劉曉霞 陳劍華 郭旭麗 李衛(wèi)霞 王雪玲 熊南燕 （河北工程大學(xué)醫(yī)學(xué)院，邯鄲 056038）

抗生素在感染性疾病治療方面歷史悠久、貢獻(xiàn)突出，但隨之出現(xiàn)了細(xì)菌耐藥現(xiàn)象，導(dǎo)致療效降低。為提高抗生素療效，臨床常將具有清熱、解毒等作用的中藥制劑，如喜炎平注射液、疏風(fēng)解毒膠囊等，與抗生素聯(lián)用治療感染性疾病，臨床認(rèn)為中藥制劑與抗生素聯(lián)用具有協(xié)同作用［1-2］。為明確其聯(lián)用的作用機(jī)制，本研究將痰熱清與頭孢曲松鈉聯(lián)用于金黃色葡萄球菌感染小鼠，研究感染小鼠腹腔巨噬細(xì)胞極化情況，探討其是否可通過(guò)影響巨噬細(xì)胞極化發(fā)揮作用，為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 昆明小鼠購(gòu)自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；PE-抗小鼠CD80 抗體、 FITC-抗小鼠CD206 抗體購(gòu)自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；SYBR Premix Ex Taq Ⅱ、PrimeScript RT reagent Kit Perfect Real Time 購(gòu)自日本TaKaRa 公司；引物由 Invitrogen 公司 合成；兔抗 鼠iNOS、TNF-α、IL-6、 IL-1β、Arg-1、Fizz-1、TGF-β、STAT1、p-STAT1、IRF5

抗體、HRP-羊抗兔IgG 抗體購(gòu)自ThermoFisher 公司；兔抗鼠Ym-1 抗體購(gòu)自STEMCELL Technologies；26001-25金黃色葡萄球菌菌株購(gòu)自北京市藥品生物制品檢定所。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物造模 6～8周齡昆明小鼠60只，雌雄各半，體溫相近（相差≤0.2 ℃），腹腔注射金黃色葡萄球菌0.2 ml （9×108個(gè)/ml），1 h 后電子體溫計(jì)經(jīng)直腸測(cè)體溫，選擇體溫≥37.2 ℃小鼠40只，按體溫高低均分為4 組：模型組、頭孢曲松鈉組、痰熱清組和痰熱清+頭孢曲松鈉組，每組10 只，對(duì)照組為10 只正常未處理小鼠。對(duì)照組和模型組腹腔給予生理鹽水（70 mg/kg），其他三組分別腹腔給予頭孢曲松鈉 （70 mg/kg）、痰熱清（13 mg/kg）和頭孢曲松鈉+痰熱清（70 mg/kg+13 mg/kg），2 次/d，連續(xù)7 d。第7 天給藥后2 h采集小鼠腹腔巨噬細(xì)胞。

