王 肖，盤鑫海，劉馨蘊，侯金波，2，曾艷玲

（1.中南林業(yè)科技大學 a.經(jīng)濟林培育與保護教育部重點實驗室；b.經(jīng)濟林育種與栽培國家林業(yè)局重點實驗室，湖南 長沙 410004；2.安徽泓森高科林業(yè)股份有限公司，安徽 亳州 236814）

楸樹Catalpa bungeiC.A.Mey是紫葳科梓屬植物，具有耐寒冷、速生豐產(chǎn)、適應(yīng)性強等優(yōu)點，是一種園林觀賞樹種及優(yōu)質(zhì)木材資源樹種，同時也具有珍貴的藥用價值，其葉、樹皮、種子均可作藥用[1-2]。楸樹在我國已具有幾千年的栽培歷史，自古以來就有“木王”的美稱，受到人們的廣泛喜愛[3]。然而，楸樹自花不親和，結(jié)實稀少，實生繁殖非常困難。傳統(tǒng)的扦插、嫁接等方式又難以提高成活率且繁殖系數(shù)低，因此，開展楸樹的組織培養(yǎng)研究，對縮短繁殖周期，提高繁殖系數(shù)具有重要的現(xiàn)實意義。

通過對植物器官離體培養(yǎng)，經(jīng)過脫分化與再分化建立植物離體再生體系是實現(xiàn)對珍貴種質(zhì)快速擴繁、保存和利用的生物技術(shù)育種手段之一，同時也是進行遺傳轉(zhuǎn)化研究的重要途徑之一。目前，許多研究普遍關(guān)注到不同基本培養(yǎng)基和植物生長調(diào)節(jié)劑種類對愈傷組織誘導及分化的影響[4-5]，然而僅有少量研究關(guān)注到光質(zhì)條件作用于外植體培養(yǎng)過程中也會對愈傷組織的誘導和分化產(chǎn)生顯著性影響。如郭君麗等[6]在山藥零余子愈傷組織誘導中發(fā)現(xiàn)，紅光和黃光有利于愈傷組織生長率的提高；陳博[7]在喜樹愈傷組織形成與分化研究中發(fā)現(xiàn)，藍光對愈傷組織的誘導具有顯著的影響。近年來，楸樹組織培養(yǎng)植株再生已得到較為廣泛的關(guān)注，大部分研究圍繞帶芽莖段展開，已成功建立起快繁體系[8-9]。而在愈傷組織誘導方面的研究較少，僅有楊燕等[10]以楸樹無菌苗各器官為外植體探討不同基本培養(yǎng)基、6-BA和NAA對愈傷組織誘導的影響；Lin等[11]研究了6-BA和NAA不同濃度配比下愈傷組織的誘導情況。有關(guān)綜合討論基本培養(yǎng)基、植物生長調(diào)節(jié)劑以及培養(yǎng)光質(zhì)條件對楸樹葉柄誘導愈傷組織的影響的研究尚未見報道。

本研究以楸樹無菌苗幼嫩葉柄為外植體，研究基本培養(yǎng)基、植物生長調(diào)節(jié)劑和光質(zhì)條件對楸樹愈傷組織誘導及分化的影響，以期為種苗繁育及基因功能研究提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

楸樹種子來源于安徽泓森高科林業(yè)股份有限公司。本研究以楸樹種胚組織培養(yǎng)獲得的無菌苗為試驗材料，取楸樹無菌苗幼嫩的葉柄作為誘導愈傷組織的外植體。

1.2 試驗方法

1.2.1 楸樹無菌苗及種胚愈傷組織的獲取

將10月份采摘于母樹上的楸樹種子帶回實驗室，進行如下消毒處理：自來水浸泡48 h，流水沖洗3 h，超凈工作臺上75%酒精消毒30 s，無菌水沖洗4次，然后用0.1%升汞浸泡4 min，期間不斷搖晃，無菌水沖洗5～6次。消毒后的種子放到濾紙上待用，接種時剝?nèi)シN子外種皮，接種到MS培養(yǎng)基中，待其長出楸樹無菌苗用作葉柄愈傷組織誘導的材料。

