白 云,周 昊

(1.四川大學望江醫(yī)院口腔科,四川 成都 610065;2.四川省醫(yī)學科學院·四川省人民醫(yī)院口腔科,四川 成都 610072)

牙齒的發(fā)育和形成是口腔上皮細胞和外胚間充質細胞之間相互作用的結果。牙本質是牙釉質下方的一層高度礦化的組織層,由管間牙本質和牙本質小管組成,它們是防止牙髓腔感染的二級屏障[1]。牙本質的喪失會導致骨支持的減少,從而干擾牙齒的功能。此外,在休息和咀嚼狀態(tài)下,根部牙本質幫助平衡,并通過牙周膜將咬合力傳遞到牙槽骨,并作為具有豐富毛細血管的血管和淋巴管以及神經束的入口,為牙齒提供營養(yǎng)和感覺[2]。控制牙本質發(fā)育的網絡由許多細胞分子和信號通路共同調控,包括生長因子、轉錄因子和其他成分,它們在牙齒發(fā)育和形成的不同階段發(fā)揮作用[3]。以往研究表明骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)信號通路在牙本質發(fā)育過程中起著重要的作用。本文總結了BMPs的一些獨特的轉錄調控和信號網絡,以及BMPs在牙本質形成過程中的精確平衡,這可能在調控牙本質形成和再生中發(fā)揮關鍵作用。

1 BMPs在牙本質發(fā)育過程中的表達

1.1 BMP-2BMP-2基因轉錄出現(xiàn)在牙板上已開始形成牙芽的區(qū)域。在大鼠牙齒發(fā)育的萌芽期(E12-13),BMP-2上皮和間充質中均有表達。在帽狀期,BMP-2的表達主要集中在胎齡14天,帽狀期晚期主要定位于上皮釉質結節(jié)。然后BMP-2的表達擴展到鄰近的內牙上皮形成次級釉質結,通過原位雜交和免疫組織化學分析,可以在牙間充質中看到BMP-2的信號。鐘狀期,原位雜交和免疫組織化學染色顯示BMP-2在牙間充質細胞中有表達,隨后,BMP-2的表達擴散到牙乳頭,并在成牙本質細胞前表達強烈。在出生后數(shù)天,BMP-2在成牙本質細胞和成釉細胞中持續(xù)表達,并在牙乳頭以及鄰近組織中檢測到,包括牙囊、牙周膜細胞、牙骨質連接、HERTWIG上皮根鞘(HERS)和牙槽骨中的成骨細胞[4]。BMP-2參與決定牙髓和牙髓干細胞向成牙本質細胞樣細胞分化的命運,并刺激牙齒相關基因的表達[5]。人類BMP-2基因的遺傳變異與非綜合征性牙齒發(fā)育不全的易感性有關,最常見的缺失牙齒是下頜切牙,其次是下頜前磨牙和上頜切牙[6]。BMP-2基因敲除小鼠會生在牙齒發(fā)育的晚期發(fā)生牙本質缺陷,表現(xiàn)為牙髓腔變寬,前牙本質變寬,牙本質變薄,牙齒磨損,牙根萌出延遲,成牙本質細胞分化和生物礦化障礙[7]。

1.2 BMP-3在牙齒發(fā)育的初始階段,BMP-3在牙齒組織中沒有表達,在鐘狀期和出生后,BMP-3在成牙本質細胞中有明顯的表達,但隨著成牙本質細胞分化的推進,其表達逐漸減弱。BMP-3在成牙本質細胞、牙囊、牙周膜細胞、成牙骨質細胞、牙根襯里細胞和活性成骨表面的成骨細胞中均有表達[8]。 BMP-3的原位雜交分析發(fā)現(xiàn),BMP-3在帽狀和鐘狀發(fā)育階段(分別為第12周和第14周)在人的門牙和磨牙中均勻分布[9]。

