孟 盼 羅薇絮 藺曉源 劉 檢 趙洪慶 凌 佳 駱 妍 王宇紅

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)科技創(chuàng)新中心，長沙 410208）

乳腺癌是全球女性最常見的惡性腫瘤，在我國 女性惡性腫瘤中居首位［1］。乳腺癌的治愈率雖有提高，但從發(fā)病到診斷再到治療期間患者極易出現(xiàn)抑郁癥。研究顯示，乳腺癌并發(fā)抑郁癥（breast cancer with depression，BCRD）的患病率占乳腺癌患者的12%～25%，且病死率提高10%～15%［2-3］。細(xì)胞因子是一種調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的信號(hào)分子，同時(shí)可作為一種神經(jīng)調(diào)質(zhì)調(diào)節(jié)神經(jīng)生化、神經(jīng)內(nèi)分泌及行為改變。乳腺腫瘤生長及侵襲能力由弱到強(qiáng)伴隨機(jī)體免疫功能紊亂，但抗腫瘤免疫應(yīng)答主要依賴于微環(huán)境中的抑制性細(xì)胞因子［4-5］。抑郁癥的炎癥應(yīng)答假說認(rèn)為激活的外周免疫系統(tǒng)通過釋放促炎細(xì)胞因子導(dǎo)致抑郁癥發(fā)生［6］。因此，體內(nèi)促炎、抗炎細(xì)胞因子的含量可直接影響B(tài)CRD 的發(fā)生發(fā)展。基于此，本研究采用高通量、高精度的懸液芯片技術(shù)分析BCRD模型小鼠不同組織中白介素類細(xì)胞因子的變化，為BCRD的治療及預(yù)后評(píng)估提供新的策略。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí) 驗(yàn) 動(dòng) 物 SPF 級(jí)BALB/c 雌 性 小 鼠， 4～6 周齡，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（湘）2013-0004，合格證號(hào)：43004700024756。在光暗周期為12 h/12 h 環(huán)境中適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d，自由獲取飼料與水。

1.1.2 主要試劑與儀器 4T1 炎癥乳腺癌細(xì)胞株（上?？茖W(xué)院細(xì)胞庫）；皮質(zhì)酮、BSA（北京索萊寶）；雙抗、胰酶、胎牛血清（HyClone）；PBS 緩沖液（中杉金橋）；DMSO（上海藍(lán)潤化學(xué)有限公司）。懸液芯片系統(tǒng)、洗板機(jī)、細(xì)胞因子7 項(xiàng)試劑盒（美國Bio-Rad）；多功能酶標(biāo)儀（美國Thermo Fisher）。

1.2 方法

1.2.1 4T1 炎癥乳腺癌細(xì)胞的培養(yǎng) 顯微鏡下觀察4T1 炎癥乳腺癌細(xì)胞株生長狀態(tài)，0.22 μm 過濾器過濾，加入RPMI 培養(yǎng)液（內(nèi)含10%胎牛血清，1%雙抗）10 ml，轉(zhuǎn)移至25 cm2培養(yǎng)瓶，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)，對(duì)數(shù)期細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化傳代。采用胰酶消化細(xì)胞，用PBS將細(xì)胞吹打成單個(gè)懸浮狀態(tài)，并將其濃度調(diào)整為1×107個(gè)/ml。

1.2.2 BCRD 動(dòng)物模型制備［7］以BALB/c 小鼠為研究對(duì)象，腋下接種1×106個(gè)4T1 炎癥乳腺癌細(xì)胞，并于接種7 d 后觀察其成瘤情況。成瘤后，背部皮下注射皮質(zhì)酮混懸液（每300 mg 皮質(zhì)酮用5 ml DMSO 預(yù)溶解，將皮質(zhì)酮在DMSO 中充分溶解后，加入95 ml生理鹽水），小鼠等效劑量為30 mg/kg，給藥體積為20 ml/kg，連續(xù)注射21 d，制備BCRD模型。