經(jīng)過葉柄愈傷組織誘導培養(yǎng)條件篩選后，取消毒后的種胚接種至最佳培養(yǎng)條件下誘導愈傷組織，用作后續(xù)再分化研究的驗證材料。

1.2.2 楸樹葉柄愈傷組織的誘導

1）外植體接種培養(yǎng)基組合

以培養(yǎng)基、植物生長調(diào)節(jié)劑（6-BA，NAA）和光質(zhì)作為研究影響因素，設(shè)計4因素3水平正交試驗L9（43）（表1），共9種組合（A1～A9），另培養(yǎng)基中附加30 g·L-1蔗糖，6.5 g·L-1瓊脂，pH值調(diào)節(jié)為5.8～5.9，將培養(yǎng)基在121℃高溫高壓下滅菌15 min。

表1 4因素3水平脫分化正交試驗Table 1 The differentiation orthogonal test of 4 factors and 3 levels

2）外植體的接種

待楸樹無菌苗長到5～6 cm高時，取無菌苗的葉柄作為外植體，切成0.6～0.8 cm的小段，接種到A1～A9組培養(yǎng)基中，每組接種10～12個外植體，重復3次，置于各光質(zhì)(LED光源）下培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為（25±5）℃，光照時間16 h/d，光照強度為（50±5）μmol·m-2·s-1，30 d后統(tǒng)計各組愈傷組織誘導率。

1.2.3 楸樹葉柄誘導愈傷組織的顯微結(jié)構(gòu)觀察

取9組培養(yǎng)基誘導出的愈傷組織，切成小正方體（0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm），置于FAA固定液中，經(jīng)過固定→脫水→透明→浸蠟→包埋、切片→脫蠟→復水→染色→封片等步驟，在Olympus BX53顯微鏡下觀察。

1.2.4 楸樹愈傷組織的再分化

以培養(yǎng)基、植物生長調(diào)節(jié)劑（TDZ、NAA）和光質(zhì)作為研究影響因素，設(shè)計4因素3水平正交試驗L9（43）（表2），共9種組合（B1～B9），培養(yǎng)基中附加30 g·L-1蔗糖，6.5 g·L-1瓊脂，pH值調(diào)節(jié)為5.8～5.9，將培養(yǎng)基在121℃高溫高壓下滅菌15 min。

表2 4因素3水平再分化正交試驗Table 2 The re-differentiation orthogonal test of 4 factors and 3 levels

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

采用Photoshop軟件處理圖片，采用Excel 2010和SPSS 26.0軟件對試驗數(shù)據(jù)分別進行方差分析、LSD多重比較和Duncan多重比較。每處理中愈傷組織誘導率和出芽率按以下公式計算：

誘導率=（誘導出的愈傷組織數(shù)量/接種外植體總數(shù)）×100%；

出芽率=（誘導出芽的愈傷組織塊/接種愈傷組織總數(shù)）×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基和光質(zhì)對愈傷組織誘導的影響

在楸樹葉柄誘導愈傷組織正交試驗的9個處理中，接種4 d后葉柄兩端均開始膨大；8 d后一端可見明顯的愈傷組織形成，白光下的A1、A5和A9組愈傷組織塊大于其他光照下的組合；28 d后各組葉柄長成大小、形態(tài)與色澤不一的完整愈傷組織（圖1）。

圖1 葉柄在各組培養(yǎng)基下誘導的愈傷組織Fig.1 Petiole-induced callus in each medium group

正交試驗結(jié)果（表3）表明，將幼嫩的葉柄接種在不同培養(yǎng)基中，A1組和A5組下的愈傷組織誘導率顯著高于其他處理組，為100%；A7組和A9組的愈傷誘導率也達到90%以上。由表3中的極差值可以發(fā)現(xiàn)光質(zhì)的極差值最大，其次是6-BA和NAA，且6-BA的極差值大于NAA，基本培養(yǎng)基的極差值最低，因此這4個因素對楸樹葉柄誘導愈傷組織的作用大小依次為光質(zhì)＞6-BA濃度＞NAA濃度＞基本培養(yǎng)基。通過計算K值可知，基本培養(yǎng)基以MS效果最佳，6-BA的最佳濃度為1.0 mg·L-1，NAA最佳濃度為0.10 mg·L-1，光質(zhì)以白光條件效果最好。

