朱丹娜 孟 泳 （河南中醫(yī)藥大學(xué)肺病科，鄭州 450046）

肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞（alveolar type Ⅱ epithelial cells，AT-Ⅱ）是肺泡壁的重要組成部分，具有維持肺表面活性物質(zhì)動(dòng)態(tài)平衡和肺免疫功能，其過(guò)度凋亡可導(dǎo)致肺泡上皮屏障破壞，肺上皮細(xì)胞異常損傷與急性肺損傷、肺結(jié)核、慢性阻塞性肺疾病等肺部疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［1-2］。因此，研究肺泡上皮細(xì)胞損傷的分子機(jī)制對(duì)肺部相關(guān)疾病的治療具有重要意義。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是革蘭氏陰性桿菌細(xì)胞壁的重要成分，可誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞損傷［3］。研究表明中藥在防治肺部疾病上具有重要作用［4］。薄荷腦是從薄荷的葉和莖中提取的一種飽和環(huán)狀醇，又名薄荷醇、薄荷冰；研究報(bào)道霧化吸入薄荷醇可減輕哮喘小鼠氣道炎癥，降低氣道高反應(yīng)性［5］。薄荷醇通過(guò)MAPK、NF-κB 和AKT 信號(hào)通路抑制神經(jīng)炎癥反應(yīng)，可保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元免受LPS 誘發(fā)的帕金森病模型中炎癥介導(dǎo)的損傷［6］。然而薄荷腦對(duì)LPS 誘導(dǎo)的AT-Ⅱ細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)的影響及機(jī)制尚不清楚。研究報(bào)道LPS 處理的A549 細(xì)胞中miR-1247-3p 相對(duì)表達(dá)量升高［7］。抑制miR-1247-3p 表達(dá)通過(guò)靶向SFTPC 基因抑制LPS 誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞損傷［8］。磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信號(hào)通路與肺損傷發(fā)生有關(guān)，如氫可通過(guò)激活PI3K/Akt/Foxo3a 信號(hào)通路防止高氧誘導(dǎo)的AT-Ⅱ細(xì)胞凋亡［9］。右美托咪定通過(guò)激活PI3K/Akt 通路可改善LPS 誘導(dǎo)的大鼠急性肺損傷［10］。川芎嗪可通過(guò)抑制PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路活化減輕內(nèi)毒素誘導(dǎo)的急性肺損傷大鼠炎癥反應(yīng)［11］。而 薄 荷 腦 是 否 通 過(guò) 調(diào) 控miR-1247-3p 及PI3K/Akt通路影響LPS 誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞損傷尚未可知。因此，本實(shí)驗(yàn)旨在研究薄荷腦對(duì)LPS 誘導(dǎo)的AT-Ⅱ細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)的影響及機(jī)制是否與miR-1247-3p及PI3K/Akt通路有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 材料 AT-Ⅱ細(xì)胞購(gòu)自上海雅吉生物科技有限公司；DMEM 培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone 公司；LPS購(gòu)自北京伊塔生物科技有限公司；薄荷腦購(gòu)自滁州仕諾達(dá)生物科技有限公司；CCK-8 試劑盒購(gòu)自北京利維平生物科技有限公司；凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海信帆生物科技有限公司；蛋白提取試劑盒購(gòu)自南京恩晶生物科技有限公司；ELISA 試劑盒購(gòu)自深圳子科生物科技有限公司；熒光定量試劑盒購(gòu)自上?？泼羯锟萍加邢薰?。

1.2 方法

1.2.1 LPS 誘導(dǎo)AT-Ⅱ細(xì)胞損傷模型的建立 將AT-Ⅱ細(xì)胞分別用5、10、15 mg/L的LPS處理，以未經(jīng)LPS 處理的細(xì)胞作為對(duì)照（NC）組，發(fā)現(xiàn)不同濃度LPS均可減弱AT-Ⅱ細(xì)胞活性，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用濃度為15 mg/L。

