文莉雅, 雅各布·馬西卡, 王子赫, 王 松, 梁華敏△

1華中科技大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)系,湖北省藥物靶點(diǎn)研究與藥效學(xué)評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,武漢 430030 2華中科技大學(xué)國(guó)家基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)示范中心,武漢 430030 3肯雅塔大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)系,肯尼亞內(nèi)羅畢 43844-00100

單細(xì)胞RNA測(cè)序(single-cell RNA sequencing,scRNA-seq)分析單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄譜以發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)并揭示細(xì)胞間通訊,而這些重要信息往往在批量分析中被掩蓋[1]。單細(xì)胞核測(cè)序技術(shù)(single-nucleus RNA-sequencing,snRNA-seq)對(duì)單個(gè)細(xì)胞核進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,是scRNA-seq技術(shù)的修訂或替代方案[2],該技術(shù)提取心肌細(xì)胞核用于單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析成年心肌細(xì)胞,可以彌補(bǔ)成年動(dòng)物心肌細(xì)胞太大導(dǎo)致無(wú)法應(yīng)用液滴儀捕獲單細(xì)胞的不足[3-5]。心臟的第1個(gè)單細(xì)胞基因表達(dá)分析是利用單細(xì)胞qPCR(quantitative polymerase chain reaction)技術(shù)完成的,而scRNA-seq技術(shù)應(yīng)用于心臟研究則相對(duì)滯后[6-7]。在最近的Tabula Muris研究中[8],作者通過(guò)分析來(lái)自20個(gè)小鼠組織的100000個(gè)細(xì)胞,利用流式細(xì)胞分選(fluorescence activated cell sorter,FACS)技術(shù)分選出大約4000個(gè)心臟細(xì)胞后結(jié)合Smart-seq2(switching mechanism at 5′end of the RNA transcript),并使用液滴微流控細(xì)胞分離法獲得幾百個(gè)心肌細(xì)胞,實(shí)現(xiàn)了更高通量的3′端短讀測(cè)序。迄今為止,大型數(shù)據(jù)集Tabula Muris Senis已有超過(guò)350000個(gè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄譜分析,其中包括約18282個(gè)心臟細(xì)胞。

sc/snRNA-seq技術(shù)已經(jīng)成功鑒定出心臟中的主要細(xì)胞類(lèi)型,包括心肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和免疫細(xì)胞,并準(zhǔn)確闡釋了這些細(xì)胞的異質(zhì)性[3,9-11]。這些研究體現(xiàn)出單細(xì)胞研究在確定心臟發(fā)育和心臟再生途徑方面的獨(dú)特價(jià)值。因此,本文將著重介紹scRNA-seq及snRNA-seq技術(shù)對(duì)揭示心臟發(fā)育過(guò)程中心臟細(xì)胞異質(zhì)性,及其在心臟發(fā)育和心臟再生研究中的作用;總結(jié)這些技術(shù)如何顯著改變我們對(duì)心臟研究的理解和實(shí)驗(yàn)策略。

1 sc/snRNA-seq分析成人心臟中的心肌細(xì)胞圖譜

scRNA-seq或snRNA-seq技術(shù)將研究范圍縮小到心臟中的亞結(jié)構(gòu)或功能特異性細(xì)胞[2,4,12]。通過(guò)人類(lèi)心臟的287269個(gè)心肌細(xì)胞核的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)心臟中的9種主要細(xì)胞種類(lèi)和20種細(xì)胞亞群。其中4個(gè)心肌細(xì)胞亞群是心房或心室來(lái)源,分別顯示出心室特異性和性別相關(guān)的轉(zhuǎn)錄組學(xué)特征[3],它們分別是:心房肌細(xì)胞,ANKRD1high心室細(xì)胞Ⅰ,心室肌細(xì)胞Ⅱ和心室肌細(xì)胞Ⅲ。該研究還描述了左心房和左心室之間的2058個(gè)差異表達(dá)基因(differentially expressed genes,DEGs),以及右心房和右心室之間的1134個(gè)DEGs。在這些DEGs中,HEY2和MYH7在心室中高度表達(dá),NPPA和MYL4在心房中高度表達(dá)。這些基因差異更準(zhǔn)確地闡釋了心肌細(xì)胞的多樣性。