表3 葉柄誘導愈傷組織正交試驗結(jié)果?Table 3 Results of the orthogonal test for callus induction of petioles

方差分析結(jié)果（表4）顯示，各因素之間的主間效應(yīng)為：基本培養(yǎng)基對楸樹葉柄誘導愈傷組織的影響不具有顯著性，6-BA濃度、NAA濃度和光質(zhì)對楸樹葉柄誘導愈傷組織的影響具有顯著性。

表4 葉柄誘導愈傷組織方差分析Table 4 Variance analysis for callus induction of petioles

針對顯著性影響因素6-BA濃度、NAA濃度和光質(zhì)進行了Duncan多重比較分析，結(jié)果如圖2所示。各因素各水平的多重比較分析結(jié)果顯示：6-BA濃度3個水平中，1.0 mg·L-1的影響顯著優(yōu)于3.0 mg·L-1和5.0 mg·L-1；NAA濃度的3個水平中，0.10 mg·L-1略優(yōu)于0.01 mg·L-1和0.05 mg·L-1；光質(zhì)的3個水平中，白光條件極顯著優(yōu)于紅光和藍光，因此采用白光最佳。綜上，楸樹葉柄誘導愈傷組織的最佳培養(yǎng)基配方及光質(zhì)條件為MS+1.0 mg·L-16-BA+0.10 mg·L-1NAA+白光。

圖2 6-BA，NAA，光質(zhì)3因素3水平Duncan檢驗Fig.2 Duncan test with 3 factors and 3 levels

2.2 培養(yǎng)基和光質(zhì)對愈傷組織質(zhì)量的影響

為選擇誘導出芽的最佳愈傷組織，對A1～A9各組誘導出的愈傷組織制作石蠟切片進行顯微結(jié)構(gòu)觀察，各組愈傷結(jié)構(gòu)顯微觀察如圖3所示。A1、A4、A7和A8組愈傷組織細胞排列緊密，胞質(zhì)濃厚、染色深、細胞核明顯且體積大，細胞形狀較規(guī)則。但僅從A8組愈傷組織的顯微結(jié)構(gòu)中明顯觀察到擬分生組織，初步判定其為胚性愈傷組織。A2、A3、A5、A6和A9組愈傷組織細胞形狀不規(guī)則且排列疏松，胞質(zhì)稀薄、染色淺、細胞核小，沒有發(fā)現(xiàn)明顯的分生結(jié)構(gòu)，為非胚性愈傷組織。

圖3 愈傷組織顯微觀察結(jié)構(gòu)Fig.3 Microscopic observation of the structure of the callus

2.3 培養(yǎng)基和光質(zhì)對愈傷組織出芽的影響

分析獲得的最佳愈傷組織誘導培養(yǎng)基MS+1.0 mg·L-16-BA+0.10 mg·L-1NAA，在白光下培養(yǎng)楸樹葉柄獲得100%的愈傷率。根據(jù)愈傷率和愈傷組織顯微觀察結(jié)果，取該條件下和A8組下誘導出的愈傷組織塊接種到B1～B9共9組培養(yǎng)基中進行再分化培養(yǎng)，結(jié)果僅在A8條件下的B8組培養(yǎng)基中（DKW+0.2 mg·L-1TDZ+0.01 mg·L-1NAA+藍光條件）分化出了不定芽（圖4）。

圖4 愈傷組織出芽情況Fig.4 Budding of the callus

為更好地分析基本培養(yǎng)基、植物生長調(diào)節(jié)劑等因素在愈傷組織再分化過程中所產(chǎn)生的影響，以期探索出適合的愈傷組織再分化培養(yǎng)條件。進一步對B1～B9組培養(yǎng)基進行驗證試驗，將種胚誘導出的愈傷組織接種到B1～B9組培養(yǎng)基中，一組接種6個生長狀態(tài)相近的愈傷組織塊，重復3次，28 d后統(tǒng)計試驗結(jié)果（表5）。

