余 瑛 （贛州市腫瘤醫(yī)院婦科，贛州 341000）

宮頸癌（cervical cancer，CC）是威脅全球女性的第二大惡性腫瘤，其發(fā)病率逐年升高，且呈年輕化趨勢［1-2］。目前，臨床上治療CC 主要采用化療、放療及手術(shù)等方法，但這些治療手段會損傷患者的免疫功能，不利于患者的生存健康，因此尋找安全有效的CC 治療方法，是臨床研究的重點和難點之一［3-4］。CC 發(fā)生、發(fā)展及結(jié)局與機(jī)體免疫功能抑制關(guān)系密切，而腫瘤免疫應(yīng)答需要機(jī)體免疫系統(tǒng)有效識別并分泌腫瘤抗原，促進(jìn)特異性T細(xì)胞活化發(fā)揮作用［5-6］。程序性死亡因子-1（programmed death-1，PD-1）/程序性死亡因子配體-1（programmed death receptor-1，PD-L1）在腫瘤表面及外周血T 細(xì)胞中表達(dá)較高，且能夠調(diào)節(jié)機(jī)體免疫效應(yīng)，促進(jìn)腫瘤生長，是近年來免疫學(xué)研究的“明星分子”［6-7］。木犀草素是從木犀草的莖葉中提取的黃酮類化合物，具有抗炎、抗菌、抗腫瘤等多種生物學(xué)效應(yīng)［8-9］。近年研究發(fā)現(xiàn)，木犀草素可抑制腸癌、乳腺癌、卵巢癌等多種癌癥細(xì)胞的增殖和生長，且能夠增強(qiáng)腫瘤對化療藥物的敏感性，并增強(qiáng)化療藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用［10］。木犀草素抗腫瘤的分子機(jī)制復(fù)雜，且木犀草素對CC患者素外周血T細(xì)胞亞群及PD-1/PD-L1通路的影響未見報道，本文對此進(jìn)行探討，以期為臨床用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 清潔級健康雌性SD 大鼠60 只，體質(zhì)量200～220 g，由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供，生產(chǎn)許可證號為SCXK（粵）2019-0002，動物質(zhì)量合格證號為省科委2000A027。所有大鼠于贛州市腫瘤醫(yī)院動物房中飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件：自然光照，自由飲食、飲水，溫度25 ℃，相對濕度50%，噪聲＜80 分貝，保持動物房環(huán)境及鼠籠清潔、透氣。本研究經(jīng)贛州市腫瘤醫(yī)院動物倫理委員會批準(zhǔn)同意，批號為 IACUC-01（20180917）。試驗符合3R原則。

1.1.2 主要試劑及儀器 人宮頸癌HeLa 細(xì)胞株（貨號：HZ-CC100769，上海恒斐生物科技有限公司）；木犀草素（貨號：BZ008，山東臨沂艾澤拉斯生物科技有限公司，規(guī)格：20 mg）；血管內(nèi)皮生長因子（VEGF） ELISA 試劑盒（貨號：QY-MB10210，上海喬羽生物科技有限公司）；IL-10 ELISA 試劑盒（貨號：ml028604，蘇州瑞諾德生物科技有限公司）；轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β） ELISA 試劑盒（貨號：R31808，上海圻明生物科技有限公司）；PD-1 抗體（貨號：ab228857）、PD-L1 抗體（貨號：ab213480）、BCA 蛋白定量試劑盒和胰蛋白酶（貨號分別為P0768、P0231），均購自美國Pierce 公司；beamCyte-1026 流式細(xì)胞儀（上海然哲儀器設(shè)備有限公司）；蛋白電泳儀、半干轉(zhuǎn)膜儀（美國Bio-Rad 公司，型號1659001、Trans-Blot SD）等。

1.2 方法

1.2.1 人宮頸癌HeLa 細(xì)胞培養(yǎng) 人宮頸癌HeLa細(xì)胞株常規(guī)復(fù)蘇，置于RPMI1640 完全培養(yǎng)液中，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)24 h，細(xì)胞處于對數(shù)生長期時終止培養(yǎng)，1 200 r/min 離心10 min，制備1×107個/ml 宮頸癌HeLa細(xì)胞懸液備用。