1.2.3 動(dòng)物分組 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d 后，將小鼠按糖水消耗量隨機(jī)分為4組，即空白組、乳腺癌模型組、抑郁模型組、BCRD組，每組10只。

1.2.4 指標(biāo)檢測(cè)

1.2.4.1 糖水偏好 將小鼠飼養(yǎng)于單籠，2 瓶飲用水供其選擇性飲用，適應(yīng)1 d后，再換成2瓶1%的蔗糖溶液，同樣再選擇性適應(yīng)1 d。1 瓶糖水、1 瓶蒸餾水選擇性飲水共進(jìn)行1 d，期間交換2 瓶水的位置，適應(yīng)完成后正式進(jìn)行糖水偏愛實(shí)驗(yàn)。禁食禁水12 h后，給予事先稱重的1%蔗糖水和蒸餾水各1 瓶，1 h后取出水瓶稱量剩余的蔗糖水瓶與蒸餾水瓶重量。糖水消耗度（%）=糖水消耗量/（蒸餾水+糖水消耗量）×100%。

1.2.4.2 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn) 將動(dòng)物面壁放入箱的左角，試驗(yàn)箱規(guī)格為50 cm×50 cm×40 cm。適應(yīng)30 s后，觀察并記錄3 min 內(nèi)小鼠雙后肢跨越方格的個(gè)數(shù)（水平運(yùn)動(dòng)）與前肢騰空或攀爬壁的次數(shù)（垂直運(yùn)動(dòng)）。試驗(yàn)在無明顯光源的黑暗環(huán)境中進(jìn)行，并于每天11點(diǎn)前結(jié)束，為避免上次動(dòng)物余留的氣味等信息影響測(cè)試結(jié)果，每只小鼠觀察完后需擦拭箱內(nèi)壁及底面。

1.2.4.3 懸液芯片檢測(cè)細(xì)胞因子含量 血清、組織勻漿液樣本進(jìn)行處理，包被不同抗體的微球與標(biāo)準(zhǔn)品、樣品和對(duì)照品25 ℃溫浴孵育10 min；接入生物素標(biāo)記的抗體并孵育30 min；采用洗板機(jī)洗3 次孔板，洗液分別為70%乙醇、30%乙醇、蒸餾水；加 入SA-PE熒光報(bào)告分子，25 ℃溫浴孵育10 min；進(jìn)入Bio-Plex系統(tǒng)，設(shè)置程序，進(jìn)行讀板并檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。采用SPSS21.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。服從正態(tài)分布的指標(biāo)采用±s表示，不服從正態(tài)分布的計(jì)量資料用中位數(shù)M（P25，P75）表示。多組比較服從正態(tài)分布且方差齊性，否則采用H 檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠快感缺失的變化 與空白組比較，各模型組糖水偏嗜度均下降，以抑郁癥、BCRD 組最為顯著（P＜0.01 或P＜0.05），提示模型動(dòng)物核心快感缺失。與乳腺癌組比較，抑郁癥組糖水偏嗜度輕度下降（P＞0.05），BCRD 組糖水偏嗜度下降更為顯著 （P＜0.05）。與抑郁癥組比較，BCRD 組糖水偏嗜度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。提示BCRD 小鼠明顯存在快感缺乏癥狀。見表1。

表1 各組小鼠糖水偏嗜度的變化（±s，n=10，%）Tab.1 Changes in degree of sugar water partial ingestion in each group （±s，n=10，%）

表1 各組小鼠糖水偏嗜度的變化（±s，n=10，%）Tab.1 Changes in degree of sugar water partial ingestion in each group （±s，n=10，%）

Note：Compared with normal group， 1）P＜0.05， 2）P＜0.01； compared with breast cancer group， 3）P＜0.05.

