于曉婷，陳曉藝，李 苗，王淑婧，王添譽(yù)，李 僉，李憲臻

（大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，遼寧 大連 116034）

酶是一種生物催化劑，因其擁有綠色、環(huán)保和可持續(xù)發(fā)展的優(yōu)勢(shì)而受到廣泛關(guān)注。但是，由于其物理和化學(xué)特性的不穩(wěn)定，使得在實(shí)際使用中不能長(zhǎng)時(shí)間維持其催化活性，因而不能充分發(fā)揮其催化作用[1]。酶固定化技術(shù)是通過(guò)采用合適的固定化工藝，將游離酶固定到易于循環(huán)利用的載體上，固定化材料、制備方法、酶用量以及固定化條件等皆會(huì)影響酶的固定化效果[2]。

從1910 年開(kāi)始，隨著新型固定化載體的不斷涌現(xiàn)，固定化酶領(lǐng)域發(fā)展迅速。載體通常需要根據(jù)固定化酶的應(yīng)用要求進(jìn)行選擇[3]。固定化酶常用的載體可以分為以下4 類(lèi)：無(wú)機(jī)載體（二氧化硅、活性炭等[4]）、天然有機(jī)物（纖維素、殼聚糖、海藻酸鈉等[5-6]）、合成高分子材料（環(huán)氧樹(shù)脂、聚丙烯腈膜等[7]）和復(fù)合載體（有機(jī)物質(zhì)與無(wú)機(jī)物質(zhì)混合構(gòu)成的載體，例如磁性復(fù)合微球等[8]）。常用的固定化酶方法有以下幾種：1）吸附法是指通過(guò)范德華力作用，酶和載體進(jìn)行結(jié)合，但是這樣的力常常不是很強(qiáng)，造成酶和載體之間反應(yīng)不夠牢固，在使用時(shí)，酶很容易脫落進(jìn)入反應(yīng)溶液中，造成回收困難[9]。2）交聯(lián)法是通過(guò)兩種或多種功能的交聯(lián)劑，將酶分子和載體連接起來(lái)的固定化方式。為了避免酶從載體上掉落，通常不單獨(dú)使用交聯(lián)法，而與包埋法或吸附法組合應(yīng)用[10]。3）共價(jià)偶聯(lián)法（又稱為共價(jià)結(jié)合法）是通過(guò)在酶和載體之間形成共價(jià)鍵來(lái)固定酶的一種工藝。和其他方法相比，該方法反應(yīng)條件較復(fù)雜，不僅在一定程度上會(huì)引起酶蛋白在空間上特定結(jié)構(gòu)的變化，還有可能破壞酶的活性中心，從而導(dǎo)致酶活力降低。

柚皮苷是一種二氫類(lèi)黃酮化合物，口感苦澀，在柑橘類(lèi)果品中十分常見(jiàn)。為了改善其苦澀味道，柚苷酶通常用于去除柚柑類(lèi)產(chǎn)品（如果汁等）的苦味[11]。柚苷酶是一種復(fù)合酶，具有α-L-鼠李糖苷酶（EC 3.2.1.40）和β-D-葡萄糖苷酶（EC 3.2.1.21）兩種活性[12-14]，其在自然界中的動(dòng)物、植物、微生物中普遍存在[13]。柚苷酶水解柚皮苷主要經(jīng)過(guò)兩個(gè)步驟：第一步，柚皮苷經(jīng)過(guò)α-L-鼠李糖苷酶水解為α-L-鼠李糖和普魯寧兩種物質(zhì)，普魯寧的苦味遠(yuǎn)低于柚皮苷（其苦味值僅為柚皮苷的一半）；第二步，普魯寧被β-D-葡萄糖苷酶水解生成葡萄糖及柚皮素，這兩種產(chǎn)物均沒(méi)有苦味[14]。迄今為止，柚苷酶在柑橘類(lèi)水果脫苦、葡萄酒調(diào)味、醫(yī)藥工業(yè)等方面發(fā)揮著重要作用[15-18]。