1.2.2 大鼠CC 模型建立及分組給藥 參照文獻(xiàn)［11］構(gòu)建大鼠CC 模型，具體操作方法為：取50只大鼠，左側(cè)腋窩處皮下注射0.5 ml HeLa 細(xì)胞懸液，7 d后大鼠左腋窩處有明顯腫瘤結(jié)節(jié)生長為造模成功。取造模成功大鼠40只，隨機(jī)分為CC 模型組、木犀草素低（5 mg/kg）、中（25 mg/kg）、高（50 mg/kg）劑量組，每組10只，另取10只SD雌性大鼠，于左側(cè)腋窩處皮下注射0.9%氯化鈉（NaCl）溶液0.5 ml，7 d 后作為空白對照組（Control 組）［12］。各組造模成功后開始給藥，木犀草素以生理鹽水配置為0.50 mg/ml、2.50 mg/ml、5.00 mg/ml 的混懸液，木犀草素組大鼠 10 ml/kg 經(jīng)腹腔注射給藥，Control 組與CC 組注射給予等劑量生理鹽水，各組連續(xù)給藥30 d，2次/d。

1.2.3 大鼠標(biāo)本采集 各組大鼠于末次給藥后 12 h，稱取大鼠體質(zhì)量，麻醉處死，取目眶血6 ml 置于肝素抗凝管中，解剖大鼠，取腫瘤組織，稱取瘤體質(zhì)量，并用游標(biāo)卡尺檢測瘤體的短徑（a）、長徑（b）。

1.2.4 各組大鼠瘤體體積及抑瘤率計算 腫瘤體積=1/2×a×b2；抑瘤率（%）=（1-給藥組平均腫瘤重量/模型組平均腫瘤重量）×100%。

1.2.5 各組大鼠腫瘤組織中VEGF 表達(dá)及外周血IL-10 和TGF-β 含量檢測 檢測瘤體體積后取各組大鼠0.5 g腫瘤組織，組織勻漿器勻漿，離心，取上清液，按ELISA 試劑盒說明書方法檢測VEGF 含量。取0.5 ml 目眶血3 000 r/min 離心15 min，取上清按ELISA試劑盒說明書方法檢測IL-10與TGF-β含量。

1.2.6 各組大鼠外周血T淋巴亞群檢測 取0.5 ml目眶血加入紅細(xì)胞裂解液，冰浴30 min，4 ℃、 1 000 r/min 離心5 min 后棄上清液，PBS 洗滌，細(xì)胞計數(shù)，調(diào)整濃度為1×107個/ml，取100 μl細(xì)胞液，加入大鼠PE-anti-mCD4、FITC-anti-mCD8、PE-anti-CD25 APC 單克隆抗體，混勻后4 ℃避光靜置40 min，PBS洗滌，4 ℃、1 000 r/min 離心5 min，棄上清液，加入0.5 ml PBS 重懸，流式細(xì)胞儀檢測T淋巴細(xì)胞CD4+、CD8+、CD4+CD25+T百分比，計算其比值。

1.2.7 Western blot檢測外周血及腫瘤組織中PD-1、PD-L1 蛋白相對表達(dá) 取新鮮抗凝血，淋巴細(xì)胞分離液分離外周單核細(xì)胞，磷酸緩沖液（PBS）清洗 2 次，加入組織裂解液RIPA 冰上裂解30 min，4 ℃、14 000 r/min 離心15 min，收集上清液。分別取上清液與1.2.5 中組織勻漿液，按BCA 試劑盒說明書測定蛋白濃度。BCA 法測定蛋白濃度并灌制SDSPAGE 后，分別取200 μg蛋白電泳，將全部蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉溶液37 ℃搖床封閉2 h，將目的蛋白條帶置于孵育盒中，加入抗體PD-1 （1∶1 000）、PD-L1（1∶1 000）、β-actin（1∶2 000） 4 ℃冰箱中孵育過夜。TBST 漂洗3 次，加入1∶1 000 的羊抗兔二抗溶液，室溫下?lián)u床孵育2 h，TBST 漂洗3 次，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色，凝膠成像儀觀察條帶并拍照，采用Image J軟件分析各組蛋白相對表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以±s表示，組間比較進(jìn)行單因素方差分析，進(jìn)一步兩組間比較行LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠體質(zhì)量、瘤體質(zhì)量及體積、抑瘤率檢測結(jié)果 與Control 組相比，CC 組大鼠體質(zhì)量降低（P＜0.05），瘤體體積及質(zhì)量升高（P＜0.05）；與CC 組相比，木犀草素低、中、高劑量組大鼠體質(zhì)量、抑瘤率均升高（P＜0.05），瘤體體積及質(zhì)量均降低（P＜0.05），且木犀草素各劑量組上述指標(biāo)呈劑量依賴性，見表1、圖1。

表1 各組大鼠體質(zhì)量、瘤體質(zhì)量、抑瘤率結(jié)果表（±s，n=10）Tab.1 Body weight， tumor weight and tumor inhibition rate of rats in each group （±s，n=10）

表1 各組大鼠體質(zhì)量、瘤體質(zhì)量、抑瘤率結(jié)果表（±s，n=10）Tab.1 Body weight， tumor weight and tumor inhibition rate of rats in each group （±s，n=10）

Note：1）P＜0.05 vs Control group； 2）P＜0.05 vs CC group； 3）P＜0.05 vs luteolin low dose group； 4）P＜0.05 vs luteolin medium dose group.