1.3 BMP-4在人牙胚中,BMP-4在帽狀期(12周)乳牙的內釉上皮和牙乳頭中有表達,在外釉上皮中的表達較弱,而在磨牙中的表達較強,在內釉上皮和其下的牙間充質中表達較高,而在其余牙體組織中表達較低。至鐘狀期(胎齡14周),BMP-4在內釉上皮和牙乳頭中的轉錄水平明顯高于外釉上皮和門牙的星狀網狀結構[9]。在牙齒形態(tài)發(fā)生過程中,BMP-4在牙蕾上皮和間充質之間的信號相互作用中發(fā)揮著重要作用。人類的BMP-4突變與不同類型的牙齒畸形有關,包括牙齒發(fā)育不全[10]。在BMP-4突變小鼠中,牙本質厚度減少,牙根萌出延遲,而牙髓腔體積增加。BMP-4基因敲除小鼠成牙本質細胞分化受損,BMP-4缺失導致突變的成牙本質細胞中骨鈣素、DMP1、COL1SMAD1、D1X5、OSX和磷酸化α1/5/8的表達降低[11]。

1.4 BMP-5BMP-5在小鼠牙齒發(fā)育的起始階段、萌芽階段和帽狀階段均沒有表達。然而,BMP-5轉錄本存在于鐘狀晚期分化的前成釉細胞中。在出生以后,BMP-5在成釉細胞中有明顯表達,在軟骨細胞和成骨細胞中也有表達[12]。在人類和小鼠中,BMP-5基因突變與短耳有關[13]。此外,BMP-5的遺傳變異與骨關節(jié)炎的易感性有關。BMP-5分別通過SMAD-MSXB和MEK-ERK-ID3信號通路參與神經脊祖細胞的存活和增殖[14].雖然BMP-5在牙齒發(fā)育過程中有所表達,但BMP-5在牙本質發(fā)育過程中的作用尚未詳細闡明。

1.5 BMP-6在牙齒發(fā)育的蕾狀期和帽狀期,BMP-6在牙齒間充質、牙板和釉器上皮細胞中有微弱的表達。鐘狀期,成牙本質細胞和牙乳頭中的BMP-6蛋白反應呈陽性反應。出生之后,BMP-6蛋白存在于新形成的牙周組織中的間充質細胞、成牙骨質細胞層以及牙根、牙槽骨內的成骨細胞中[15]。Cleves等研究發(fā)現(xiàn),BMP-6在刺魚牙齒發(fā)育過程中的上皮和間充質細胞中表達。與野生型或雜合型魚類相比,魚類中BMP-6基因的純合缺失導致早期幼魚的牙齒數(shù)量和牙板面積都減少了。此外,BMP-6雜合突變顯示,與相同年齡的野生型魚類相比,幼體和成體后期的牙齒數(shù)量和牙盤面積都減少了。與野生型魚類相比,BMP-6缺失魚類中轉化生長因子-β和SMAD信號的基因表達水平降低[16]。

1.6 BMP-7在芽期,BMP-7的表達定位于芽尖的早期芽期,其表達模式見于牙板區(qū)域,在那里開始形成芽。在帽狀期,抗BMP-7探針表達明顯,并局限于上皮牙釉質結節(jié)。在鐘狀期,BMP-7轉錄本從內釉上皮一直延續(xù)到前成釉細胞。當牙乳頭和前牙本質母細胞開始分泌前牙本質基質(E19)時,可檢測到其表達。在出生以后,在牙本質和釉質沉積過程中,BMP-7的表達模式出現(xiàn)在牙乳頭、成牙本質細胞和功能成釉細胞中。在第12周和第14周的人胚胎中,BMP-7在人類牙胚的帽狀期和鐘狀期的門牙和磨牙中都有微弱的表達。BMP-7在帽狀期和鐘狀期在牙齒上皮和間充質中的表達模式相當一致,在牙間充質和內釉上皮中的表達水平較高[9]。BMP-7基因敲除小鼠(WNT1-CRE:BMP-7 FX/FX)近遠中頰舌側磨牙短而寬,上頜第一磨牙和下頜第一磨牙中均存在多種形態(tài)的“額外尖牙”形態(tài)[17]。此外,BMP-7基因敲除小鼠出生時缺乏牙本質/釉質形成,牙齒萌出延遲,小鼠成牙本質細胞和成釉細胞中牙本質涎磷蛋白(DSPP)和成釉蛋白基因表達降低。BMP-7通過復雜的上皮-間充質BMP/WNT信號通路參與調控牙齒礦化的啟動[18]。

