袋內(nèi)，置于-20 ℃冷凍24 h；然后冷凍干燥24 h。

(1)質(zhì)量損失率：用SQ-HZT-1003型電子天平稱量樣品初始質(zhì)量，然后對樣品進(jìn)行降解處理，在取樣點(diǎn)取出樣品后，置于恒溫恒濕環(huán)境24 h，稱取樣品降解后質(zhì)量。

質(zhì)量損失率表示式[7]：

(4)

式中：w0為初始質(zhì)量；w1為降解后質(zhì)量。

(2)降解液 pH值變化：用筆式pH計(jì)對每個(gè)取樣點(diǎn)降解液pH值變化進(jìn)行測定和記錄。

2 結(jié)果與討論

2.1 涂層后人工韌帶材料的表面形態(tài)

在人工韌帶的使用過程中，需要對人工韌帶進(jìn)行完整涂層，隔絕組織液與蠶絲，避免蠶絲快速降解。圖3為在人工韌帶上涂覆聚氨酯-納米羥基磷灰石分散液0～3次的體視顯微鏡照片。

圖3 人工韌帶顯微鏡照片 Fig.3 Micrograph of artificial ligament

從圖3可以看出，未經(jīng)過涂層的人工韌帶，表面有較多的毛羽，這是蠶絲在編織過程中產(chǎn)生的。毛羽會增加人工韌帶與骨隧道的摩擦，對腱骨愈合產(chǎn)生一些不良的影響，經(jīng)過一次涂層后，人工韌帶表面有聚氨酯附著，但整體涂層并不完整，孔洞和毛羽皆較為明顯。第2次涂層后，涂層完整度有所提升，但孔洞還是存在。3次涂層后，涂層較為完整，幾乎沒有孔洞出現(xiàn)，且毛羽較為服帖，滿足人工韌帶使用要求。

2.2 力學(xué)性能

理想的人工韌帶應(yīng)與天然ACL生物力學(xué)性能相似，應(yīng)在最小形變的條件下，產(chǎn)生較高的拉伸載荷。 圖4為人的ACL在拉伸載荷下的強(qiáng)力-伸長曲線。

圖4 ACL在拉伸載荷下的強(qiáng)力-伸長曲線Fig.4 Strength elongation curve of ACL under tensile load

從圖4可以看出，ACL曲線主要分為腳趾區(qū)、線性區(qū)和屈服區(qū)。腳趾區(qū)為較低應(yīng)力條件下，韌帶內(nèi)卷曲膠原蛋白纖維伸直。當(dāng)膠原蛋白纖維完全伸直，繼續(xù)增加應(yīng)力，韌帶開始進(jìn)入線性區(qū)域，此時(shí)膠原蛋白發(fā)生滑移，單位應(yīng)變內(nèi)應(yīng)力增加，進(jìn)而增加了曲線斜率。應(yīng)力繼續(xù)增加，在此應(yīng)力作用下，膠原蛋白纖維逐漸破裂，此時(shí)應(yīng)力降低，曲線斜率下降，韌帶也進(jìn)入屈服區(qū)，直至全部膠原蛋白都發(fā)生斷裂。相關(guān)參考文獻(xiàn)表明，人的ACL極限拉力為600～2 300 N[8]。

2.2.1拉伸斷裂性能

圖5為人工韌帶斷裂強(qiáng)力-伸長曲線。

圖5 人工韌帶拉伸斷裂強(qiáng)力-伸長曲線Fig.5 Tensile breaking strength elongation curve of artificial ligament

從圖5可以看出，人工韌帶涂層前后均與人的ACL的三相曲線類似。涂層后人工韌帶斷裂強(qiáng)力有所上升，且應(yīng)變減小，這就證明經(jīng)過涂層后，人工韌帶材料的力學(xué)性能有所上升，且在較小變形條件下，承擔(dān)更大的應(yīng)力。這是因?yàn)榫幙椚斯ろg帶時(shí)，內(nèi)部紗線交錯(cuò)排列，在軸向壓力的作用下，編織角度縮小，用更多的紗線承擔(dān)軸向壓力，此時(shí)人工韌帶整體伸長，由較大應(yīng)變產(chǎn)生。經(jīng)過涂層處理后，涂層完全包裹紗線，且紗線間孔隙被涂層填滿，受軸向壓力時(shí)，紗線間幾乎不產(chǎn)生相對滑移，減小了應(yīng)變作用。引入涂層材料對整體強(qiáng)力的提升產(chǎn)生積極的作用，增加了人工韌帶的整體斷裂強(qiáng)度。經(jīng)過涂層后的人工韌帶的斷裂強(qiáng)度約為63.54 MPa，楊氏模量約為127.4 MPa，明顯高于人的ACL，這就說明經(jīng)過涂層后的人工韌帶可為膝關(guān)節(jié)日?；顒犹峁┝W(xué)支撐；同時(shí)可在單位應(yīng)變內(nèi)提供較大應(yīng)力，在較小形變的條件下，提供較高的機(jī)械強(qiáng)力[9]。

2.2.2彈性回復(fù)性能

圖6為涂層后人工韌帶的單次加載-卸載循環(huán)曲線。

圖6 涂層后人工韌帶的單次加載-卸載循環(huán)曲線Fig.6 Single loading unloading cycle curve of coated posterior artificial ligament