試驗結(jié)果表明，由種胚誘導出的愈傷組織具有較強的生長活性。接種到培養(yǎng)基10 d后，愈傷組織體積可以增殖到接種時的2倍大，但出芽的時間較長，且芽的形態(tài)呈現(xiàn)出喇叭狀，基部膨大，部分不定芽伴有玻璃化的現(xiàn)象（圖5）。由表5可知，B1組的出芽率最高，達到83.33%，其次是B8組的77.78%，即葉柄愈傷組織再分化出不定芽的培養(yǎng)基配方。另外，由極差值可以發(fā)現(xiàn)，NAA的極差值最大，其次是基本培養(yǎng)基和TDZ，光質(zhì)的極差值最小，因此這4個因素對愈傷組織再分化的作用大小依次為NAA＞基本培養(yǎng)基＞TDZ＞光質(zhì)。通過計算K值可知，基本培養(yǎng)基以MS效果最佳；TDZ最佳濃度為0.2 mg·L-1；NAA最佳濃度為0.01 mg·L-1；光質(zhì)以白光效果最佳。

圖5 愈傷組織再分化情況Fig.5 The buds of callus

表5 愈傷組織再分化試驗結(jié)果Table 5 Results of callus re-differentiation tests

方差分析結(jié)果（表6）顯示，各因素之間的主間效應(yīng)為光質(zhì)對愈傷組織再分化的影響不具有顯著性，基本培養(yǎng)基、TDZ和NAA濃度顯著影響愈傷組織再分化。因此，適合愈傷組織再分化的培養(yǎng)基為MS+0.2 mg·L-1TDZ+0.01 mg·L-1NAA，白光條件下培養(yǎng)。

表6 愈傷組織再分化方差分析表Table 6 Variance analysis for callus re-differentiation

3 結(jié)論與討論

本研究就基本培養(yǎng)基種類、激素種類、濃度和光質(zhì)對楸樹葉柄愈傷組織的誘導和再分化的影響進行比較。研究發(fā)現(xiàn)，光質(zhì)、6-BA和NAA濃度對葉柄愈傷組織的誘導有顯著影響，就誘導率而言，最佳誘導培養(yǎng)基是MS+1.0 mg·L-16-BA+0.10 mg·L-1NAA，培養(yǎng)條件為白光；而在藍光照射條件下，DKW+3.0 mg·L-16-BA+0.01 mg·L-1NAA培養(yǎng)基配方誘導出的愈傷組織后續(xù)可以成功分化出不定芽，誘導出芽的培養(yǎng)基為DKW+0.2 mg·L-1TDZ+0.01 mg·L-1NAA，培養(yǎng)條件為藍光。后續(xù)驗證試驗結(jié)果表明，種胚愈傷組織再分化的最佳培養(yǎng)條件為MS+0.2 mg·L-1TDZ+0.01 mg·L-1NAA培養(yǎng)基和白光環(huán)境,在DKW+0.2 mg·L-1TDZ+0.01 mg·L-1NAA培養(yǎng)基和藍光環(huán)境下也可以誘導出芽。

培養(yǎng)基為植物的生長發(fā)育提供營養(yǎng)，基本培養(yǎng)基的種類對愈傷組織的誘導和再分化產(chǎn)生影響。在毛桃[12]、青錢柳[13]、水曲柳[14]和濕地松[15]愈傷組織培養(yǎng)過程中，不同的基本培養(yǎng)基顯現(xiàn)出了不同的分化效果。本試驗結(jié)果表明，雖然從愈傷組織的誘導率來看，MS培養(yǎng)基最佳，但是含有DKW培養(yǎng)基的配方誘導出的愈傷組織可以成功分化出不定芽。