2 牙發(fā)育過程中BMP下游基因的表達

2.1 RUNX2RUNX2(又稱AML-3、PEBP2、αA、CBFA1、OSSF2)是成牙本質細胞和成骨細胞分化的關鍵轉錄調控因子。RUNX2在骨和牙齒發(fā)育中的功能依賴于牙本質形成和成骨過程中特定階段的基因表達。在活躍的上皮形態(tài)發(fā)生過程中,RUNX2在牙間充質細胞從萌芽到鐘狀早期具有獨特的表達模式。在牙齒發(fā)育的初始階段(E11),原位雜交檢測表明,在任何頭面部組織中都沒有RUNX2的表達。然而,在萌芽期(E12-E13),RUNX2轉錄本在發(fā)育中的上頜和下頜弓中形成骨和牙齒的間充質凝集物中強烈表達[19]。RUNX2基因的雜合突變導致一種常染色體顯性遺傳性人類疾病,稱為鎖骨顱骨發(fā)育不良癥,患者表現(xiàn)為牙齒多、萌出延遲、牙根畸形和無細胞牙骨質[20]。在小鼠牙齒發(fā)育的早期,RUNX2的表達在成牙本質細胞中上調,但在牙齒發(fā)育后期的成牙本質細胞中表達下調。這表明RUNX2在牙本質形成和牙齒相關基因表達中具有雙重作用。RUNX2上調成牙本質前細胞中DSPP的表達,下調成熟成牙本質細胞中DSPP的轉錄[21]。此外,SMAD泛素調節(jié)因子1(SMURF1)與RUNX2蛋白COOH末端的脯氨酸-酪氨酸(PY)結構域相互作用,誘導RUNX2蛋白降解。條件性敲除基因SMAD4小鼠(DMP1-CRE;SMAD4FX/FX)導致牙本質缺陷,表現(xiàn)為牙本質前寬、牙本質薄、牙本質小管紊亂,BSP、COL1α1、DMP1和DSPP基因表達降低[22]。

2.2 OSTERIX(OSX OR SP7)OSX是一種含鋅指的轉錄因子,在所有發(fā)育中的骨骼和牙齒中都有明顯表達[19]。它對成牙本質細胞和成骨細胞的分化具有重要作用。在小鼠牙齒發(fā)育的蕾狀期(E12),反義OSX探針在發(fā)育中的上頜弓和下頜弓中形成的骨和牙齒的間充質凝集物中表達強烈。在帽狀期(E14),OSX mRNA在牙槽骨、牙乳頭和牙囊的間充質細胞中表達,而OSX在牙齒上皮細胞中幾乎沒有表達。在鐘狀期(E16～E18),OSX轉錄本存在于分化成骨間充質、成釉細胞、成牙本質細胞和牙髓。在牙本質再生和正畸牙移動過程中,OSX在成牙本質細胞、成骨細胞和成牙骨質細胞中的表達水平均高于對照組[23]。人類和小鼠的OSX基因突變與牙齒和骨骼的缺陷有關[24]。在OSX缺失細胞中,牙根較短,呈立方體狀,成牙本質母細胞層內含少量牙本質小管。進一步的研究表明,OSX誘導牙間充質分化和礦化并表達ALP、COL1、DMP1和DSPP基因[25]。OSX對基因表達的影響受BMP-SMAD-RUNX2依賴或BMP-SMAD-RUNX2非依賴的信號通路調節(jié)。