2.2 各組小鼠自主行為變化 與空白組比較，各組水平活動(dòng)、垂直活動(dòng)數(shù)均下降，抑郁癥組、BCRD組下降更為顯著（P＜0.01 或P＜0.05），提示模型動(dòng)物自主活動(dòng)量下降。與乳腺癌組比較，抑郁癥組水平活動(dòng)、垂直活動(dòng)數(shù)輕度下降，而BCRD 組水平活動(dòng)下降更為顯著（P＜0.05）。與抑郁癥組比較，BCRD組水平活動(dòng)、垂直活動(dòng)數(shù)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。提示BCRD 小鼠明顯存在自主活動(dòng)量減少情況。見表2。

表2 各組小鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果（±s，n=10，次數(shù)）Tab.2 Open field test results of mice in each group （±s，n=10，times）

表2 各組小鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果（±s，n=10，次數(shù)）Tab.2 Open field test results of mice in each group （±s，n=10，times）

Note：Compared with normal group， 1）P＜0.05， 2）P＜0.01； compared with breast cancer group， 3）P＜0.05.

2.3 細(xì)胞因子變化

2.3.1 IL-1β 變化 與空白組比較，抑郁癥組血清、海馬、皮質(zhì)中IL-1β 含量顯著增加（P＜0.01 或P＜0.05），乳腺癌組、BCRD 組血清、海馬、皮質(zhì)中IL-1β含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與乳腺癌組比較，抑郁癥組血清、海馬、皮質(zhì)中IL-1β 含量增加（P＞0.05），BCRD 組血清、海馬、皮質(zhì)、腫瘤中IL-1β 含量輕度下降（P＞0.05）。與抑郁癥組比較，BCRD 組 IL-1β含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。提示IL-1β在抑郁癥組血清、海馬、皮質(zhì)中含量顯著增加，而在乳腺癌組和BCRD 組中血液及不同靶組織中無顯著變化。見表3。

表3 小鼠血清、腫瘤、海馬、皮質(zhì)中IL-1β 含量變化（±s， n=10）Tab.3 Changes of IL-1β in serum， tumor， hippocampus and cortex of mice （±s，n=10）

表3 小鼠血清、腫瘤、海馬、皮質(zhì)中IL-1β 含量變化（±s， n=10）Tab.3 Changes of IL-1β in serum， tumor， hippocampus and cortex of mice （±s，n=10）

Note：Compared with normal group， 1）P＜0.05， 2）P＜0.01.

2.3.2 IL-2 變化 與空白組比較，抑郁癥組血清、海馬、皮質(zhì)中IL-2 含量顯著增加（P＜0.01 或P＜0.05），BCRD 組血清、海馬中IL-2含量顯著增加（P＜0.01或P＜0.05）。與乳腺癌組比較，抑郁癥組血清、海馬、皮質(zhì)中IL-2 含量增加（P＞0.05），BCRD 組血清、海馬中IL-2 含量增加（P＜0.05）。與抑郁癥組比較，BCRD 組血清、海馬、皮質(zhì)中IL-2 含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。提示IL-2 在抑郁癥、BCRD 組血清、海馬中的含量顯著增加，而在乳腺癌組血液及不同靶組織中無顯著變化；同時(shí)，皮質(zhì)中的IL-2在抑郁癥組中有顯著變化，而在BCRD 模型中無顯著變化。見表4。

表4 小鼠血清、腫瘤、海馬、皮質(zhì)中IL-2 含量變化（±s， n=10）Tab.4 Changes of IL-2 in serum， tumor， hippocampus and cortex of mice （±s，n=10）

表4 小鼠血清、腫瘤、海馬、皮質(zhì)中IL-2 含量變化（±s， n=10）Tab.4 Changes of IL-2 in serum， tumor， hippocampus and cortex of mice （±s，n=10）

Note：Compared with normal group， 1）P＜0.05， 2）P＜0.01； compared with breast cancer group， 3）P＜0.05.