圖1 各組大鼠腫瘤組織外觀圖Fig.1 Appearance of tumor tissue in each group

2.2 大鼠腫瘤組織VEGF 含量檢測結(jié)果 與Control 組相比，CC 組大鼠VEGF 含量升高（P＜0.05）；與CC 組相比，木犀草素低、中、高劑量組大鼠VEGF 含量降低（P＜0.05），且木犀草素各劑量組上述指標(biāo)呈劑量依賴性，見表2。

表2 各組大鼠腫瘤組織VEGF含量檢測結(jié)果（±s，n=10）Tab.2 Detection results of VEGF content in tumor tissue of rats in each group （±s，n=10）

表2 各組大鼠腫瘤組織VEGF含量檢測結(jié)果（±s，n=10）Tab.2 Detection results of VEGF content in tumor tissue of rats in each group （±s，n=10）

Note：1）P＜0.05 vs control group； 2）P＜0.05 vs CC group； 3）P＜0.05 vs luteolin low dose group； 4）P＜0.05 vs luteolin medium dose group.

2.3 各組大鼠外周血T 細(xì)胞亞群CD8+T、CD4+T 及CD4+CD25+T 百分比結(jié)果 與Control 組相比，CC 組大鼠外周血T 細(xì)胞亞群CD4+CD25+T 占比升高（P＜0.05），CD4+T 及CD8+T 占比降低（P＜0.05）；與CC 組相比，木犀草素低、中、高劑量組大鼠外周血T 細(xì)胞亞 群CD4+CD25+T 占 比 降 低（P＜0.05），CD4+T 及CD8+T 占比升高（P＜0.05），且木犀草素各劑量組上述指標(biāo)呈劑量依賴性，見表3。

表3 各組大鼠外周血T細(xì)胞亞群CD8+T、CD4+T及CD4+CD25+T百分比結(jié)果（xˉ±s，n=10）Tab.3 Percentages of T cell subsets CD8+T， CD4+T and CD4+CD25+T in peripheral blood of rats in each group （±s，n=10）

表3 各組大鼠外周血T細(xì)胞亞群CD8+T、CD4+T及CD4+CD25+T百分比結(jié)果（xˉ±s，n=10）Tab.3 Percentages of T cell subsets CD8+T， CD4+T and CD4+CD25+T in peripheral blood of rats in each group （±s，n=10）

Note：1）P＜0.05 vs control group； 2）P＜0.05 vs CC group； 3）P＜0.05 vs luteolin low dose group； 4）P＜0.05 vs luteolin medium dose group.

2.4 各組大鼠外周血免疫抑制因子IL-10和TGF-β含量檢測結(jié)果 與Control 組相比，CC 組大鼠外周血IL-10 和TGF-β 含量升高（P＜0.05）；與CC 組相比，木犀草素低、中、高劑量組大鼠外周血IL-10 和TGF-β 含量降低（P＜0.05），且木犀草素各劑量組上述指標(biāo)呈劑量依賴性，見表4。

表4 各組大鼠外周血IL-10 和TGF-β 含量檢測結(jié)果（±s， n=10）Tab.4 Detection results of IL-10 and TGF-β contents in peripheral blood of rats in each group （±s，n=10）

表4 各組大鼠外周血IL-10 和TGF-β 含量檢測結(jié)果（±s， n=10）Tab.4 Detection results of IL-10 and TGF-β contents in peripheral blood of rats in each group （±s，n=10）

Note：1）P＜0.05 vs control group； 2）P＜0.05 vs CC group； 3）P＜0.05 vs luteolin low dose group； 4）P＜0.05 vs luteolin medium dose group.