2.3 牙本質基質蛋白(dentin matrix protein 1,DMP1)DMP1是一種非膠原蛋白,最初在牙本質中發(fā)現(xiàn),屬于小整合素結合配體N-連接糖蛋白家族,對牙齒和骨骼等硬組織的正常發(fā)育和形成是必不可少的。在小鼠牙齒發(fā)育的萌芽階段,在牙齒外胚層或間充質中都沒有檢測到DMP1的信號,但通過RT-QPCR分析,在E13和E14的小鼠第一顆下頜磨牙中可以看到DMP1的轉錄。在帽狀期(E15),DMP1在牙槽骨內新分化的成骨細胞中表達較強,而在釉質器官和牙乳頭中表達較弱。鐘狀期,DMP1在釉質器官內上皮和第一磨牙近頰尖尖新分化或年輕的成牙本質細胞中有明顯轉錄。在出生后第6天,DMP1mRNA在分化的成牙本質細胞、牙本質小管和前牙本質中明顯表達,在成熟成牙本質細胞中顯著下調,在成釉細胞中上調[26]。在DMP1基因缺失的小鼠中,牙齒形態(tài)類似于人類的牙本質形成不全III型(DGI-III),突變小鼠的牙齒表現(xiàn)為牙髓腔擴大,前牙本質寬,牙本質變薄,牙本質基質結構改變,以及礦化不足。與對照組相比,牙本質中重要的非膠原性蛋白DSPP在成牙本質細胞中的表達降低,而富含亮氨酸的蛋白多糖家族成員BIGLYCAN的表達增加[27]。

3 牙發(fā)育過程中BMP信號通路的傳導

3.1 牙本質發(fā)育和形成中的SMAD依賴信號轉導

BMPs及其受體和SMADS具有很強的成牙能力。BMPs與它們的受體結合形成復合體,導致SMAD1/5/8的磷酸化,磷酸化的SMAD1/5/8與SMAD4相互作用,磷酸化的SMAD1/5/8-SMAD4復合體從細胞質移位到細胞核,刺激它們下游的基因表達。BMP-2、BMP-4、BMP-7和BMP-9的缺失會導致牙本質形成嚴重障礙,牙髓腔擴大,前牙本質變寬,牙本質變薄,牙齒磨損,牙根萌出延遲,成牙本質細胞分化障礙,而一些與牙齒相關的基因表達降低,包括磷酸化的SMAD1/5/8、堿性磷酸酶、COLLα1、DLX3、DMP1、DSPP、OSX和RUNX2[28]。BMP-SMAD信號通路通過多種轉錄因子在牙本質形成中發(fā)揮作用,其中包括DLX3、KLF4、MSX1、MSX2、OSX、PAX9、RUNX2等。

3.2 牙本質發(fā)育和形成中的SMAD非依賴信號轉導MAPKS,主要包括ERK、JNK、P38,以及PI3K/AKT和蛋白激酶A和C通路,參與了BMP-SMAD非依賴性信號通路在牙齒發(fā)育中的作用。BMP介導的MAPKS磷酸化DLX3、KLF4、OSX、PAX9和RUNX2轉錄因子,導致磷酸化的蛋白穩(wěn)定性、核轉位、蛋白-DNA結合親和力增加、DSPP和DMP1基因表達上調和牙齒形成[29]。PI3K/AKT負責誘導細胞中BMP的信號,并磷酸化DLX3、KLF4、OSX和RUNX2蛋白,穩(wěn)定這些蛋白,激活牙齒相關基因表達,牙間充質細胞分化和礦化[30]。

4 總結

盡管在過去的幾十年里對BMP信號系統(tǒng)的研究取得了很多成果,但關于BMP的生物學功能的遺傳、細胞和分子學機制方面的許多問題仍然需要回答。BMP及其受體的下游信號通路在牙齒發(fā)育和形成,尤其是牙齒發(fā)育過程中的作用更為復雜。在人類和基因敲除小鼠模型中的遺傳分析表明,BMPs及其靶基因在成釉細胞和成牙本質細胞之間的溝通、間充質細胞的增殖和分化以及牙本質發(fā)育和形成過程中的生物礦化過程中發(fā)揮關鍵作用。應該對這些細胞和組織形態(tài)進行進一步的分析,以便更好地了解牙本質形成過程中細胞過程中每一步的潛在機制。體外和體內研究進一步剖析了BMP信號通路在牙本質發(fā)育和形成過程中的生理和發(fā)病機制的圖譜。從牙本質形成中BMP信號的分析獲得的知識也將有助于理解這些人類疾病的分子機制,并為治療牙本質缺陷提供潛在的線索。