蔣益萍，金玉娥，張志瑋，夏天爽，徐佳樂，薛黎明 （.海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室, 上海 00433；.上海市疾病預(yù)防控制中心化學(xué)品毒性檢定所, 上海 00336；3.上海市預(yù)防醫(yī)學(xué)研究院, 上海 00336）

組織蛋白酶K(CTSK) 屬于半胱氨酸蛋白酶，是細(xì)胞內(nèi)重要的溶酶體酶，在很多組織中有表達(dá)，如肺、腦、皮膚、骨骼和甲狀腺等。CTSK在體內(nèi)主要發(fā)揮降解骨膠原蛋白、彈性纖維蛋白、甲狀腺球蛋白及細(xì)胞外基質(zhì)的作用，與人類多種疾病密切相關(guān)，如腫瘤[1]、骨疾病、心血管疾病和肺纖維化等[2]。CTSK最早發(fā)現(xiàn)在破骨細(xì)胞特異性高表達(dá)，主要發(fā)揮降解骨基質(zhì)中含量達(dá)95%的Ⅰ型膠原[2]?；谏锘瘜W(xué)和結(jié)構(gòu)分析研究發(fā)現(xiàn)CTSK與黏多糖（GAGs)可形成一種復(fù)合物，如硫酸軟骨素(chondroitin-4-sulfate, C4S或CSA)，且只有這種復(fù)合物形成下才能更好發(fā)揮降解膠原作用[3]。

二至丸是治療腎陰虛癥的經(jīng)典名方，由女貞子和墨旱蓮組成，經(jīng)考證出自明代吳曼輯所著的《扶壽精方》，收載于2020版《中國藥典》，具補(bǔ)益肝腎，滋陰止血功效[4]。藥理研究發(fā)現(xiàn)二至丸具有保肝降酶、增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)、改善血液系統(tǒng)功能、抗腫瘤、抗骨質(zhì)疏松、抗衰老、抗氧化、抗變態(tài)反應(yīng)性炎癥和植物雌激素樣等作用[5]。臨床報(bào)道，二至丸常用于治療骨質(zhì)疏松[6-8]，藥理發(fā)現(xiàn)二至丸顯著降低去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠血清中CTSK水平[5]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)墨旱蓮的正丁醇提取部位和活性成分墨旱蓮皂苷IX能顯著抑制CTSK的膠原降解活性[9]。因此，二至丸很有可能存在抑制組織蛋白酶K的活性成分，故有可能從中篩選組織蛋白酶K抑制劑。本研究采用熒光偏振法考察CTSK與硫酸軟骨素A(CSA)復(fù)合物形成活性，熒光光度法考察CTSK與合成熒光底物benzyloxycarbonyl-Phe-Arg-7-amido-4-methylcoumarin (Z-FR-MCA)結(jié)合活性，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳法考察CTSK降解生理底物膠原蛋白和明膠的活性，以期從二至丸不同提取部位和活性成分中篩查具有抑制CTSK活性的抑制劑，最終闡明二至丸抑制CTSK酶活性的物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料

墨旱蓮、酒女貞子藥材購自上海華宇藥業(yè)有限公司, 經(jīng)海軍軍醫(yī)大學(xué)生藥學(xué)教研室韓婷教授鑒定墨旱蓮為菊科植物鱧腸EcliptaprostrataL.的干燥地上部分，女貞子為木犀科植物女貞Ligustrum lucidumAit.的干燥成熟果實(shí)。其活性成分異毛蕊花糖苷、橄欖苦苷、蟛蜞菊內(nèi)酯、熊果酸、齊暾果酸、蒙花苷、槲皮苷、木樨草苷、異去甲基蟛蜞菊內(nèi)酯、松果菊苷、特女貞苷、紅景天苷、女貞苷、女貞苷G13等24種標(biāo)準(zhǔn)品均購自成都瑞芬思生物科技有限公司。