2.5 各組大鼠外周血單核細(xì)胞中PD-1、PD-L1蛋白相對表達(dá)結(jié)果 與Control 組相比，CC 組大鼠外周血PD-1、PD-L1 蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）；與CC 組相比，木犀草素低、中、高劑量組大鼠外周血PD-1、 PD-L1 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05），且木犀草素各劑量組上述指標(biāo)呈劑量依賴性，見圖2、表5。

圖2 外周血單核細(xì)胞中PD-1、PD-L1蛋白表達(dá)免疫印記圖Fig.2 Immunoblotting of PD-1 and PD-L1 protein expressions in peripheral blood monocytes

表5 各組大鼠外周血單核細(xì)胞中PD-1、PD-L1 蛋白表達(dá)（±s，n=10）Tab.5 Protein expression of PD-1 and PD-L1 in peripheral blood mononuclear cells of rats in each group（xˉ±s，n=10）

表5 各組大鼠外周血單核細(xì)胞中PD-1、PD-L1 蛋白表達(dá)（±s，n=10）Tab.5 Protein expression of PD-1 and PD-L1 in peripheral blood mononuclear cells of rats in each group（xˉ±s，n=10）

Note：1）P＜0.05 vs control group； 2）P＜0.05 vs CC group； 3）P＜0.05 vs luteolin low dose group； 4）P＜0.05 vs luteolin medium dose group.

3 討論

CC 嚴(yán)重威脅女性健康和生命安全［1］。CC 的動物模型對提高宮頸癌的實驗研究水平有重要意義［13］。將人類腫瘤種植于裸鼠，可保留人類腫瘤部分病理學(xué)、生物學(xué)特性［14］。本研究發(fā)現(xiàn)在大鼠左側(cè)腋窩處皮膚注射人類宮頸癌HeLa 細(xì)胞懸液后，與Control 組相比，CC 組大鼠出現(xiàn)腫瘤結(jié)節(jié)，體質(zhì)量減輕、CC 病灶體積及腫瘤重量增大，且腫瘤組織中VEGF 表達(dá)升高，提示大鼠皮下注射人類宮頸癌HeLa細(xì)胞懸液后出現(xiàn)腫瘤，且腫瘤組織中血管生成較多，預(yù)示腫瘤血管較豐富，腫瘤惡化可能較高，造模成功。中藥天然提取物木犀草素具有抗腫瘤作用，且安全性、有效性較高［10］。如GAO 等［14］及YAO等［15］發(fā)現(xiàn)不同濃度的木犀草素可抑制乳腺癌及大腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，提示木犀草素具有較好的抗腫瘤作用。但木犀草素對CC 的治療作用未見報道。考慮到木犀草素對CC 也可能有治療作用，本研究建立大鼠CC 模型，對此進(jìn)行驗證，發(fā)現(xiàn)木犀草素組低、中、高劑量組大鼠體質(zhì)量升高，CC 病灶體積及腫瘤重量、腫瘤組織中VEGF 表達(dá)均低于CC 模型組，提示給予腫瘤大鼠木犀草素治療后，腫瘤體積大小及腫瘤血管生成均降低，木犀草素可抑制CC 模型大鼠腫瘤生長及血管生成，對CC 具有一定治療作用，然而其治療CC 的具體作用機(jī)制還不明確，下一步研究將對此繼續(xù)探究。

近來研究發(fā)現(xiàn)，人體免疫功能夠監(jiān)視、殺滅癌細(xì)胞，且免疫治療成為當(dāng)今腫瘤治療和研究的一大熱 點［7，16］。T 細(xì) 胞 可 表 達(dá) 多 種 重 要 的 膜 分 子 如CD4+T、CD8+T 等，并參與T 細(xì)胞識別抗原、活化、增殖而介導(dǎo)機(jī)體免疫反應(yīng)［17］。另外CD4+T細(xì)胞可在抗原提呈細(xì)胞的協(xié)助下，識別腫瘤細(xì)胞分泌的可溶性抗原，繼而釋放多種細(xì)胞因子（IL-2、IFN-γ、IL-4 等），促進(jìn)B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞的激活，幫助其殺傷腫瘤細(xì)胞；CD8+T 可與惡性腫瘤表面的抗原-Ⅰ及β2微球蛋白結(jié)合形成特異性復(fù)合物，使CD8+T淋巴細(xì)胞表面受體TCR 及相關(guān)信號分子聚集于復(fù)合物周圍，導(dǎo)致毒性T 淋巴細(xì)胞通過分泌含有穿孔素和顆粒酶的細(xì)胞毒性顆粒直接導(dǎo)致癌細(xì)胞破壞，或間接分泌IFN-γ 和TNF 等細(xì)胞因子殺傷癌細(xì)胞［17］。而CD4+T 細(xì)胞亞群中的CD4+CD25+T 通過分泌免疫抑制因子TGF-β、IL-10 因子，抑制自然殺傷細(xì)胞激活，減少自然殺傷細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的毒害及殺傷作用，發(fā)揮免疫抑制效應(yīng)［18］。如陳志剛等［19］發(fā)現(xiàn)在CC患者外周血中免疫抑制因子CD4+CD25+T 及TGF-β、IL-10 水平均明顯升高，提示CC 患者體內(nèi)可能存在T 淋巴細(xì)胞亞群分泌異常及免疫抑制現(xiàn)象。本研究發(fā)現(xiàn)，CC 組大鼠外周血T 細(xì)胞亞群CD8+T、CD4+T 水平低于Control 組，CD4+CD25+T、IL-10 和TGF-β 水平高于Control 組，提示CC 組大鼠體內(nèi)具有提高免疫功能作用和殺傷細(xì)胞作用的CD4+T、CD8+T 細(xì)胞減少，有抑制機(jī)體免疫功能、減少癌細(xì)胞殺傷力作用的CD4+CD25+T 細(xì)胞分泌增多，提示CC 大鼠腫瘤生長作用可能與T 淋巴細(xì)胞亞群分泌異常，機(jī)體免疫功能降低有關(guān)。