在已有固定化柚苷酶的報(bào)道中，殼聚糖是一種較為常用的固定化載體，是廣泛存在于自然界的天然高分子物質(zhì)，具有生物相容性好[19]、安全無(wú)毒、易降解等優(yōu)點(diǎn)[20]。段志濤等分別用殼聚糖和海藻酸鈉微球?qū)﹁周彰高M(jìn)行共價(jià)鍵合，其酶比活力分別為14.34 U/g 和12.18 U/g[21]。此外，作為殼聚糖的衍生物，羧甲基殼聚糖是將羧甲基等基團(tuán)加入到殼聚糖的內(nèi)部，其中富含大量的羧基和氨基等功能基團(tuán)，在中性和堿性條件下，水溶性較好，因此有效改善了殼聚糖的溶解性能[22]。并且與單純的殼聚糖材料相比較，羧甲基殼聚糖表現(xiàn)出更優(yōu)異的生物相容性，同時(shí)能夠與Ca2+交聯(lián)產(chǎn)生致密結(jié)構(gòu)，對(duì)活性化合物的吸附和控制釋放有非常好的效果。肖安風(fēng)等用聚乙烯醇和海藻酸鈉形成的復(fù)合材料進(jìn)行固定化柚苷酶的相關(guān)研究，酶比活力達(dá)到19 U/g[23]。與此同時(shí)，海藻酸鈉也是一種天然多糖類(lèi)物質(zhì)，同樣可以與Ca2+交聯(lián)形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)[24]。雖然海藻酸鹽微球羥基和羧基含量豐富，但由于其強(qiáng)度不高，導(dǎo)致微球結(jié)構(gòu)相對(duì)不穩(wěn)定，最好引入一些無(wú)機(jī)載體來(lái)增強(qiáng)其機(jī)械強(qiáng)度，例如二氧化硅，是最受歡迎的無(wú)機(jī)載體之一，具有良好的物理和機(jī)械穩(wěn)定性，無(wú)膨脹，耐有機(jī)物、高酸度和高溫等顯著優(yōu)點(diǎn)[25]。與此同時(shí)，海藻酸鈉、硅膠、羧甲基殼聚糖均為綠色、對(duì)環(huán)境友好、價(jià)格相對(duì)便宜的原料，能夠有效降低工業(yè)化生產(chǎn)成本。

迄今為止，鮮有關(guān)于羧甲基殼聚糖和海藻酸鈉引入硅膠為材料對(duì)柚苷酶進(jìn)行固定化的報(bào)道，作者以羧甲基殼聚糖、海藻酸鈉、硅膠為基材制備微球，對(duì)柚苷酶進(jìn)行固定化，優(yōu)化了硅膠/羧甲基殼聚糖質(zhì)量比、交聯(lián)時(shí)間、固定化溫度、偶聯(lián)時(shí)間等條件，并探索和分析了固定化柚苷酶和游離柚苷酶發(fā)生酶解反應(yīng)的最適反應(yīng)pH、最適反應(yīng)溫度、重復(fù)使用性等，為創(chuàng)新酶固定化載體，不斷拓寬柚苷酶在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域的應(yīng)用和發(fā)展提供了技術(shù)準(zhǔn)備和數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.2 儀器與設(shè)備

DENVER INSTRUMENT TP-213 精密天平：美國(guó)丹佛儀器有限公司產(chǎn)品；78-1 型磁力加熱攪拌器：江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司產(chǎn)品；DF-101S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：河南省予華儀器有限公司產(chǎn)品；知楚三層立式搖床：上海知楚儀器有限公司產(chǎn)品；PHS-3C 型pH 計(jì)：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司產(chǎn)品；HH-8 型恒溫水浴鍋：常州菲普實(shí)驗(yàn)儀器廠產(chǎn)品；Tecan 酶標(biāo)儀：勒菲生物科技（上海）有限公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 微球載體及固定化柚苷酶的制備