Z-FR-MCA購自日本W(wǎng)AKO公司；E-64 (L-3-carboxy-trans-2-3-epoxypropionyl-leucylamido-(4guanidino)-butane)和硫酸軟骨素A (CSA)購自美國Sigma公司；熒光標(biāo)記硫酸軟骨素A(CSA*)購自日本株式會(huì)社Cosmo Bio公司；人I型膠原蛋白(Human collagen I)購自美國Affymetrix公司，牛不溶性I型膠原蛋白(Bovine type I insoluble collagen)購自生工生物工程(上海)公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 二至丸樣品及提取物制備

墨旱蓮500 g，加入10倍量水(W/V)，煎煮2次，每次1 h，合并提取液，煎煮濃縮，冷凍干燥，粉碎得墨旱蓮水提取物。酒女貞子按照2020版藥典二至丸制備方法，粉碎過80目篩。將酒女貞子粉末500 g與墨旱蓮水提取物粉末混勻，用10倍量正丁醇(W/V)回流提取2次，每次1 h，過濾，合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后，冷凍干燥得正丁醇部位提取物。濾渣揮干，按照正丁醇方法依次分別用石油醚、二氯甲烷和乙酸乙酯溶液對(duì)濾渣進(jìn)行萃取，冷凍干燥得到二至丸的正丁醇、石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯提取物。

研究報(bào)道二至丸的活性成分，主要包括墨旱蓮三萜皂苷類和女貞子環(huán)烯醚萜苷類成分，及一些黃酮類、苯乙醇苷類等成分[10-12]。本研究30個(gè)成分中墨旱蓮皂苷 (Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅸ) 和刺囊酸是由墨旱蓮正丁醇部位經(jīng)凝膠柱層析分離得到[9]，墨旱蓮中蟛蜞菊內(nèi)酯、異去甲基蟛蜞菊內(nèi)酯、木樨草素、槲皮苷、木樨草苷和女貞子中異毛蕊花糖苷、橄欖苦苷、熊果酸、齊暾果酸、木樨草素、槲皮苷、木樨草苷、松果菊苷、特女貞苷、紅景天苷、女貞苷、女貞苷G13、3-O-乙?；R墩果酸、19α-羥基熊果酸、大黃素甲醚、β-谷甾醇、3, 4-二羥基苯乙醇、對(duì)羥基苯乙醇等成分為購買標(biāo)準(zhǔn)品。

2.2 不同部位和成分抑制CTSK的Z-FR-MCA活性

二至丸不同提取部位和化合物用DMSO溶解分別配置40 mg/ml和10 mmol/L的儲(chǔ)備溶液，并在分析之前用100 mmol/L醋酸鈉緩沖液(pH5.5，包含2.5 mmol/L DTT和2.5 mmol/L EDTA) 分別稀釋至濃度為25 μg/ml和 25 μmol/ml (DMSO低于1%)，加入黑色熒光96孔板，最終反應(yīng)容量為0.2 ml。加入終濃度為5 nmol/L的CTSK孵育5 min，加入Z-FR-MCA底物(終濃度1 mmol/L)，孵育30 s，實(shí)時(shí)檢測(cè)5 min熒光生成斜率(slope)值(發(fā)散光波長460 nm，吸收光波長355 nm)。所有測(cè)量均使用熒光儀Tecan spark（美國）在96孔板中進(jìn)行，單孔體積為200 μl。實(shí)驗(yàn)設(shè)陰性對(duì)照組(無抑制劑)，陽性對(duì)照組(E-64，活性位點(diǎn)抑制劑)。計(jì)算公式：抑制率(%)= 100-(1-Vi /V0)。Vi和V0分別表示存在和不存在抑制劑情況下的熒光信號(hào)。