除了腔室特異性心肌細(xì)胞圖譜,scRNA-seq或snRNA-seq技術(shù)還鑒定出許多其他特殊的心肌細(xì)胞亞型。通過(guò)將竇房結(jié)與非竇房結(jié)心房組織的定量蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)相結(jié)合,小鼠竇房結(jié)的snRNA-seq分析鑒定出竇房結(jié)細(xì)胞富集的離子通道蛋白[4];這些細(xì)胞的顯著特點(diǎn)之一是細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)含量高并具有特殊代謝狀態(tài),即脂質(zhì)代謝,從而揭示出竇房結(jié)作為心臟起搏點(diǎn)的重要分子基礎(chǔ)。由于細(xì)胞形狀影響基因異質(zhì)性、生物信號(hào)通路以及多種生物學(xué)過(guò)程,從而改變細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄譜[12],細(xì)胞形狀變化顯著上調(diào)氧化磷酸化、蛋白激酶A和心臟β-腎上腺素能信號(hào)通路的相關(guān)基因;形狀異常的方形病理性細(xì)胞表達(dá)更多參與心肌細(xì)胞凋亡和壞死過(guò)程的基因。獨(dú)特的增殖性心肌細(xì)胞亞群高表達(dá)有絲分裂和細(xì)胞分裂相關(guān)標(biāo)記Mki67、驅(qū)動(dòng)蛋白樣運(yùn)動(dòng)蛋白中心體相關(guān)蛋白E(CENPE)和驅(qū)動(dòng)蛋白酶家族成員23號(hào)(Kif23);這種增殖的單細(xì)胞核心肌細(xì)胞亞群在細(xì)胞周期的G2期積累[5]。此外,DEG分析通過(guò)高表達(dá)與低表達(dá)基因來(lái)鑒定傳導(dǎo)系統(tǒng)不同區(qū)域的分子特征[13];也鑒定出心臟內(nèi)存在一組以?xún)?nèi)皮和心肌標(biāo)記物為特征的“內(nèi)皮樣心肌細(xì)胞”[3,10]。盡管這類(lèi)細(xì)胞的功能不明,但為后續(xù)的進(jìn)一步研究提供了新的潛在研究對(duì)象。

2 sc/snRNA-seq分析成人心臟中的非心肌細(xì)胞圖譜

心臟成纖維細(xì)胞是心臟中至關(guān)重要的非心肌細(xì)胞(non-cardiomyocyte,NCM)細(xì)胞類(lèi)型,它們?cè)谡：凸δ苁д{(diào)的心臟中作用復(fù)雜。scRNA-seq技術(shù)在成人心臟中鑒定出具有不同功能和特征的成纖維細(xì)胞[3,11]。在小鼠中[11],心臟成纖維細(xì)胞被聚類(lèi)成5個(gè)亞群:肌成纖維細(xì)胞(表達(dá)αSMA),活化成纖維細(xì)胞(表達(dá)Postn),Sca1-高成纖維細(xì)胞,Sca1-低成纖維細(xì)胞和表達(dá)Wnt成纖維細(xì)胞。在人類(lèi)[3]只發(fā)現(xiàn)靜息成纖維細(xì)胞(無(wú)Postn表達(dá)),并被聚類(lèi)成3個(gè)亞群。3個(gè)亞群的特殊特征分別是心房標(biāo)志物NPPA、纖維化相關(guān)基因NOX4和促纖維化標(biāo)志物ADAMTS4。這些成纖維細(xì)胞在發(fā)育過(guò)程中可以發(fā)生適應(yīng)[9],并隨疾病進(jìn)展發(fā)生變化[11]。心肌損傷會(huì)伴隨活化成纖維細(xì)胞增殖能力增加,因而促進(jìn)瘢痕形成而心肌收縮能力下降[14]。

使用scRNA-seq或snRNA-seq[3,10-11,15-16]跨多個(gè)組織[17](心臟,肝臟,肺和血液)對(duì)免疫細(xì)胞群進(jìn)行分析比較,已確定特定組織或特定細(xì)胞群的特定基因表達(dá)模式。Dick等[18]鑒定出4個(gè)巨噬細(xì)胞亞群:Timd4亞群,CCR2-MHC-Ⅱhigh亞群,CCR2+亞群和Isg亞群。其中,在小鼠[11,18]和人類(lèi)[3,18]心臟中均鑒定出特征性的Cx3cr1highAdgre1(F4/80)highH2-Aa(MHC-Ⅱ)+Itgam(CD11b)lowLy6c2lowCcr2-心臟常駐巨噬細(xì)胞。TIMD4+LYVE1+MHC-ⅡlowCCR2-心臟常駐巨噬細(xì)胞為可再生細(xì)胞群,有助于維持巨噬細(xì)胞的穩(wěn)態(tài);心肌損傷后這類(lèi)細(xì)胞持續(xù)存在[11,18]。人類(lèi)心臟中的兩個(gè)巨噬細(xì)胞亞群都表達(dá)M2極化相關(guān)基因(RBPJ和F13A1)和跨膜膠原COL23A1[3]。伴隨衰老,這些抗炎性M2巨噬細(xì)胞顯著高表達(dá)HPGDS,該基因可編碼前列腺素的產(chǎn)生,因此與心臟衰老過(guò)程中的免疫內(nèi)環(huán)境失調(diào)密切相關(guān)[19]。CD119+心臟B細(xì)胞是循環(huán)B細(xì)胞的一個(gè)亞群[20],它們被聚類(lèi)為4個(gè)亞群:CD11b+CD5+IgMhigh,CD11b+CD5-IgMhigh,CD11b-CD21+CD23+和CD11b-CD21-CD23-[16,20]。在發(fā)育過(guò)程中這些心臟B細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄譜發(fā)生變化并處于動(dòng)態(tài)平衡[16,20]。