1）滴入法制備海藻酸鈣/硅膠/羧甲基殼聚糖復(fù)合微球 首先配制1.5 g/dL 海藻酸鈉溶液（溶液A），將100 mL 去離子水和1.5 g 海藻酸鈉加入到250 mL 的燒杯中，置于磁力加熱攪拌器上進(jìn)行攪拌至溶解后，再加入1.0 g 硅膠和1.5 g 羧甲基殼聚糖，繼續(xù)劇烈攪拌待其形成均一溶液后停止。配制2 g/dL CaCl2溶液（溶液B），稱取4 g CaCl2于燒杯中加水溶解，轉(zhuǎn)移到200 mL 容量瓶中定容。將溶液B 轉(zhuǎn)移至三口燒瓶中，加入磁子后，將其置于恒溫加熱磁力攪拌器上，在溫度為25 ℃條件下進(jìn)行低速攪拌。利用1 mL 的注射器將溶液A 緩慢逐滴加入到溶液B 中，滴入瞬間在溶液B 中可以看到生成的微球，注意滴入速度不能過(guò)快，防止微球粘連。溶液A 全部加入后，微球?yàn)V出加入新的CaCl2溶液，同樣的低轉(zhuǎn)速持續(xù)攪拌1 h，結(jié)束后，用去離子水將微球洗滌數(shù)次。最后，將微球平鋪在濾紙上，吸干其表面水分，4 ℃冷藏。

2）戊二醛交聯(lián)海藻酸鈣/硅膠/羧甲基殼聚糖復(fù)合微球的制備 將0.4 g 上述微球放入到1 mL 體積分?jǐn)?shù)為6%的戊二醛溶液中，在25 ℃搖床中交聯(lián)2.0 h。反應(yīng)結(jié)束后，用去離子水洗滌數(shù)次，將微球平鋪在濾紙上，吸干其表面水分，即得到戊二醛交聯(lián)的海藻酸鈣/硅膠/羧甲基殼聚糖復(fù)合微球，冷藏備用。

3）固定化柚苷酶的制備 取0.4 g 已交聯(lián)的微球載體，加入4 mL 柚苷酶酶液，置于25 ℃搖床上振蕩2 h，并于4 ℃冰箱中靜置吸附偶聯(lián)4 h。用去離子水清洗數(shù)次，將載體表面未固定化的剩余酶液沖洗干凈，濾紙吸干水分獲得固定化柚苷酶，于4 ℃冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 酶學(xué)性質(zhì)表征

提高學(xué)生學(xué)習(xí)興趣，可幫助學(xué)生改善學(xué)習(xí)效率，并使生物成績(jī)快速提升。在教學(xué)實(shí)踐中，教師可通過(guò)引導(dǎo)學(xué)生觀察大自然的方式提升學(xué)生對(duì)于生物課程的興趣。首先教師可利用假期時(shí)間，邀請(qǐng)學(xué)生進(jìn)入到大自然中開(kāi)展活動(dòng)，在活動(dòng)中，教師可開(kāi)展相關(guān)的生物實(shí)驗(yàn)，以幫助學(xué)生認(rèn)識(shí)到大自然的魅力與生物的多樣性。之后教師可組織學(xué)生在課堂中將活動(dòng)的體會(huì)進(jìn)行分享。通過(guò)這樣的活動(dòng)學(xué)生將對(duì)自然環(huán)境產(chǎn)生新的認(rèn)識(shí)，并將在教師的引導(dǎo)下對(duì)生物課程產(chǎn)生較為濃厚的興趣。

1）酶解反應(yīng)條件的優(yōu)化 研究了海藻酸鈣/硅膠/羧甲基殼聚糖復(fù)合微球固定化柚苷酶酶解反應(yīng)溫度、最適反應(yīng)pH、pH 穩(wěn)定性以及熱穩(wěn)定性。通過(guò)測(cè)定4 ℃、30 d 內(nèi)酶活力變化，研究了固定化柚苷酶的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性，同時(shí)計(jì)算了固定化柚苷酶的載酶率和酶活力回收率。