2.3.3 IL-6 變化 與空白組比較，抑郁癥組、乳腺癌組、BCRD 組血清、海馬、皮質(zhì)中IL-6 的含量顯著增加（P＜0.01 或P＜0.05）。與乳腺癌組比較，BCRD組血清、海馬、皮質(zhì)中IL-6 含量顯著增加（P＜0.05），腫瘤組織中IL-6 含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；抑郁癥組血清、海馬、皮質(zhì)中IL-6 含量增加，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與抑郁癥組比較，BCRD 組血清、海馬、皮質(zhì)中IL-6 含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。提示抑郁癥、乳腺癌、BCRD 組血清、海馬、皮質(zhì)中IL-6 含量顯著增加，且IL-6 在BCRD 模型不同靶組織中增加更為顯著。見表5。

表5 小鼠血清、腫瘤、海馬、皮質(zhì)中IL-6 含量變化（±s， n=10）Tab.5 Changes of IL-6 in serum， tumor， hippocampus and cortex of mice （±s，n=10）

表5 小鼠血清、腫瘤、海馬、皮質(zhì)中IL-6 含量變化（±s， n=10）Tab.5 Changes of IL-6 in serum， tumor， hippocampus and cortex of mice （±s，n=10）

Note：Compared with normal group， 1）P＜0.05， 2）P＜0.01； compared with breast cancer group， 3）P＜0.05.

2.3.4 IL-10 變化 與空白組比較，抑郁癥、乳腺癌、BCRD 組血清、海馬、皮質(zhì)中IL-10 含量顯著增加（P＜0.01 或P＜0.05）。與乳腺癌組比較，BCRD 組海馬組織中IL-10 的含量顯著增加（P＜0.05），抑郁癥組血清、海馬、皮質(zhì)中IL-10 含量增加（P＞0.05）。與抑郁癥組比較，BCRD 組血清、海馬、皮質(zhì)中IL-10 含量增加，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。提示BCRD組海馬組織中IL-10水平提高更為顯著。見表6。

表6 小鼠血清、腫瘤、海馬、皮質(zhì)中IL-10 含量變化（±s， n=10）Tab.6 Changes of IL-10 in serum， tumor， hippocampus and cortex of mice （±s，n=10）

表6 小鼠血清、腫瘤、海馬、皮質(zhì)中IL-10 含量變化（±s， n=10）Tab.6 Changes of IL-10 in serum， tumor， hippocampus and cortex of mice （±s，n=10）

Note：Compared with normal group， 1）P＜0.05， 2）P＜0.01； compared with breast cancer group， 3）P＜0.05.

2.3.5 IL-12 變化 與空白組比較，抑郁癥、BCRD組血清、海馬、皮質(zhì)中IL-12 含量顯著增加（P＜0.01或P＜0.05）。與乳腺癌組比較，抑郁癥組血清、海馬、皮質(zhì)中IL-12 含量顯著增加（P＜0.05，P＜0.01），BCRD 組血清、海馬中IL-12 含量顯著增加（P＜0.01或P＜0.05）。與抑郁癥組比較，BCRD 組血清、海馬、皮質(zhì)中IL-12 含量降低，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。提示BCRD 組血清、海馬中IL-12 含量明顯增加，但較抑郁癥組表達(dá)降低。見表7。

表7 小鼠血清、腫瘤、海馬、皮質(zhì)中IL-12 含量變化（±s， n=10）Tab.7 Changes of IL-12 in serum， tumor， hippocampus and cortex of mice （±s，n=10）

表7 小鼠血清、腫瘤、海馬、皮質(zhì)中IL-12 含量變化（±s， n=10）Tab.7 Changes of IL-12 in serum， tumor， hippocampus and cortex of mice （±s，n=10）

Note：Compared with normal group，1）P＜0.05， 2）P＜0.01； compared with breast cancer group， 3）P＜0.05， 4）P＜0.01.