第3類(lèi)被深入研究的NCM細(xì)胞類(lèi)型是內(nèi)皮細(xì)胞。利用scRNA-seq技術(shù)已經(jīng)成功鑒定出人類(lèi)的血管和非血管內(nèi)皮細(xì)胞[3],包括表達(dá)PROX1、FLT4和PDPN的淋巴內(nèi)皮細(xì)胞以及表達(dá)BMX的動(dòng)脈特異性?xún)?nèi)皮細(xì)胞。除這兩個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞亞群外,在小鼠心臟中還發(fā)現(xiàn)了微血管內(nèi)皮細(xì)胞(Ly6a+)、靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(rNr2f2+和Vwf+)和循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞群[11]。此外,還鑒定出一些同時(shí)高表達(dá)兩種細(xì)胞譜系標(biāo)記物的雜交細(xì)胞,例如成纖維細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞雜交群體和巨噬細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞雜交群體。

3 sc/snRNA-seq分析關(guān)鍵心肌譜系及其在小鼠心臟發(fā)育過(guò)程中的細(xì)胞命運(yùn)

細(xì)胞命運(yùn)映射實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí),小鼠Nkx2-5+和Isl-1+心臟祖細(xì)胞(cardiac progenitor cell,CPC)起源于Mesp1+CPC,它們?cè)谠c胚形成期間引導(dǎo)中胚層分化發(fā)育為第一心區(qū)(first heart field,FHF)和第二心區(qū)(second heart field,SHF),此后Nkx2-5+和Isl1+CPCs具有心肌細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的多系分化潛力[21]。scRNA-seq或snRNA-seq在此基礎(chǔ)上揭示出小鼠心臟發(fā)育過(guò)程中CPC細(xì)胞命運(yùn)的更多詳細(xì)信息。

Lescroart等[22]通過(guò)scRNA-seq技術(shù)揭示出心臟譜系分化的最早步驟。他們發(fā)現(xiàn)5個(gè)Mesp1+CPC亞群,每個(gè)亞群對(duì)應(yīng)不同譜系細(xì)胞的分化:DCT1表達(dá)內(nèi)皮或心內(nèi)膜譜系標(biāo)志物Sox7、Etv2和Tal1,DCT2表達(dá)心臟標(biāo)志物Hand1、Bmp4和Tnnc1等,DCT3和DCT4表達(dá)第二心區(qū)(SHF)標(biāo)志物Tbx1、Foxc2、Hoxb1和Hoxal,DCT5表達(dá)內(nèi)皮標(biāo)志物Sox17和Foxa2。Mesp1+CPC異質(zhì)性解釋了原腸胚形成階段心臟發(fā)育過(guò)程中的早期細(xì)胞限制和區(qū)域分離。除此之外,Mesp1KO小鼠心臟中外胚層細(xì)胞標(biāo)志物基因上調(diào),而心臟譜系分化相關(guān)的基因下調(diào)。這表明Mesp1對(duì)于CPC退出多能狀態(tài)及誘導(dǎo)心血管細(xì)胞譜系分化是必要的。