2）酶活力的測(cè)定 選擇改進(jìn)的Davis 法[26-29]，稱取0.4 g 固定化柚苷酶或移取0.2 mL 游離柚苷酶于1.5 mL 離心管中，加入0.8 mL 的柚皮苷溶液（0.8 mg/mL），混合均勻并置于恒溫水浴鍋中，在溫度為55 ℃條件下加熱30 min，反應(yīng)停止后，取0.1 mL 上清液，加入到提前配制好的溶液C（體積分?jǐn)?shù)95%一縮二乙二醇5 mL 和4 mol/L 氫氧化鈉0.1 mL）中，振蕩混勻，待其反應(yīng)10 min 后，在波長(zhǎng)為420 nm 條件下測(cè)定OD 值。

柚苷酶酶活力：在最適反應(yīng)pH 和最適反應(yīng)溫度條件下，在1 min 內(nèi)酶解質(zhì)量為1 μg 的柚皮苷所需要的酶量稱作一個(gè)酶活力單位，其單位為U。

酶比活力：在最適反應(yīng)pH 和最適反應(yīng)溫度條件下，1 g 固定化柚苷酶或1 mL 游離柚苷酶具有的酶活力，其單位為U/g 或U/mL。

3）相關(guān)計(jì)算公式[30]固定化柚苷酶的載酶率由下式（1）計(jì)算得出：

式中：B 為載酶率，%；A0為柚苷酶固定前游離柚苷酶的總酶活力；A1為柚苷酶固定后上清液中剩余的酶活力。

酶活力回收率由下式（2）計(jì)算得出：

式中：R 為酶活力回收率，%；A2為固定化柚苷酶的總酶活力。

固定化柚苷酶相對(duì)酶活力計(jì)算公式如下式（3）：

式中：Q 為相對(duì)酶活力，%；P 為某一條件下的酶活力；K 為該條件下的最高酶活力。

1.3.3 動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定 取0.2 mL 游離柚苷酶，加入0.8 mL 柚皮苷溶液中（質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL），在pH 為4.5，溫度為55 ℃條件下，進(jìn)行酶解反應(yīng)，測(cè)定酶活力；取40 mg 固定化柚苷酶，加入0.8 mL 柚皮苷溶液中（質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL），在pH 為7.5、溫度為55 ℃條件下，進(jìn)行酶解反應(yīng)，測(cè)定酶活力。最大反應(yīng)速度（Vmax）和表觀米氏常數(shù)（Km）由Lineweaver-Burk 方程計(jì)算得出，如下式（4）：

2 結(jié)果與分析

2.1 海藻酸鈣/硅膠/羧甲基殼聚糖復(fù)合微球制備工藝的優(yōu)化

2.1.1 硅膠/羧甲基殼聚糖質(zhì)量比對(duì)固定化柚苷酶酶活力的影響 首先，研究了硅膠/羧甲基殼聚糖質(zhì)量比對(duì)固定化柚苷酶酶活力的影響，結(jié)果如圖1（a）所示。當(dāng)硅膠/羧甲基殼聚糖質(zhì)量比為1.0∶1.5 時(shí)，酶活力達(dá)到最大值。當(dāng)羧甲基殼聚糖質(zhì)量增大時(shí)，酶活力隨之減小，這可能是由于微球通過(guò)靜電作用形成了復(fù)雜的空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[31]，當(dāng)羧甲基殼聚糖含量過(guò)高時(shí)，所產(chǎn)生的微球結(jié)構(gòu)相對(duì)牢固，壁膜結(jié)構(gòu)致密[32]，減少了酶分子與載體結(jié)合的位點(diǎn)數(shù)量。因此，采用硅膠/羧甲基殼聚糖的質(zhì)量比1.0∶1.5 進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。如圖1（b）所示，在最佳工藝條件下制備出了機(jī)械強(qiáng)度高、表面光滑且成球性好的海藻酸鈣/硅膠/羧甲基殼聚糖復(fù)合微球。