1.2.2 細(xì)胞分組 分別采用1、5、10 μmol/L的薄荷腦和15 mg/L LPS 處理AT-Ⅱ細(xì)胞，分別設(shè)為1、5、 10 μmol/L 薄荷腦+15 mg/L LPS 組；將anti-miR-NC、anti-miR-1247-3p 轉(zhuǎn)染至AT-Ⅱ細(xì)胞后用15 mg/L LPS 處理，設(shè)為anti-miR-NC+15 mg/L LPS 組、antimiR-1247-3p+15 mg/L LPS 組；將miR-NC、miR-1247-3p 轉(zhuǎn)染至AT-Ⅱ細(xì)胞后用0 μmol/L 的薄荷腦和 15 mg/L 的LPS 處理，設(shè)為miR-NC+10 μmol/L 薄荷腦+15 mg/L LPS 組、miR-1247-3p+10 μmol/L 薄荷腦+ 15 mg/L LPS組。

1.2.3 CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞活性 將AT-Ⅱ細(xì)胞以2×103個(gè)/孔接種于96 孔板培養(yǎng)12 h，分別加入0、5、10、15 mg/L的LPS，培養(yǎng)24 h后每孔加入10 μl CCK-8試劑孵育2 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm 波長(zhǎng)處的吸光度值（A）。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 NC 組、15 mg/L LPS 組、1、5、10 μmol/L 薄荷腦+15 mg/L LPS 組、antimiR-NC+15 mg/L LPS 組、anti-miR-1247-3p+15 mg/L LPS 組、miR-NC+10 μmol/L 薄荷腦+15 mg/L LPS 組、miR-1247-3p+10 μmol/L 薄荷 腦+15 mg/L LPS 組 細(xì)胞培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS 漂洗2 次，加入300 μl 結(jié)合緩沖，然后加入Annexin V-FITC 和PI孵育10 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.2.5 ELISA 檢測(cè)TNF-α、IL-6、IL-1β 水平 取各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h 后上清液，ELISA 法檢測(cè)TNF-α、 IL-6、IL-1β 水平，具體操作按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行，先測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后測(cè)量樣品吸光度值，根據(jù)所得吸光度值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀取樣品濃度。

1.2.6 Western blot 檢測(cè)蛋白表達(dá) 提取各組細(xì)胞總蛋白，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，然后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF 膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入一抗（1∶800） 4 ℃孵育過(guò)夜，洗膜后加入二抗 （1∶2 000）室溫孵育2 h，曝光顯影后用Quantity One分析蛋白條帶灰度值，以β-actin 為內(nèi)參計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.7 RT-qPCR 檢測(cè)miR-1247-3p 表達(dá)水平 提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA 后以U6為內(nèi)參進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增條件：95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40 個(gè)循環(huán)；60 ℃延長(zhǎng)5 min。相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt法計(jì)算。miR-1247-3p 正 向序列：5'-CCCCGGGAACGTCGAGACTGGAGC-3'，反向序列：5'-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3'；U6 正向序列：5'-TGGAACGCTTCACGAATTTGCG-3'，反向序列：5'-GGAACGATACAGAGAAGATTAGC-3'。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，兩組比較行t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度LPS 對(duì)AT-Ⅱ細(xì)胞活性的影響 與NC組相比，不同濃度LPS處理后AT-Ⅱ細(xì)胞活性降低（P＜0.05，圖1）。后續(xù)研究濃度選用15 mg/L的LPS。

圖1 不同濃度LPS對(duì)AT-Ⅱ細(xì)胞活性的影響Fig.1 Effect of different concentrations of LPS on AT-Ⅱ cell activity

2.2 不同濃度薄荷腦對(duì)LPS 誘導(dǎo)的AT-Ⅱ細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)的影響 與NC 組相比，LPS 組Cleaved-caspase-3 表達(dá)水平及細(xì)胞凋亡率升高，TNF-α、IL-6、IL-1β 水平升高（P＜0.05）；與LPS 組相比，不同濃度薄荷腦組Cleaved-caspase-3 表達(dá)水平及細(xì)胞凋亡率降低，TNF-α、IL-6、IL-1β 水平降低 （P＜0.05，圖2）。