1.2.2 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞分離 小鼠摘眼球和頸動(dòng)脈放血至血流盡，75%乙醇浸泡5 min（頭部不浸入），沿腹中線剪開(kāi)皮膚，充分暴露腹膜，5 ml預(yù)冷無(wú)菌PBS沖洗，收集液體至離心管，沖洗3次，1 000 r/min離心5 min，棄上清，PBS 重懸，洗滌3 次，收集細(xì)胞，RPMI1640 完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種于無(wú)菌培養(yǎng)皿，培養(yǎng)2 h，棄上清，無(wú)菌PBS 洗滌3 次，去除未貼壁細(xì)胞，得到貼壁細(xì)胞即小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106個(gè)/ml。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)巨噬細(xì)胞M1、M2 極化情況 取1.2.2 中的細(xì)胞懸液100 μl，1 000 r/min 離心5 min，棄上清，含0.1%BSA的PBS洗滌2次，加入含0.1%BSA 的PBS 重懸細(xì)胞，加入2 μl PE-抗小鼠CD80 抗體、2 μl FITC-抗小鼠CD206 抗體 混 勻， 4 ℃孵 育 30 min，加 入1 ml 含0.1%BSA 的PBS， 1 000 r/min 離 心5 min，棄 上 清，加 入0.5 ml 含0.1%BSA的PBS重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.4 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞總RNA 提取及RT-qPCR檢測(cè) TRIzol 法提取細(xì)胞總RNA，取1.2.2 中細(xì)胞懸液，PBS洗滌2次，加入500 μl TRIzol渦旋振蕩，使細(xì)胞完全裂解，靜置5 min。加入200 μl 三氯甲烷 渦旋振蕩15 s，靜置2 min，4 ℃、12 000 r/min 離心 15 min，取上清加至新EP 管，加入等量異丙醇混勻，室溫靜置10 min，4 ℃、12 000 r/min 離心10 min， 棄上清，加入1 ml 75%乙醇室溫靜置2 min，4 ℃、 7 500 r/min 離心5 min，棄上清，重復(fù)洗滌2 次。將EP 管室溫晾干，加入適量焦碳酸二乙酯（DEPC）水溶解沉淀，檢測(cè)RNA 濃度和純度，以總RNA 為模板轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行RT-qPCR 反應(yīng)，反應(yīng)體系：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 12.5 μl、ddH2O 8.5 μl、cDNA 2 μl、 正反向引物各1 μl，引物序列見(jiàn)表1。反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s，1個(gè)循環(huán)預(yù)變性；95 ℃ 5 s變性；60 ℃ 30 s退火延伸，40個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15 s；60 ℃ 60 s；95 ℃ 15 s， 1 個(gè)循環(huán)。2-ΔΔCt法計(jì)算并分析iNOS、TNF-α、IL-6、IL-1β、Arg-1、Fizz-1、Ym-1、TGF-β mRNA相對(duì)表達(dá)。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.5 Western blot 檢測(cè)巨噬細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá) 取上述細(xì)胞懸液，PBS 洗滌2 次，RIPA 裂解，提取總蛋白，BCA 法定量。取各組蛋白20 μl 進(jìn)行SDDPAGE 電泳，電轉(zhuǎn)至PVDF 膜，含5%脫脂奶粉的TBST溶液封閉1 h，加入一抗4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜4 次，10 min/次，加入HRP-二抗室溫孵育2 h，TBST 洗膜。超敏ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影曝光，Image J軟件分析蛋白灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用GraphPad Prism 8 軟件處理數(shù)據(jù)，結(jié)果以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Tukey 法，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞極化情況 模型組、頭孢曲松鈉組、痰熱清組、痰熱清+頭孢曲松鈉組M1 型（CD86陽(yáng)性）巨噬細(xì)胞比例明顯高于對(duì)照組，痰熱清組與痰熱清+頭孢曲松鈉組均明顯高于模型組和頭孢曲松鈉組（F=24.030，P＜0.05）；而模型組與頭孢曲松鈉組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），痰熱清組與痰熱清+頭孢曲松鈉組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。各組M2型（CD206陽(yáng)性）巨噬細(xì)胞比例差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1.608，P＞0.05，圖1）。

圖1 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞極化情況Fig.1 Polarization of peritoneal macrophage in mice

2.2 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞iNOS、TNF-α、IL-6、IL-1β、Arg-1、Fizz-1、Ym-1、TGF-β mRNA 表達(dá) 頭孢曲松鈉組、痰熱清組以及痰熱清+頭孢曲松鈉組M1 型巨噬細(xì)胞極化標(biāo)志物iNOS、TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA表達(dá)明顯高于對(duì)照組，痰熱清組和痰熱清+頭孢曲松鈉組明顯高于模型組和頭孢曲松鈉組（P＜0.01），而模型組與頭孢曲松鈉組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），痰熱清組與痰熱清+頭孢曲松鈉組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。各組M2 型巨噬細(xì)胞極化標(biāo)志物Arg-1、Fizz-1、Ym-1、TGF-β mRNA 表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表2）。