圖1 硅膠/羧甲基殼聚糖質(zhì)量比對(duì)固定化柚苷酶酶活力的影響及最佳條件下制備的固定化材料Fig.1 Effect of silica gel/carboxymethyl chitosan mass ratio on the activity of immobilized naringinase and immobilized materials prepared under the optimum conditions

2.1.2 交聯(lián)時(shí)間對(duì)固定化柚苷酶酶活力的影響 作者以海藻酸鈣/硅膠/羧甲基殼聚糖復(fù)合微球?yàn)檩d體，進(jìn)行固定化柚苷酶。結(jié)果如圖2 所示，載體加入戊二醛溶液后，交聯(lián)時(shí)間在1.0～3.0 h 時(shí)，交聯(lián)反應(yīng)2.0 h 達(dá)到最大酶活力，這是因?yàn)榻宦?lián)時(shí)間過(guò)短，會(huì)引起酶的脫落[33]；交聯(lián)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)造成過(guò)高交聯(lián)度，使微球內(nèi)部網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)孔徑過(guò)小，不利于酶促反應(yīng)進(jìn)行，所以交聯(lián)時(shí)間超過(guò)2.0 h 后，固定化柚苷酶的酶活力會(huì)明顯降低。綜上所述，采用2.0 h 作為交聯(lián)時(shí)間進(jìn)行后續(xù)研究。

圖2 交聯(lián)時(shí)間對(duì)固定化柚苷酶酶活力的影響Fig.2 Effect of crosslinking time on the activity of immobilized naringinase

2.2 海藻酸鈣/硅膠/羧甲基殼聚糖復(fù)合微球固定化柚苷酶的工藝研究

2.2.1 固定化溫度對(duì)固定化柚苷酶酶活力的影響 由圖3 可以看出，當(dāng)固定化溫度在20～40 ℃時(shí)，固定化柚苷酶最佳的固定化溫度為25 ℃，酶活力達(dá)到最高；大于25 ℃后，酶活力隨之下降，溫度對(duì)于柚苷酶的性質(zhì)影響較大，酶分子的構(gòu)象由此可能發(fā)生變化，導(dǎo)致游離柚苷酶酶活力下降，不能與載體更好地進(jìn)行結(jié)合，進(jìn)而使固定化柚苷酶的酶活力下降。故選擇25 ℃為柚苷酶的最佳固定化溫度。

圖3 固定化溫度對(duì)固定化柚苷酶酶活力的影響Fig.3 Effect of immobilization temperature on the activity of immobilized naringinase

2.2.2 偶聯(lián)時(shí)間對(duì)固定化柚苷酶酶活力的影響將已交聯(lián)的海藻酸鈣/硅膠/羧甲基殼聚糖復(fù)合微球與柚苷酶酶液充分混合并使其結(jié)合，因其孔道中存在大量的活性基團(tuán)，可以使酶分子與載體逐步連接。由圖4 可以看出，當(dāng)交聯(lián)時(shí)間小于4 h 時(shí)，偶聯(lián)時(shí)間越長(zhǎng)，固定化柚苷酶酶活力越大，在4 h 時(shí)達(dá)到最高；偶聯(lián)時(shí)間大于4 h 時(shí)，酶活力隨時(shí)間的延長(zhǎng)不增反而降低。這是由于偶聯(lián)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)材料表面的酶分子過(guò)于聚集，形成立體效應(yīng)，致使酶分子不能與底物充分接觸，從而使酶活力下降；同時(shí)，一部分酶分子深入到載體微球的孔隙中，致使底物難以和孔道內(nèi)部的酶進(jìn)一步反應(yīng)，導(dǎo)致酶活力降低[34]。

