任 孟，易丹暘，孫偉娜，黃海水，劉 敏，馬 超

（樂(lè)凱醫(yī)療科技有限公司 河北省醫(yī)用影像材料及應(yīng)用技術(shù)創(chuàng)新中心<籌> 河北 保定 071054）

0 引言

血液中的葡萄糖稱為血糖（Glu）。葡萄糖在人體中扮演著極其重要的角色，是提供能量的主要來(lái)源[1]。正常人體每天需要大量的葡萄糖，來(lái)為各種組織和器官的正常工作提供動(dòng)力。因此，血糖的濃度必須維持在一個(gè)較為穩(wěn)定的水平，這樣才能維持體內(nèi)各器官組織的需要，在臨床診斷上意義重大[2-4]。

目前，臨床診斷血糖的常規(guī)方法主要有濕化學(xué)法和干化學(xué)法[5-6]。其中干化學(xué)法是今年來(lái)應(yīng)用于臨床檢驗(yàn)專業(yè)新出現(xiàn)的檢測(cè)方法，其相對(duì)于濕化學(xué)法具有準(zhǔn)確度高、快速檢測(cè)和精密度好等優(yōu)點(diǎn)[7-9]，受到了許多大型三甲醫(yī)院的急診科室的青睞。本文以干化學(xué)技術(shù)為基礎(chǔ)，制備出血糖檢測(cè)干片，并對(duì)其進(jìn)行測(cè)試，為檢測(cè)干片的開(kāi)發(fā)提供新的思路。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器及設(shè)備

實(shí)驗(yàn)所用的主要儀器及設(shè)備如表1。

表1 實(shí)驗(yàn)儀器及設(shè)備

1.2 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

實(shí)驗(yàn)所用的主要材料及試劑如表2。

表2 實(shí)驗(yàn)材料及試劑

1.3 血糖檢測(cè)干片的構(gòu)建及檢測(cè)原理

取一定量的明膠，加入適量的去離子水，配置成含量為20%的明膠溶液，然后分別取葡萄糖氧化酶、過(guò)氧化物酶、4-氨基安替比林、DHBS，加入上述明膠溶液當(dāng)中。再加入適量的S-24表面活性劑，將混合溶液攪拌均勻，在PET片上涂膜，厚度為400 μm，再放入烘箱中40 ℃干燥。

干片組裝：在干燥后的試劑層上再涂覆一層薄薄的明膠液，將超濾膜完整地貼敷在上面，放入烘箱中40 ℃干燥。干燥完成后取出片子，裁剪成統(tǒng)一規(guī)格的干片。

其中超濾膜不僅可以把待測(cè)樣品快速均勻地?cái)U(kuò)散在試劑層表面，還可以過(guò)濾掉待測(cè)樣品中的干擾物質(zhì)，試劑層中含有可以與待測(cè)樣品發(fā)生特定反應(yīng)的物質(zhì)，同時(shí)試劑層有良好的熱穩(wěn)定性，也為待測(cè)樣品提供了一個(gè)穩(wěn)定的反應(yīng)場(chǎng)所；支持層采用PET薄膜，不僅可以起到支撐試劑層和超濾膜的作用，其高透光率的特性也有利于后續(xù)檢測(cè)。

在自制的葡萄糖檢測(cè)干片上滴加一定量的葡萄糖待測(cè)液，溶液在超濾膜上快速均勻地?cái)U(kuò)散到試劑層中，與試劑層中的反應(yīng)物質(zhì)發(fā)生氧化反應(yīng)并發(fā)生顏色變化，該反應(yīng)過(guò)程如圖1所示，反應(yīng)形成的斑點(diǎn)顯色程度相同，說(shuō)明斑點(diǎn)上的任意一點(diǎn)對(duì)特定波長(zhǎng)光的吸收是相等的，即吸光度相等，進(jìn)而得出任意一點(diǎn)的光反射率也是相等的。使用反射密度儀對(duì)檢測(cè)干片的光反射率進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)原理如圖2所示，光源發(fā)出的光線打到檢測(cè)干片上，然后干片發(fā)生顯色反應(yīng)，在此狀況下，干片的顯色物質(zhì)將會(huì)吸收特定波長(zhǎng)下的光，然后又被超濾膜反射到檢測(cè)器上，得到該顯色物質(zhì)的光反射率，同時(shí)檢測(cè)器可將光反射率轉(zhuǎn)化為吸光度。因?yàn)槲舛扰c反應(yīng)的顯色程度有關(guān)，即與待測(cè)樣品的濃度有關(guān)，所以顯色物質(zhì)的光反射率就可以和待測(cè)樣品的濃度建立一一對(duì)應(yīng)的關(guān)系，可以通過(guò)光反射率的大小得到待測(cè)樣品濃度的大小。