3 討論

行為學(xué)評(píng)價(jià)可以重現(xiàn)臨床上患者行為學(xué)的特征，在某種程度上可以很好地評(píng)價(jià)動(dòng)物模型的表征改變。抑郁癥常見的行為學(xué)檢測(cè)主要從獎(jiǎng)賞、探索、絕望等多個(gè)層次展開。其中，獎(jiǎng)賞方面主要有糖水偏嗜度，可反映抑郁癥的核心癥狀快感缺失［8］；探索方面主要有曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)，其中自主、探究活動(dòng)下降及緊張度增高是抑郁癥的重要表征［7］。本研究表明，與抑郁癥組、乳腺癌組比較，BCRD 模型小鼠糖水偏嗜度、自主活動(dòng)顯著下降，進(jìn)一步說明BCRD 模型小鼠存在顯著的抑郁樣行為。

外周免疫激活驅(qū)動(dòng)大腦中的免疫激活，與癌癥患者的行為（如疲勞）和精神疾病（包括抑郁癥和認(rèn)知障礙）密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌術(shù)前和術(shù)后 6 個(gè)月患者的細(xì)胞因子基因變異與抑郁癥狀存在緊密關(guān)系［9］。腫瘤患者放療或化療后疲乏，抑郁量表評(píng)分升高，同時(shí)NF-κB、IL-6 水平升高，進(jìn)一步證明了BCRD 與免疫紊亂的直接相關(guān)性［10］。細(xì)胞因子根據(jù)其在炎癥反應(yīng)中的不同作用可分為促炎、抗炎因子。促炎因子包括IL-1、IL-2、IL-6、IL-12 等，其作用是通過激活免疫細(xì)胞在局部或遠(yuǎn)隔部位發(fā)揮作用；抗炎因子包括IL-10、IL-19 等。IL-1β 是一種單核因子，可增強(qiáng)宿主對(duì)體內(nèi)外刺激的應(yīng)答能力［11］。IL-2是一種由活化的淋巴細(xì)胞分泌的淋巴因子，有促進(jìn)和維持T細(xì)胞增殖與分化的功能［12］。IL-10 可以激活NK 細(xì)胞以維持CD4+T 細(xì)胞和CD8+T 細(xì)胞的抗腫瘤應(yīng)答［13］。IL-6 主要是由活化的T 細(xì)胞產(chǎn)生的淋巴因子，可促進(jìn)自然殺傷細(xì)胞裂解，并誘導(dǎo)T 細(xì)胞增殖、分化，是炎癥反應(yīng)的促發(fā)劑［14］。IL-12 主要來源于樹突狀細(xì)胞及B淋巴細(xì)胞，可參與機(jī)體感染、腫瘤、自身免疫性疾病的免疫調(diào)節(jié)［15］。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：①BCRD 模型的炎癥狀態(tài)為：同 一個(gè)炎癥因子在不同組織中含量顯著不同，即同 一個(gè)細(xì)胞因子在血清和海馬中的含量較高，腫瘤次之，皮質(zhì)中含量最低；血清中IL-12 含量高于其在海馬、皮質(zhì)、腫瘤中的表達(dá)，海馬中IL-2、IL-10 含量高于其在血清、腫瘤、皮質(zhì)中的表達(dá)，說明細(xì)胞因子在體內(nèi)的分布呈不均一狀態(tài)，不同部位的細(xì)胞因子在疾病發(fā)生發(fā)展中起不同效應(yīng)；②與乳腺癌組比較，BCRD 組腫瘤組織中IL-1β、IL-2、IL-6、IL-10、IL-12含量無顯著變化，說明乳腺癌繼發(fā)抑郁癥后不會(huì)對(duì)原有癌組織中的細(xì)胞因子產(chǎn)生影響。上述研究結(jié)果與臨床上觀測(cè)到的癌癥伴發(fā)抑郁癥患者細(xì)胞因子變化結(jié)果一致［16］。同時(shí)，通過對(duì)數(shù)據(jù)的縱向比較發(fā)現(xiàn)，IL-6 在血清、海馬、皮質(zhì)中的含量均較高且均一，可能是BCRD的重要指征。

綜上，本課題組認(rèn)為細(xì)胞因子在BCRD 的發(fā)病機(jī)制中起重要作用，探討細(xì)胞因子變化對(duì)明確BCRD 的預(yù)防及治療有著極為重要的意義。下一步將繼續(xù)以IL-6 為核心，探討其在BCRD 發(fā)生發(fā)展中的分子機(jī)制。