圖2 不同濃度薄荷腦對(duì)LPS誘導(dǎo)的AT-Ⅱ細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)的影響Fig.2 Effect of different concentrations of menthol on apoptosis and inflammation of AT-Ⅱ cells induced by LPS

2.3 不同濃度薄荷腦對(duì)LPS 誘導(dǎo)的AT-Ⅱ細(xì)胞中miR-1247-3p表達(dá)水平的影響 與NC組相比，15 mg/L LPS 組miR-1247-3p 表達(dá)水平升高（P＜0.05）；與 15 mg/L LPS組相比，不同濃度薄荷腦組miR-1247-3p表達(dá)水平降低（P＜0.05，圖3）。

圖3 不同濃度薄荷腦對(duì)LPS 誘導(dǎo)的AT-Ⅱ細(xì)胞中miR-1247-3p表達(dá)的影響Fig.3 Effects of different concentrations of menthol on expression of miR-1247-3p in AT-Ⅱ cells induced by LPS

2.4 miR-1247-3p 低表達(dá)對(duì)LPS 誘導(dǎo)的AT-Ⅱ細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)的影響 與anti-miR-NC+15 mg/L LPS 組相比，anti-miR-1247-3p+15 mg/L LPS 組miR-1247-3p 表達(dá)水平降低，Cleaved-caspase-3 表達(dá)水平及細(xì)胞凋亡率降低，TNF-α、IL-6、IL-1β 水平降低 （P＜0.05，圖4）。

圖4 miR-1247-3p 低表達(dá)對(duì)LPS 誘導(dǎo)的AT-Ⅱ細(xì)胞凋亡 和炎癥反應(yīng)的影響Fig.4 Effect of low expression of miR-1247-3p on LPS-induced apoptosis and inflammation of AT-Ⅱ cells

2.5 miR-1247-3p 可逆轉(zhuǎn)薄荷腦對(duì)LPS 誘導(dǎo)的 AT-Ⅱ細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)的影響 與miR-NC+ 10 μmol/L 薄荷腦+15 mg/L LPS 組相比，miR-1247-3p+10 μmol/L 薄荷腦+15 mg/L LPS 組miR-1247-3p表達(dá)水平升高，Cleaved-caspase-3 表達(dá)水平及細(xì)胞凋亡率升高，TNF-α、IL-6、IL-1β 水平升高（P＜0.05，圖5）。

圖5 miR-1247-3p 可逆轉(zhuǎn)薄荷腦對(duì)LPS 誘導(dǎo)的AT-Ⅱ細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)的影響Fig.5 miR-1247-3p can reverse effect of menthol on LPSinduced apoptosis and inflammation of AT-Ⅱ cells

2.6 PI3K/Akt信號(hào)通路蛋白表達(dá)情況 與NC組相比，15 mg/L LPS 組p-PI3K、p-Akt 蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05），PI3K 和Akt 蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與15 mg/L LPS 組 相 比，10 μmol/L menthol+ 15 mg/L LPS 組p-PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05），PI3K 和Akt 蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與miR-NC+10 μmol/L menthol+15 mg/L LPS 組 相 比，miR-1247-3p+10 μmol/L menthol+15 mg/L LPS 組 p-PI3K、p-Akt 蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05），PI3K 和Akt蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖6）。

圖6 Western blot檢測(cè)p-PI3K、p-Akt、PI3K、Akt蛋白表達(dá)Fig.6 Western blot detection of p-PI3K， p-Akt， PI3K， Akt protein expressions