2.3 不同部位和成分抑制CTSK/CSA*復(fù)合物形成活性

將100 μg/ml不同部位或25 μmol/ml有效成分與200 nmol/L的CTSK在含有2.5 mmol/L DTT和EDTA的100 mmol/L醋酸鈉緩沖液（pH 5.5）中，混勻放置5 min，然后添加20 nmol/L CSA*，混勻放置15 min，室溫下實(shí)時(shí)檢測(cè)5 min熒光生成斜率(slope)值(發(fā)散光波長485 nm，吸收光波長520 nm)，所有測(cè)量均使用熒光儀Tecan spark（美國）在黑色熒光96孔板中進(jìn)行，總體積為100 μl。設(shè)置不使用抑制劑（陰性對(duì)照）和300 mmol/L NaCl（陽性對(duì)照）。CTSK和FP之間的關(guān)系使用抑制百分比進(jìn)行分析，計(jì)算公式：抑制率(%)=100- [（100×（FPCTSK/抑制劑/CSA*-FPCSA*）/（FPCTSK/CSA*-FPCSA*）]其中，F(xiàn)PCTSK/抑制劑/CSA*和FPCTSK/CSA*分別是在存在和不存在抑制劑的情況下測(cè)定熒光信號(hào)。

2.4 膠原降解活性

人I型膠原0.6 mg/ml溶解于100 mmol/L醋酸鈉緩沖液(pH5.5，包含2.5 mmol/L DTT和2.5 mmol/L EDTA)中，依次加入CTSK (最終濃度400 nmol/L)、CSA (最終濃度200 nmol/L) 和400 μg/ml二至丸不同提取部位或不同濃度潛在抑制劑(100、80、60、40、20、10 μmol/L)，加入到含有I型膠原蛋白的緩沖液，單孔體積50 μl，混勻，28 ℃孵育4 h。取出 后 加入1μl的 100 μmol/L E64終止反應(yīng)。采用10%的SDS-PAGE凝膠電泳分離，考馬斯亮藍(lán)染色20 min，用乙酸-甲醇(4∶1)脫色。I型膠原的α1條帶的灰度用ImageJ 2軟件進(jìn)行定量分析。

2.5 潛在抑制劑與CTSK結(jié)合實(shí)驗(yàn)

稱取1 mg不溶性牛I型膠原蛋白置于1.5 ml EP管 中，加 入1 μmol/L CTSK酶 和25 μmol/L潛在抑制劑于40 μl緩沖液中(100 mmol/L醋酸鹽緩沖液，pH值5.5，含有2.5 mmol/L DTT和2.5 mmol/L EDTA)。采用Z-FR-MCA底物結(jié)合活性方法在T0 min測(cè)定CTSK活性，在37 ℃下孵育30 min后，檢測(cè)T30 min時(shí)的CTSK活性。從中取出40 μl上清液，添加2.0 μl NaCl（最終300 mmol/L），然后再次檢查CTSK活性，記錄為T30saltmin。計(jì)算公式：結(jié)合率(%)=[1-(T0 min-T30saltmin)/(T0 min-T30 min)]×100%。

2.6 分子對(duì)接libdock

用Discovery studio 2016軟件中的libdock分子對(duì)接方法考察活性成分和組織蛋白酶K(1ATK)蛋白進(jìn)行剛性對(duì)接。利用LibDock得分作為表征化合物與活性位點(diǎn)結(jié)合的核心指標(biāo)。LibDock得分分?jǐn)?shù)越高，小分子與受體結(jié)合的活性越高。

2.7 統(tǒng)計(jì)分析

每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。采用SPSS軟件經(jīng)ANOVA方差分析檢驗(yàn)，若有顯著性差異(α=0.05)，再采用Student'st檢驗(yàn)進(jìn)行兩組比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 DMSO濃度對(duì)CTSK活性篩選方法的影響

本研究考察了DMSO濃度(10%、5%、2%和1%)對(duì)CTSK的Z-FR-MCA活性和CTSK/CSA*復(fù)合物形成活性高通量篩查方法，及SDS-PAGE膠原降解活性篩選方法的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，10%、5%、2%的DMSO顯著抑制CTSK的Z-FR-MCA底物結(jié)合(圖1A)和CTSK/CSA*復(fù)合物形成活性(圖1B)。10%的DMSO顯著抑制CTSK的膠原降解，1%和2%的DMSO對(duì)膠原降解無明顯抑制作用。因此，本研究篩查二至丸的抑制CTSK活性方法將DMSO濃度控制在1%以下。