圖4 偶聯(lián)時(shí)間對(duì)固定化柚苷酶酶活力的影響Fig.4 Effect of coupling time on the activity of immobilized naringinase

2.2.3 給酶量對(duì)固定化柚苷酶酶活力的影響 如圖5 所示，一定范圍內(nèi)，固定化柚苷酶的酶活力隨著給酶量的增加逐漸增加，當(dāng)給酶量為465.6 U/mL時(shí)，酶活力達(dá)到最高，之后隨著給酶量進(jìn)一步增加，酶活力降低。這是因?yàn)楫?dāng)給酶量為465.6 U/mL 時(shí)，載體的反應(yīng)位點(diǎn)可能被酶分子完全占據(jù)，而給酶量的進(jìn)一步增加，會(huì)使過(guò)多酶分子通過(guò)擠壓現(xiàn)有酶分子覆蓋的孔位置來(lái)擴(kuò)大其與載體的連接[35]，致使酶和底物不能進(jìn)一步發(fā)生反應(yīng)，最終導(dǎo)致酶活力降低。作者所在研究團(tuán)隊(duì)前期對(duì)固定化柚苷酶的相關(guān)研究及其他相關(guān)文獻(xiàn)中也出現(xiàn)了類(lèi)似的實(shí)驗(yàn)規(guī) 律[12，21，35-41]。

圖5 給酶量對(duì)固定化柚苷酶酶活力的影響Fig.5 Effect of enzyme dosage on the activity of immobilized naringinase

2.3 海藻酸鈣/硅膠/羧甲基殼聚糖復(fù)合微球固定化柚苷酶酶學(xué)性質(zhì)的研究

2.3.1 海藻酸鈣/硅膠/羧甲基殼聚糖復(fù)合微球固定化柚苷酶的最適反應(yīng)pH 及pH 穩(wěn)定性 如圖6（a）所示，游離柚苷酶在pH 為3.0～6.0 時(shí)，酶活力變化比較大，在pH 為6.0 時(shí)僅剩余32%的酶活力，當(dāng)pH 為8.0 時(shí)酶活力非常低（接近于0）；而固定化柚苷酶在pH 為4.5～8.0 時(shí)，一直保持46%以上的酶活力。與游離柚苷酶相比，固定化柚苷酶有更好的耐堿性，且隨pH 的增加，變化趨勢(shì)較為緩和。

固定化柚苷酶的最適反應(yīng)pH 與材料性能及其所在的微環(huán)境有較大關(guān)系。本研究中，固定化柚苷酶的最適pH 向堿性方向發(fā)生了偏移，這可能是由于羧甲基殼聚糖帶有游離氨基，為陽(yáng)離子型載體，當(dāng)柚苷酶被固定在微球上時(shí)，表面會(huì)帶有一定的負(fù)電荷，從而吸附溶液中的部分陽(yáng)離子特別是氫離子[42]，使固定化柚苷酶擴(kuò)散層的氫離子濃度稍高于外部溶液，即呈弱酸性，因此外部溶液的pH（即固定化柚苷酶的最佳pH）需要調(diào)節(jié)為弱堿性（即pH為7.5，如圖6（a）所示），才能抵消微環(huán)境的作用[43]。作者所在研究團(tuán)隊(duì)在前期工作中制備了多種固定化柚苷酶，其中部分固定化柚苷酶的最佳pH 在4.5～5.5[12，36-37]，主要應(yīng)用于一些酸性柚柑果汁的脫苦處理和酒類(lèi)增香等；另外一部分固定化柚苷酶的最佳pH 在7.0～8.0[38-40]，可用于堿性醫(yī)藥中間體（如普魯寧等）的制備。進(jìn)一步結(jié)合柚苷酶具有α-L-鼠李糖苷酶和β-D-葡萄糖苷酶兩種酶活性的特性，固定化柚苷酶的最適反應(yīng)pH 變化較大，非但不會(huì)限制柚苷酶的應(yīng)用，反而在很大程度上拓寬了其在食品和醫(yī)藥方面的應(yīng)用范圍。