表2 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞iNOS、TNF-α、IL-6、IL-1β、Arg-1、Fizz-1、Ym-1、TGF-β mRNA表達(dá)（±s，n=10）Tab.2 mRNA level of iNOS， TNF-α， IL-6， IL-1β， Arg-1， Fizz-1， Ym-1 and TGF-β of peritoneal macrophage in mice （±s，n=10）

表2 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞iNOS、TNF-α、IL-6、IL-1β、Arg-1、Fizz-1、Ym-1、TGF-β mRNA表達(dá)（±s，n=10）Tab.2 mRNA level of iNOS， TNF-α， IL-6， IL-1β， Arg-1， Fizz-1， Ym-1 and TGF-β of peritoneal macrophage in mice （±s，n=10）

Note：Compared with control group， 1）P＜0.05； compared with model group， 2）P＜0.05； compared with ceftriaxone sodium group， 3）P＜0.05.

2.3 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞iNOS、TNF-α、IL-6、IL-1β、Arg-1、Fizz-1、Ym-1、TGF-β 蛋白表達(dá) 模型組、頭孢曲松鈉組、痰熱清組以及痰熱清+頭孢曲松鈉組M1型巨噬細(xì)胞極化標(biāo)志物iNOS、TNF-α、IL-6、IL-1β 蛋白表達(dá)明顯高于對(duì)照組，痰熱清組和痰熱清+頭孢曲松鈉組明顯高于模型組和頭孢曲松鈉組（P＜0.05），而模型組與頭孢曲松鈉組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），痰熱清組與痰熱清+頭孢曲松鈉組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。各組M2 型巨噬細(xì)胞極化標(biāo)志物Arg-1、Fizz-1、Ym-1、TGF-β 蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖2），與mRNA結(jié)果一致。

圖2 小鼠巨噬細(xì)胞iNOS、TNF-α、IL-6、IL-1β、Arg-1、Fizz-1、Ym-1、TGF-β蛋白表達(dá)Fig.2 Protein expressions of iNOS，TNF-α，IL-6，IL-1β， Arg-1， Fizz-1， Ym-1， TGF-β of peritoneal macrophage in mice

2.4 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞IRF/STAT信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá) Western blot 結(jié)果顯示，模型組、頭孢曲松鈉組、痰熱清組及痰熱清+頭孢曲松鈉組p-STAT1和IRF5 蛋白表達(dá)明顯高于對(duì)照組，痰熱清組和痰熱清+頭孢曲松鈉組明顯高于模型組和頭孢曲松鈉組（P＜0.05），而模型組與頭孢曲松鈉組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），痰熱清組與痰熱清+頭孢曲松鈉組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。各組STAT1 蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖3）。

圖3 小鼠巨噬細(xì)胞IRF/STAT信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)Fig.3 Protein expressions of IRF/STAT signaling pathway of peritoneal macrophage in mice

3 討論

痰熱清注射液由連翹、山茱萸、黃芩、金銀花、藜蘆5 種成分組成，含有咖啡酸、鵝去氧膽酸、黃芩苷、綠原酸、熊去氧膽酸5種活性物質(zhì)，具有清熱、解毒、化痰等作用，用于肺炎早期、急性支氣管炎、慢性支氣管炎急性發(fā)作及上呼吸道感染治療［3］。臨床將其與抗生素聯(lián)用治療呼吸道疾病，可提高療效、降低不良反應(yīng)發(fā)生率、縮短住院和抗生素使用時(shí)間，但未進(jìn)行機(jī)制研究［4］。宋福江［5］對(duì)痰熱清成分及抗菌作用機(jī)制進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，痰熱清可通過(guò)抑制細(xì)菌細(xì)胞壁和脂肪酸合成發(fā)揮體外抗菌作用；李文等［6］發(fā)現(xiàn)痰熱清與常規(guī)西藥治療風(fēng)熱型氣管-支氣管炎后，中醫(yī)癥候群改善優(yōu)于單用西藥治療，可能與聯(lián)用下調(diào)IL-4、IL-8、IL-10 水平有關(guān)；李芷悅［7］研究發(fā)現(xiàn)痰熱清與左氧氟沙星聯(lián)用于銅綠假單胞菌感染大鼠，可通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激提高療效。但未發(fā)現(xiàn)二者聯(lián)用對(duì)巨噬細(xì)胞影響的研究。