激素的種類和濃度是影響植物愈傷組織誘導和不定芽分化的關(guān)鍵因素。杜建武等[16]研究了辣木愈傷組織誘導與分化時內(nèi)源激素的變化，認為在選擇外源激素種類與濃度時，應(yīng)以外植體內(nèi)源激素作為參考；馬林[17]在喜樹愈傷組織誘導與培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)2.0 mg·L-16-BA+2.0 mg·L-1NAA+4.0 mg·L-16-BA+2.0 mg·L-1NAA誘導效果較好，在此基礎(chǔ)上添加2.0 mg·L-12,4-D時誘導率明顯提升。本試驗結(jié)果表明，在楸樹葉柄誘導愈傷組織過程中，不同濃度的6-BA與NAA組合均能成功誘導出愈傷組織。就其誘導率而言，細胞分裂素6-BA與生長素NAA具有顯著影響。通過計算K值發(fā)現(xiàn)較低濃度的6-BA（1.0 mg·L-1）與較高濃度的NAA（0.10 mg·L-1）有利于愈傷組織的誘導。而楊燕[10]研究發(fā)現(xiàn)楸樹無菌苗嫩莖在3.0 mg·L-16-BA和0.05 mg·L-1NAA下的愈傷組織誘導率最高。Lin等[11]發(fā)現(xiàn)在楸樹無菌苗葉柄誘導愈傷組織的過程中，NAA和6-BA的組合對愈傷組織的形成沒有顯著影響。在NAA (1.0、0.5、0.1、0.05、0.01 mg·L-1)和6-BA (5.0 mg·L-1)的濃度下均能獲得疏松、淺綠色的愈傷組織且平均誘導率達到95.7%。這可能與楸樹品種差異和不同外植體的選擇有關(guān)。TDZ被認為是目前活性較強的細胞分裂素，在多種植物愈傷組織誘導不定芽的過程中均發(fā)揮了重要作用。本試驗采用TDZ后發(fā)現(xiàn)其對楸樹愈傷組織的生長起到明顯促進作用，芽誘導效果較好。這與李晶等[18]、田歌等[19]的研究結(jié)論一致。

光對植物的生長發(fā)育具有重要的影響。光質(zhì)，即不同波長的光譜，作為一種物理調(diào)控因子已被廣泛應(yīng)用于植物組織培養(yǎng)。在葉柄誘導愈傷組織的試驗中，將光質(zhì)作為影響因素進行正交試驗設(shè)計與操作。就愈傷組織誘導率而言，LED白光、紅光和藍光均具有顯著影響，根據(jù)K值計算結(jié)果，LED白光是最有利于愈傷組織誘導的光質(zhì)，紅光次之，藍光最差。就愈傷組織的生長狀態(tài)而言，紅光下愈傷組織顏色多為淺綠色，而藍光下愈傷組織多為深綠色。這一結(jié)果與李林山等[20]的研究結(jié)果一致。但與一些學者的研究結(jié)果有所不同。熊麗等[21]在石刁柏愈傷組織的培養(yǎng)及林小蘋等[22]在龍眼愈傷組織培養(yǎng)研究中均認為藍光和紅光對愈傷組織的生長具有促進作用。王維榮等[23]在黃瓜和番茄愈傷組織培養(yǎng)研究中發(fā)現(xiàn)在藍光和紅光下愈傷組織的生物量最大。這可能是因為試驗所選光源不同，光的波長峰值及輻射有一定差異，且不同種屬及不同品系的植物之間受到光的調(diào)節(jié)作用也不一致。后續(xù)再分化試驗結(jié)果也表明在藍光條件下雖然愈傷誘導率不高，但能形成有效出芽的擬分生組織，說明藍光能促進楸樹葉柄愈傷組織形成不定芽，后續(xù)種胚愈傷組織誘導出芽的試驗結(jié)果也證實了這一點。

本試驗的局限性為葉柄愈傷組織再分化培養(yǎng)的研究不夠完整，僅討論了一組培養(yǎng)基中的不定芽誘導情況且誘導率不高，因而在后續(xù)試驗中仍需探討葉柄愈傷組織不定芽誘導的影響因素，從而篩選出更加優(yōu)良的愈傷組織再分化培養(yǎng)基配方。

綜上所述，本研究建立了一套高效的楸樹葉柄愈傷組織誘導方法，并初步探索出愈傷組織再分化的途徑，研究結(jié)果可應(yīng)用于楸樹良種組培快繁以及遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立。