同時(shí)，在圖6（b）中可以看出，將固定化柚苷酶和游離柚苷酶分別加入到pH 為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液中。將其放在4 ℃冰箱內(nèi)保存2 h，測(cè)定酶活力。固定化柚苷酶酶活力的變化比游離柚苷酶的緩和，說(shuō)明固定化柚苷酶比游離柚苷酶具有更好的pH 穩(wěn)定性。

圖6 游離柚苷酶和固定化柚苷酶的最適反應(yīng)pH 和pH 穩(wěn)定性Fig.6 Optimum reaction pH and pH stability of free enzyme and immobilized naringinase

2.3.2 海藻酸鈣/硅膠/羧甲基殼聚糖復(fù)合微球固定化柚苷酶的最適反應(yīng)溫度及熱穩(wěn)定性 如圖7（a）所示，固定化柚苷酶和游離柚苷酶的酶活力均隨著反應(yīng)溫度的升高表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)。游離柚苷酶和固定化柚苷酶的最適反應(yīng)溫度均為55 ℃，但當(dāng)溫度在40～65 ℃時(shí)，固定化柚苷酶酶活力保持在80%以上，而游離柚苷酶在溫度低于45 ℃和高于60 ℃時(shí)酶活力小于80%。與此同時(shí)，由圖7（b）可以看出，將固定化柚苷酶和游離柚苷酶，同時(shí)置于55 ℃的恒溫水浴鍋內(nèi)反應(yīng)0、2、4、6、8 h，分別測(cè)其酶活力。與游離柚苷酶相對(duì)比，隨著時(shí)間的變化，固定化柚苷酶的酶活力變化更緩和，故固定化柚苷酶比游離柚苷酶表現(xiàn)出更優(yōu)異的熱穩(wěn)定性。

圖7 游離柚苷酶和固定化柚苷酶的最適反應(yīng)溫度和熱穩(wěn)定性Fig.7 Optimum reaction temperature and thermal stability of free enzyme and immobilized naringinase

2.3.3 海藻酸鈣/硅膠/羧甲基殼聚糖復(fù)合微球固定化柚苷酶的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性 如圖8 所示，固定化柚苷酶在4 ℃的條件下儲(chǔ)藏30 d 后，仍然剩余70%以上的酶活力；而游離柚苷酶在儲(chǔ)藏期間酶活力顯著降低，在儲(chǔ)藏15 d 后酶活力迅速下降，保存30 d 后只剩余25%的酶活力。結(jié)果表明，固定化柚苷酶比游離柚苷酶具有更好的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性[44]，尤其是在酶需要長(zhǎng)時(shí)間保存和長(zhǎng)距離運(yùn)輸上有巨大的潛力。

圖8 固定化柚苷酶的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性Fig.8 Storage stability of immobilized naringinase

2.4 海藻酸鈣/硅膠/羧甲基殼聚糖復(fù)合微球固定化柚苷酶的載酶率、酶活力回收率及重復(fù)使用性

在最佳條件下，利用海藻酸鈣/硅膠/羧甲基殼聚糖復(fù)合微球?qū)﹁周彰高M(jìn)行固定化，其酶比活力、載酶率和酶活力回收率分別為203.33 U/g、36.80%以及62.15%。同時(shí)，在弱堿性條件下（pH 為7.5），固定化柚苷酶經(jīng)過(guò)3 次重復(fù)使用后，仍能保持46.90%的初始酶活力，比作者所在團(tuán)隊(duì)之前研究中固定化柚苷酶在堿性條件下制備普魯寧的實(shí)驗(yàn)結(jié)果（pH為8.0 時(shí)，經(jīng)過(guò)3 次重復(fù)使用后，固定化柚苷酶的酶活力剩余38.80%[40]）有顯著提高。這也在很大程度上表明，堿性條件下應(yīng)用固定化柚苷酶進(jìn)行催化反應(yīng)的難度始終較大，但是對(duì)于制備堿性醫(yī)藥中間體（如普魯寧等）具有十分重要的研究意義，需要進(jìn)一步突破研究瓶頸。