研究證實表達(dá)于活化的T 細(xì)胞（CD4+T、CD8+T）中的PD-1，可與癌細(xì)胞中的受體PD-L1 結(jié)合，從而抑制T 淋巴細(xì)胞的增殖和分化，導(dǎo)致T 細(xì)胞功能減弱、喪失甚至消失而損害機(jī)體免疫功能，此外CD4+T細(xì)胞中的PD-1 與受體PD-L1 結(jié)合后會吸引更多的SHP-2 磷酸酶去磷酸化下游Syk 和磷脂酰肌醇3 激酶，使機(jī)體免疫功能傳遞出抑制信號并阻礙淋巴細(xì)胞及CD4+T 增殖活化，而減弱機(jī)體發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)［20-21］。MANDAI 等［22］發(fā)現(xiàn)阻斷PD-1 與PD-L1 結(jié)合后，CD4+T、CD8+T細(xì)胞比例升高，機(jī)體腫瘤生長緩慢且控制較好，提示抑制PD-1/PD-L1 通路激活，可逆轉(zhuǎn)CD4+T、CD8+T 細(xì)胞受抑制狀態(tài)，加強(qiáng)并維持機(jī)體內(nèi)源性免疫抗腫瘤效應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)，CC組大鼠外周血單核細(xì)胞中PD-1、PD-L1 表達(dá)明顯高于Control組，提示CC 大鼠機(jī)體抗腫瘤作用減弱、腫瘤生長較快可能與PD-1/PD-L1 通路激活，CD4+T、CD8+T 細(xì)胞免疫受抑制，T 細(xì)胞活化程度和殺傷能力降低有關(guān)。木犀草素是否通過抑制PD-1/PD-L1 通路表達(dá)調(diào)控機(jī)體免疫，發(fā)揮抗腫瘤作用，文獻(xiàn)研究較少。本研究發(fā)現(xiàn)，與CC 組相比，木犀草素低、中、高劑量組大鼠外周血PD-1、PD-L1表達(dá)降低，T細(xì)胞亞群CD8+T、CD4+T 升高，免疫抑制因子CD4+CD25+T、IL-10 和 IL-6 分泌減少，提示木犀草素各劑量組大鼠外周血PD-1/PD-L1 通路被抑制，機(jī)體免疫功能處于激活狀態(tài)，提示木犀草素可能通過抑制CC 模型大鼠外周血PD-1、PD-L1表達(dá)，逆轉(zhuǎn)CD4+T、CD8+T細(xì)胞受抑制狀態(tài)，提高機(jī)體免疫功能來發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。

綜上所述，木犀草素可能通過抑制CC 模型大鼠外周血PD-1、PD-L1表達(dá)，逆轉(zhuǎn)CD4+T、CD8+T細(xì)胞受抑制狀態(tài)，調(diào)高機(jī)體免疫功能來抑制腫瘤生長。為臨床治療CC 和闡明木犀草素抗腫瘤機(jī)制提供一定的參考。但本研究也存在一定的不足，未設(shè)置通路抑制劑，木犀草素抗腫瘤分子機(jī)制復(fù)雜，也可能通過其他途徑提高機(jī)體免疫功能，發(fā)揮抗腫瘤機(jī)制，有待后續(xù)研究。