圖1 DMSO濃度對(duì)CTSK抑制劑篩查方法的影響

3.2 二至丸不同提取部位抑制CTSK活性作用

對(duì)二至丸的不同提取部位(正丁醇、石油醚、乙酸乙酯和二氯甲烷) 進(jìn)行了抑制CTSK活性篩選，其中Z-FR-MCA底物結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，二至丸的石油醚部位抑制作用明顯，為96.3%，正丁醇、乙酸乙酯、二氯甲烷提取部位抑制率分別為26.1%、50.8%和43.5%（見圖2A）。二至丸正丁醇、石油醚、乙酸乙酯和二氯甲烷提取部位提取物對(duì)CTSK/CSA*復(fù)合物形成的抑制率分別為99.6%、52.0%、94.8%和59.8%（見圖2B），膠原降解活性結(jié)果顯示二至丸的正丁醇部位抑制作用最明顯，達(dá)到100%，石油醚提取部位抑制作用為58%，二氯甲烷和乙酸乙酯提取部位作用也不明顯，分別為33.1%和6.7%（見圖2C和2D）。

圖2 二至丸的不同部位提取物抑制CTSK活性作用

3.3 二至丸活性成分對(duì)CTSK的活性作用

本研究對(duì)30種二至丸中的活性成分進(jìn)行了體外篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)25 μmol/L的墨旱蓮皂苷Ⅸ、異毛蕊花糖苷、蟛蜞菊內(nèi)酯、木樨草素、槲皮素、松果菊苷、女貞苷、特女貞苷、3,4-二羥基苯乙醇和對(duì)羥基苯乙醇抑制CTSK/CSA*復(fù)合物形成的抑制率超過50%，表兒茶素沒食子酸酯為51.2%。而在25 μmol/L時(shí)，僅有齊墩果酸、3-0-乙?；R墩果酸、19α-羥基熊果酸、3,4-二羥基苯乙醇、對(duì)羥基苯乙醇對(duì)CTSK與Z-FR-MCA結(jié)合活性有超過50%的抑制率，熊果酸為47.1%抑制率。采用libdock技術(shù)發(fā)現(xiàn)僅有3,4-二羥基苯乙醇和對(duì)羥基苯乙醇與CTSK活性位點(diǎn)對(duì)接有得分。因此，這些超過50%抑制率的二至丸活性成分被認(rèn)為具有潛在抑制膠原降解活性。 針對(duì)以上12種活性成分，進(jìn)行膠原降解抑制實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示在100 μmol/L時(shí)，墨旱蓮皂苷Ⅸ，對(duì)膠原降解抑制率達(dá)70.3%，女貞苷53.2%，蟛蜞菊內(nèi)酯達(dá)50.1%和表兒茶素沒食子酸酯為60.2%。異毛蕊花糖苷、木樨草素、槲皮素、松果菊苷、特女貞苷、熊果酸、齊墩果酸、3-O-乙?；R墩果酸、19α-羥基熊果酸、3,4-二羥基苯乙醇、對(duì)羥基苯乙醇均顯示無抑制膠原降解活性(表1)。

表1 二至丸中化學(xué)成分抑制組織蛋白酶K活性篩選

3.4 二至丸潛在抑制劑與CTSK的結(jié)合作用

不溶性膠原、抑制劑和CTSK共培養(yǎng)15 min，通過檢測(cè)培養(yǎng)液中剩余CTSK的Z-FR-MCA活性，來驗(yàn)證潛在CTSK抑制劑在體外抑制與CTSK的結(jié)合實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示100 μmol/L的墨旱蓮皂苷IX（ES-IX）、表兒茶素沒食子酸酯（EGCG）、女貞苷(NZG)和蟛蜞菊內(nèi)酯(WED)抑制率分別為54.8%、64.1%、36.4%和51.4% (圖3)。