巨噬細(xì)胞屬于機(jī)體固有免疫細(xì)胞，在抗感染免疫中發(fā)揮重要作用，受到刺激可發(fā)生極化，分化為經(jīng)典活化巨噬細(xì)胞（M1 型）和旁路活化巨噬細(xì)胞（M2型），二者表型、分泌細(xì)胞因子、功能均不同，M1型巨噬細(xì)胞能有效清除病原體，并引起炎癥損傷和組織損傷，M2 型巨噬細(xì)胞具有抗炎作用，對(duì)炎癥刺激不敏感，促進(jìn)組織修復(fù)［8-9］。本研究發(fā)現(xiàn)單用痰熱清、痰熱清+頭孢曲松鈉聯(lián)用均可促進(jìn)巨噬細(xì)胞M1型分化，且M1 型標(biāo)志物iNOS、TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA 及蛋白表達(dá)顯著增加。iNOS 可促進(jìn)NO 生成，促進(jìn)氧化應(yīng)激，本研究iNOS 表達(dá)增加與李芷悅［7］發(fā)現(xiàn)的痰熱清與左氧氟沙星聯(lián)用可抑制氧化應(yīng)激不符，可能是其針對(duì)氧化應(yīng)激進(jìn)行的是SOD 和MDA 研究，并未檢測(cè)NO，且其研究的是整個(gè)肺組織氧化應(yīng)激情況，而本研究?jī)H針對(duì)巨噬細(xì)胞進(jìn)行研究；本研究顯示TNF-α、IL-6 表達(dá)增加，與李文等［6］、李芷悅［7］研究的痰熱清與抗生素聯(lián)用下調(diào)炎癥因子表達(dá)不符，原因可能在于二人分別針對(duì)血漿和整個(gè)肺組織進(jìn)行研究。

巨噬細(xì)胞極化受多種信號(hào)分子和轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控，IRF/STAT 信號(hào)通路即為其中之一，STAT1 是 一種連接膜受體與效應(yīng)器信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要分子，其磷酸化后形成二聚體進(jìn)入細(xì)胞核，啟動(dòng)靶基因轉(zhuǎn)錄，既往研究發(fā)現(xiàn)其可促進(jìn)M1 型巨噬細(xì)胞極化［10-11］；極化后的M1 型巨噬細(xì)胞IRF5 分子表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而誘導(dǎo)M1 相關(guān)細(xì)胞因子分泌［11-12］。本研究也顯示，單用痰熱清、痰熱清+頭孢曲松鈉聯(lián)用STAT1磷酸化水平、IRF5 分子表達(dá)明顯高于其他三組，提示其可能通過(guò)調(diào)節(jié)IRF/STAT信號(hào)通路促進(jìn)M1型巨噬細(xì)胞極化。

綜上，痰熱清與頭孢曲松鈉聯(lián)用于金黃色葡萄球菌感染小鼠，可通過(guò)促進(jìn)M1 型巨噬細(xì)胞分化促進(jìn)iNOS、TNF-α、IL-6、IL-1β 表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)NO 產(chǎn)生和炎癥反應(yīng)，增強(qiáng)機(jī)體抗感染能力，可能通過(guò)調(diào)節(jié)IRF/STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑實(shí)現(xiàn)。