3 討論

研究表明中藥有效成分可減輕肺泡上皮細(xì)胞損傷，防治急性肺損傷效果顯著，篩選療效顯著的中藥以指導(dǎo)臨床治療相關(guān)肺部疾病具有重要意義［12-13］。肺損傷與炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)有關(guān)，AT-Ⅱ在創(chuàng)傷或應(yīng)激條件下經(jīng)巨噬細(xì)胞刺激可產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子IL-6、IL-1β 及TNF-α 等［14］。因此，抑制AT-Ⅱ細(xì)胞凋亡和炎癥因子的產(chǎn)生可防治肺損傷。研究報(bào)道法舒地爾和薄荷腦聯(lián)合治療可顯著抑制炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡，改善模型大鼠脊髓損傷［15］。薄荷腦通過(guò)激活TRPM8 來(lái)預(yù)防心肌梗死后的炎癥和心臟重塑［16］。薄荷醇還可降低乙酸誘導(dǎo)的大鼠結(jié)腸黏膜結(jié)腸炎中促炎細(xì)胞因子（IL-1、IL-23 和TNF-α）分泌［17］。本實(shí)驗(yàn)用不同濃度LPS 處理后AT-Ⅱ細(xì)胞活性降低，Cleaved-caspase-3 蛋白表達(dá)水平及細(xì)胞凋亡率升高，TNF-α、IL-6、IL-1β 水平升高，表明LPS 誘導(dǎo)了AT-Ⅱ細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)。因此采用LPS 誘導(dǎo)AT-Ⅱ細(xì)胞建立損傷模型。不同濃度薄荷腦處理后，Cleaved-caspase-3 表達(dá)水平及細(xì)胞凋亡率降低，TNF-α、IL-6、IL-1β 水平降低，表明薄荷腦可抑制LPS誘導(dǎo)的AT-Ⅱ細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)，抑制LPS誘導(dǎo)的AT-Ⅱ細(xì)胞損傷。

研究報(bào)道m(xù)iR-1247-3p過(guò)表達(dá)可減輕缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的H9c2 細(xì)胞損傷［18］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-1247-3p 低表達(dá)后，Cleaved-caspase-3 表達(dá)水平及細(xì)胞凋亡率降低，TNF-α、IL-6、IL-1β 水平降低，說(shuō)明miR-1247-3p 低表達(dá)可抑制LPS 誘導(dǎo)的AT-Ⅱ細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)，與文獻(xiàn)［8］研究結(jié)果相符。研究報(bào)道1，6-O，O-二乙酰大花旋覆花內(nèi)酯通過(guò)調(diào)節(jié)miR-1247-3p/LXRα/ABCA1 信號(hào)傳導(dǎo)抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌進(jìn)展，說(shuō)明藥物可調(diào)控miR-1247-3p 表達(dá)［19］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，薄荷腦可降低LPS 誘導(dǎo)的AT-Ⅱ細(xì)胞中miR-1247-3p 表達(dá)水平；而miR-1247-3p 高表達(dá)逆轉(zhuǎn)了薄荷腦對(duì)LPS 誘導(dǎo)的AT-Ⅱ細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)，表明薄荷腦可調(diào)控miR-1247-3p表達(dá)。

研究報(bào)道FGF-2通過(guò)激活PI3K/Akt信號(hào)通路減輕肺泡上皮細(xì)胞的炎癥、氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡［20］。桑黃素可通過(guò)抑制PI3K/Akt/NF-κB 信號(hào)通路減輕LPS 誘導(dǎo)的大鼠急性肺損傷［21］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，薄荷腦處理后的AT-Ⅱ細(xì)胞中p-PI3K、p-Akt 蛋白表達(dá)水平升高，說(shuō)明薄荷腦可激活PI3K/Akt 信號(hào)通路。此外，miR-1247-3p 高表達(dá)逆轉(zhuǎn)了薄荷腦對(duì) p-PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)的影響。

綜上所述，薄荷腦通過(guò)miR-1247-3p/PI3K/Akt通路抑制LPS誘導(dǎo)的AT-Ⅱ細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)。