圖1 自制葡萄糖檢測(cè)干片顯色過(guò)程

圖2 光反射率檢測(cè)原理

2 應(yīng)用評(píng)價(jià)

2.1 不同血糖濃度梯度檢測(cè)

按照葡萄糖試劑盒的檢測(cè)范圍配制不同濃度的葡萄糖待測(cè)液，分別為30、60、120、180、240、300 mg/dL。

在自制葡萄糖檢測(cè)干片的表面滴加10 μL葡萄糖待測(cè)液，在37 ℃條件下反應(yīng)5 min，然后使用反射密度儀在540 nm波長(zhǎng)條件下測(cè)其光反射率，自制葡萄糖檢測(cè)干片滴加不同濃度葡萄糖待測(cè)液反應(yīng)后的反射率如圖3所示。

圖3 不同濃度葡萄糖待測(cè)液反應(yīng)后的反射率曲線

從圖中可以看出，檢測(cè)干片在滴加葡萄糖待測(cè)液反應(yīng)后的反射率值隨著葡萄糖待測(cè)液濃度的增加而減小。這是因?yàn)槠咸烟谴郎y(cè)液濃度越高，檢測(cè)干片的顯色越深，對(duì)540 nm處波長(zhǎng)光的吸收越多，因此被超濾膜反射到檢測(cè)器的光強(qiáng)減弱，進(jìn)而導(dǎo)致檢測(cè)干片的反射率減小；反之，反射率增大。從圖中也可以看出，自制的葡萄糖檢測(cè)干片對(duì)于不同濃度的葡萄糖待測(cè)液具有靈敏的響應(yīng)變化。經(jīng)過(guò)計(jì)算得知，圖中的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=-0.108ln(x)+ 0.683，其中R2=0.987，符合Williams-Clapper定律，其線性范圍為30～300 mg/dL。

2.2 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

重復(fù)性是指要盡可能保持實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中的條件不變，在較短時(shí)間內(nèi)對(duì)樣本進(jìn)行重復(fù)測(cè)量的結(jié)果，是體外診斷檢測(cè)干片的一個(gè)重要指標(biāo)。為了使自制的葡萄糖檢測(cè)干片能夠很好地應(yīng)用到臨床檢驗(yàn)，本實(shí)驗(yàn)對(duì)同一批自制的葡萄糖檢測(cè)干片的光反射率進(jìn)行了測(cè)試。

在其表面滴加10 μL同批次、等濃度的血清，37 ℃下，反應(yīng)時(shí)間5 min，并重復(fù)實(shí)驗(yàn)6次，用反射密度儀檢測(cè)這6次的反射率，所得結(jié)果如表3所示。

由表3可知，反應(yīng)所形成的顏色光反射率偏差在可接受范圍±1%以內(nèi)，說(shuō)明自制葡萄糖檢測(cè)干片重復(fù)性良好。

表3 自制葡萄糖干片的重復(fù)性

2.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

將制得的葡萄糖檢測(cè)干片放入密封袋使用真空封裝機(jī)，放于-20 ℃冰箱中保存待用。每隔3 d取出幾片自制葡萄糖檢測(cè)干片，向其表面滴加10 μL濃度為60 mg/dL的葡萄糖待測(cè)液，37 ℃條件下反應(yīng)5 min，在540 nm波長(zhǎng)下對(duì)反應(yīng)后的檢測(cè)干片進(jìn)行光反射率測(cè)定，結(jié)果如表4所示。

由表4可知，自制葡萄糖檢測(cè)干片在12 d內(nèi)光反射率變化較小，說(shuō)明自制葡萄糖檢測(cè)干片具有良好的穩(wěn)定性。

表4 自制葡萄糖干片的穩(wěn)定性

3 結(jié)論

自制的葡萄糖檢測(cè)干片對(duì)不同濃度的葡萄糖待測(cè)液有靈敏的響應(yīng)變化；重復(fù)性的反射率標(biāo)準(zhǔn)偏差小于1%；將自制的葡萄糖檢測(cè)干片密封冷凍保存12 d后，仍具有良好的穩(wěn)定性。上述結(jié)果表明，該方法在體外診斷檢測(cè)領(lǐng)域中具有較大的應(yīng)用潛力。