2.5 動(dòng)力學(xué)參數(shù)的研究

游離柚苷酶與固定化柚苷酶酶解反應(yīng)的雙倒數(shù)曲線如圖9 所示。經(jīng)計(jì)算，固定化柚苷酶水解柚皮苷的Km值為0.94 g/L，高于游離柚苷酶水解柚皮苷的Km值（0.81 g/L），可以得出，相對(duì)于游離柚苷酶而言，固定化柚苷酶對(duì)柚皮苷的親和力更低；海藻酸鈣/硅膠/羧甲基殼聚糖復(fù)合微球固定化柚苷酶與底物發(fā)生酶解反應(yīng)的最大反應(yīng)速率Vmax（0.51 g/（L·min））比游離柚苷酶水解反應(yīng)的Vmax（1.88 g/（L·min））小，這是因?yàn)楣潭ɑ周彰妇哂锌臻g效應(yīng)，使底物難以與酶接觸，進(jìn)而使得酶促反應(yīng)速率下降[45]。進(jìn)一步由Vmax=kcat[E]可得kcat=Vmax/[E]，固定化柚苷酶的最大反應(yīng)速率Vmax雖然比游離柚苷酶小，但固定化柚苷酶的[E]也比游離柚苷酶小得多，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，固定化柚苷酶與游離柚苷酶對(duì)底物降解的kcat值分別為1.41 min-1和1.33 min-1，表明固定化柚苷酶具有更高的催化效率。

圖9 游離柚苷酶與固定化柚苷酶酶解反應(yīng)的雙倒數(shù)曲線Fig.9 Double reciprocal curve of enzymatic hydrolysis of free naringinase and immobilized naringinase

3 結(jié)語(yǔ)

以海藻酸鈉、羧甲基殼聚糖及硅膠為原材料制備的微球?yàn)檩d體，以體積分?jǐn)?shù)為6%的戊二醛作交聯(lián)劑，對(duì)柚苷酶進(jìn)行固定化。結(jié)果表明，最佳固定化條件：硅膠/羧甲基殼聚糖微球質(zhì)量比1.0∶1.5、交聯(lián)時(shí)間2.0 h、最佳固定化溫度25 ℃、偶聯(lián)時(shí)間4 h、給酶量465.6 U/mL，此時(shí)海藻酸鈣/硅膠/羧甲基殼聚糖復(fù)合微球固定化柚苷酶的酶比活力、載酶率和酶活力回 收率分別為 203.33 U/g、36.80% 以 及62.15%。同時(shí)，固定化柚苷酶在弱堿性條件下，循環(huán)利用3 次之后，依然剩余46.90%的酶活力，在制備堿性醫(yī)藥中間體（如普魯寧等）方面具有較大的應(yīng)用潛力。另外，對(duì)海藻酸鈣/硅膠/羧甲基殼聚糖復(fù)合微球固定化柚苷酶的酶學(xué)性質(zhì)研究結(jié)果顯示，相比游離柚苷酶，固定化柚苷酶對(duì)pH 和溫度都表現(xiàn)出更好的穩(wěn)定性，具有良好的操作穩(wěn)定性和儲(chǔ)藏穩(wěn)定性。作者將羧甲基殼聚糖和海藻酸鈉引入硅膠作為載體進(jìn)行柚苷酶的固定化研究，所取得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果為創(chuàng)新酶固定化載體，進(jìn)一步拓寬柚苷酶在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域的應(yīng)用和發(fā)展提供了充分的技術(shù)準(zhǔn)備和數(shù)據(jù)支持。