圖3 4種潛在活性化合物抑制CTSK和膠原結(jié)合作用

4 討論

CTSK抑制劑的高通量篩選方法，多采用合成底物Z-FR-MCA結(jié)合活性來篩選，其原理是CTSK可裂解底物端FR-MCA基團(tuán), 釋放游離的MCA 發(fā)色熒光基團(tuán), 通過抑制劑引起熒光信號(hào)變化差異來檢測(cè)評(píng)價(jià)抑制劑活性?；诠悄z原降解需要CTSK與CSA結(jié)合發(fā)揮作用，采用熒光標(biāo)記CSA*，形成CTSK/CSA*復(fù)合物，其原理為抑制劑與CTSK酶結(jié)合形成CTSK/抑制劑/CSA*復(fù)合物，導(dǎo)致熒光偏振信號(hào)差異，評(píng)價(jià)抑制劑與CTSK結(jié)合活性，可快速、靈敏和準(zhǔn)確的判斷化合物是否與CTSK存在相互作用。SDS-PAGE凝膠電泳法是常用蛋白質(zhì)分類技術(shù)，將膠原蛋白及其降解產(chǎn)物按照分子量大小遷移，考馬斯染色溶液染色，對(duì)α1膠原蛋白條帶定量，計(jì)算膠原蛋白降解率。

二至丸的正丁醇提取部位抑制CTSK/CSA*復(fù)合物形成和膠原降解活性最強(qiáng)，超過95%，但對(duì)CTSK的Z-FR-MCA抑制率只有26%。Z-FR-MCA作為CTSK活性位點(diǎn)的合成底物，活性成分對(duì)ZFR-MCA抑制率越高，證明對(duì)CTSK的活性位點(diǎn)抑制效率越高?；贐romme教授提出的非活性位點(diǎn)抑制劑的概念[13]，活性成分具有顯著的抑制膠原降解活性，但對(duì)活性位點(diǎn)Z-FR-MCA底物無抑制活性，可稱為非活性位點(diǎn) (exosite) 抑制劑。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，二至丸的正丁醇提取部位可顯著抑制膠原降解，而對(duì)Z-FR-MCA無顯著影響，證明正丁醇提取部位可能存在抑制 CTSK膠原降解活性的活性成分, 而不影響CTSK 活性位點(diǎn)的生理活性。二至丸的正丁醇提取部位的化學(xué)成分主要為墨旱蓮皂苷類成分和女貞子三萜酸類成分，其中墨旱蓮皂苷Ⅸ（ES-Ⅸ）、表兒茶素沒食子酸酯（EGCG）、女貞苷(NZS)和蟛蜞菊內(nèi)酯(WED)可能是潛在的CTSK非活性位點(diǎn)抑制劑。熊果酸和齊墩果酸具有較強(qiáng)的Z-FR-MCA活性，表明可作用CTSK活性位點(diǎn)，而女貞子乙醇提取物、熊果酸、齊墩果酸和墨旱蓮的蟛蜞菊內(nèi)脂均報(bào)道顯著抑制破骨細(xì)胞的骨吸收活性和CTSK的mRNA表達(dá)[14-15]，可能通過在細(xì)胞內(nèi)直接作用CTSK酶，使其失去活性。

CTSK是抗骨質(zhì)疏松藥物研發(fā)的關(guān)鍵靶標(biāo)，有報(bào)道，中草藥尤其是補(bǔ)腎中藥含有豐富的治療骨質(zhì)疏松的活性物質(zhì)，但不清楚這些化合物是否能夠抑制CTSK活性，或者特異性抑制膠原酶的活性。除了膠原降解活性，CTSK在甲狀腺細(xì)胞中發(fā)揮降解甲狀腺球蛋白，釋放甲狀腺激素[16]，在成纖維細(xì)胞中發(fā)揮降解纖維蛋白的功能[17]。二至丸中有抑制CTSK活性的化合物，可進(jìn)一步考察其對(duì)甲狀腺球蛋白降解和纖維蛋白降解的作用活性，為中醫(yī)藥開發(fā)CTSK抑制劑提供新的思路。