從圖6可以看出，涂層后人工韌帶彈性回復(fù)率為77.55%?；乜s變形能力明顯優(yōu)于傳統(tǒng)人工韌帶，使其在植入人體后，遇較大外力使得膝關(guān)節(jié)彎曲。讓韌帶伸長，能夠隨膝關(guān)節(jié)伸直回復(fù)到原來的長度，進(jìn)而維持了膝關(guān)節(jié)的穩(wěn)定性。

2.3 生物細(xì)胞相容性

圖7為不同樣品的 CCK-8測試結(jié)果。

圖7 不同樣品的 CCK-8測試結(jié)果Fig.7 CCK-8 test results of different samples

從圖7可以看出，同一培養(yǎng)時(shí)間條件下，各試件顯著性差異不大。在培養(yǎng)初期，僅用PU涂層的人工韌帶表面細(xì)胞數(shù)量相對較多，這是因?yàn)镻U涂層表面較為光滑平整，對細(xì)胞粘附鋪展產(chǎn)生積極的作用。在4、7 d，N-Hap/PU涂層細(xì)胞相容性更佳，這可能是因?yàn)獒尫懦霾糠諲-Hap粒子，促進(jìn)了細(xì)胞的粘附和增殖。

圖8為材料表面粘附細(xì)胞的熒光染色照片。

圖8 樣品表面粘附細(xì)胞的熒光染色照片F(xiàn)ig.8 Fluorescent staining photos of adherent cells on the sample surface

從圖8可以看出，培養(yǎng)7 d后，2種材料表面細(xì)胞皆相對較多；但N-Hap/PU復(fù)合涂層人工韌帶表面的細(xì)胞數(shù)量和亮度皆高于PU涂層人工韌帶，這就證明經(jīng)過N-Hap/PU復(fù)合涂層后，細(xì)胞生長情況更好，活性更好。同時(shí)形狀也慢慢由橢圓形轉(zhuǎn)變成連接較為緊密的梭形，這就證明N-Hap對細(xì)胞在材料表面的增殖和粘附起積極作用。

2.4 體外降解性能

2.4.1質(zhì)量損失率

圖9為降解試驗(yàn)中質(zhì)量損失率曲線。

圖9 質(zhì)量損失率變化曲線Fig.9 Variation curve of mass loss rate

從圖9可以看出，在試驗(yàn)開始7 d，樣品有質(zhì)量損失；在14～42 d，變化趨勢為先大幅度上升，然后慢慢的趨于平衡；這可能是因?yàn)镹-Hap降解導(dǎo)致的。在降解早期，僅有少數(shù)N-Hap暴露在樣品表面，隨降解過程的進(jìn)行，部分聚氨酯也隨之降解，使得更多N-Hap顆粒剝落，促使樣品質(zhì)量降解率大幅度上升；在降解中后期，N-Hap顆粒幾乎完全剝落，聚氨酯降解較慢，此時(shí)，質(zhì)量損失率曲線逐漸趨于平衡。當(dāng)降解時(shí)間達(dá)到84 d后，質(zhì)量損失率為8.2%。相關(guān)研究表明，在同等條件下，SF人工韌帶70 d質(zhì)量損失率為18.6%[10]。這證實(shí)涂層的存在可調(diào)控人工韌帶的降解周期。

2.4.2降解液酸堿度變化

圖10為降解率pH值變化曲線。

圖10 降解液pH值變化Fig.10 pH change of degradation solution

從圖10可以看出，降解14 d前，pH值明顯下降，這是因?yàn)榫郯滨ズ徒z素纖維降解過程中，產(chǎn)生了酸性產(chǎn)物氨基酸和小分子聚酯，使得降解液pH值有所下降；14 d后，降解液pH值有所上升，這是堿性N-Hap顆粒引起的；42 d后，整體pH值基本維持在7.0，這是因?yàn)榇藭r(shí)人工韌帶降解趨于平衡，酸性產(chǎn)物和堿性產(chǎn)物互相緩沖，讓整體環(huán)境趨于中性[16-20]。這就證明本文制備的人工韌帶在酶環(huán)境下，也能維持較為穩(wěn)定和緩慢的降解速率。

3 結(jié)語

本文以絲素纖維為原材料，以ACL結(jié)構(gòu)為參照，以聚氨酯-納米羥基磷灰石為增強(qiáng)材料制備了仿生型人工韌帶，并對人工韌帶性能進(jìn)行了系統(tǒng)的研究。

(1)經(jīng)過N-Hap/PU3次涂層后，絲素纖維基人工韌帶涂層完整，羽毛服帖，沒有孔洞出現(xiàn)，能有效減少人工韌帶與鍵骨的摩擦，滿足人工韌帶使用要求；

(2)經(jīng)過涂層后，人工韌帶彈性回復(fù)率高達(dá)77.55%，斷裂強(qiáng)度為63.54 MPa，楊氏模量約為127.4 MPa，明顯高于人的ACL，具備較優(yōu)的力學(xué)性能和回縮變形能力，能為膝關(guān)節(jié)提供力學(xué)支撐和穩(wěn)定性；

(3)涂層后人工韌帶進(jìn)入體內(nèi)后，釋放出部分N-Hap粒子，促進(jìn)了細(xì)胞的粘附和增殖，細(xì)胞形狀也轉(zhuǎn)變成連接較為緊密的梭形，具備較好的生物相容性；

(4)涂層可調(diào)控人工韌帶的降解周期。涂層后人工韌帶降解84 d后，質(zhì)量損失率僅為8.2%。42 d后，人工韌帶降解趨于平衡，降解液pH值趨于中性，證明在酶環(huán)境下，人工韌帶可維持較為穩(wěn)定和緩慢的降解速率。