針對(duì)純化的心肌細(xì)胞或腔室心肌細(xì)胞的scRNA-seq分析,不僅證實(shí)Nkx2-5+和Isl-1+CPC對(duì)心臟發(fā)育的貢獻(xiàn),還提供了其功能差異的更多詳細(xì)信息,并鑒定出一些新的基因/轉(zhuǎn)錄因子[23-24]或腔室特異性基因[23-25]。Hand2為流出道細(xì)胞特異性基因且與右心室細(xì)胞無(wú)關(guān)[25]。Isl-1+CPC和Nkx2-5+CPC與心臟腔室發(fā)育密切相關(guān):SHF起源于Isl-1+CPC;心室肌細(xì)胞起源于Nkx2-5+CPC,因?yàn)镹kx2-5-/-細(xì)胞表現(xiàn)出與左心房心肌細(xì)胞最相似的轉(zhuǎn)錄譜[23]?；诎l(fā)現(xiàn)的差異最顯著的500個(gè)腔室特異性基因,研究人員成功建立基于解剖結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄圖譜(anatomical transcription-based legend from analysis of single-cell RNA sequencing,ATLAS-seq),以>91%的準(zhǔn)確度推斷出單個(gè)CM的解剖起源。Nkx2-5+亞群顯示出發(fā)育特征,而Isl-1+亞群則沒(méi)有。此外,scRNA-seq技術(shù)發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞也表達(dá)腔室特異性基因,這有利于追蹤來(lái)自不同腔室的內(nèi)皮細(xì)胞的起源[23]。通過(guò)scRNA-seq分析純化的E7.5、E8.5和E9.5心肌細(xì)胞的發(fā)育軌跡,揭示出不同CPC在心臟發(fā)育過(guò)程中的不同功能:發(fā)育早期表達(dá)高水平Nkx2-5的Nkx2-5+CPC主要向心肌細(xì)胞分化;然而,Nkx2-5+CPC的長(zhǎng)期高表達(dá)Nkx2-5會(huì)向非心肌細(xì)胞分化。Isl-1+CPC比Nkx2-5+CPC更傾向于多譜系分化[24]。不僅如此,Nkx2-5+Isl-1+CPC被聚類(lèi)為Isl-1+CPC亞群。對(duì)于這兩種CPC,引物基因(CPC發(fā)育過(guò)程中下降)和從頭起源基因(CPC發(fā)育期間增加)截然不同[24]。

4 sc/snRNA-seq分析小鼠心臟發(fā)育過(guò)程中細(xì)胞-細(xì)胞間通訊的重要作用

細(xì)胞微環(huán)境通過(guò)生物物理因素和生化因素對(duì)心臟細(xì)胞命運(yùn)起著關(guān)鍵作用[26]。Wang等[9]將從新生第1天(postnatal day 1,P1)到第56天(P56)心臟細(xì)胞的主要細(xì)胞類(lèi)型聚類(lèi)為未成熟和成熟細(xì)胞。他們確定這些未成熟和成熟單細(xì)胞之間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相互作用,并發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞的亞群轉(zhuǎn)變與心肌細(xì)胞的成熟密切相關(guān)。免疫細(xì)胞也很重要,因?yàn)橼吇饔肹MIF(巨噬細(xì)胞遷移抑制因子)-CXCR2(C-X-C基序趨化因子受體2)]介導(dǎo)了FHF和SHF中CPC之間的譜系間通訊[27]。

5 sc/snRNA-seq分析多能干細(xì)胞誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞或重編程產(chǎn)生的心肌細(xì)胞

由于技術(shù)缺陷和樣本不足,使用scRNA-seq技術(shù)分析人類(lèi)心臟樣本的工作相對(duì)不足。誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞[28]或重新編程的心肌細(xì)胞[29]是一個(gè)關(guān)鍵的生物學(xué)模型。在人誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞的心臟分化第14天和第15天[30],心肌細(xì)胞表達(dá)腔室特異性基因,并在3個(gè)心臟分化階段鑒定出6個(gè)心肌細(xì)胞亞群:高表達(dá)NR2F2和Isl-1的分化早期階段細(xì)胞亞群,高表達(dá)TBX5的中間分化狀態(tài),以及高表達(dá)HEY2和HOPX的晚期分化階段。這表明不同心肌細(xì)胞亞群可能與相反的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子介導(dǎo)的心臟成熟有關(guān)。scRNA-seq分析還有益于促進(jìn)心肌細(xì)胞重編程效率[31]:研究發(fā)現(xiàn)Gata4、Mef2c和Tbx5足以重編程新生小鼠心臟成纖維細(xì)胞為心肌細(xì)胞。

6 臨床應(yīng)用與未來(lái)展望

迄今,心臟的scRNA-seq和snRNA-seq研究已經(jīng)建立再生和非再生小鼠心臟中的單細(xì)胞基因表達(dá)全面的數(shù)據(jù)庫(kù)。已揭示的細(xì)胞組成特征、潛在的細(xì)胞間信號(hào)通訊關(guān)系、基因表達(dá)模式和順式調(diào)控機(jī)制將為新生兒心臟再生研究提供重要基礎(chǔ)。這些數(shù)據(jù)立足于單細(xì)胞,為研究心臟發(fā)育、穩(wěn)態(tài)維持、疾病發(fā)生及病程進(jìn)展的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)有重要價(jià)值。然而,當(dāng)前的sc/snRNA-seq技術(shù)仍存在一定的缺陷,例如無(wú)法可靠地檢測(cè)單細(xì)胞/單細(xì)胞核低水平表達(dá)的基因,從而掩蓋了一些潛在的生物變異[32]。這些技術(shù)缺陷被攻克后可以更好促進(jìn)該技術(shù)在各個(gè)領(lǐng)域的應(yīng)用。