暢秀麗 張安兵 （湖北文理學(xué)院附屬醫(yī)院，襄陽市中心醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，襄陽 441021）

急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎（acute gouty arthritis，AGA）是一種常見的炎癥性關(guān)節(jié)炎，其主要特征為尿酸增加和關(guān)節(jié)內(nèi)尿酸鈉晶體（monosodium urate，MSU）積累，表現(xiàn)出強(qiáng)烈疼痛、關(guān)節(jié)腫脹及活動性炎癥等癥狀，具有高發(fā)病率和致殘率［1-2］。目前用于治療AGA的藥物會導(dǎo)致患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)、胃腸道、肝腎功能損傷，因此有必要尋找新的有效治療藥物，減少藥物副作用［3］。白芍總苷（total glucosides of paeony，TGP）作為白芍提取物具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)的作用，已被廣泛用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病［4］。有研究表明TGP 可能通過抑制促炎因子水平，對MSU 誘導(dǎo)的AGA 大鼠具有治療作用［5］。核因子-κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）/含NLR 家族Pyrin 域蛋白3（NLR family，Pyrin domain containing protein 3，NLRP3）信號通路與MSU 晶體誘導(dǎo)的炎癥細(xì)胞因子釋放有關(guān)［6］。研究發(fā)現(xiàn)，TGP 可通過抑制NLRP3 和NF-κB 表達(dá)抑制MSU 誘導(dǎo)的THP-1 巨噬細(xì)胞炎癥［7］。目前，關(guān)于TGP 是否可通過調(diào)控NFκB/NLRP3通路影響AGA 模型大鼠炎癥反應(yīng)還未可知，因此本研究通過對其探究以期為TGP 在AGA 中的治療機(jī)制研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 華中科技大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供的60 只SPF 級SD 大鼠（245～290 g），許可證號：SCXK（鄂）2016-0009，適應(yīng)性飼養(yǎng)于12 h/12 h 明暗交替的環(huán)境中1 周，期間自由飲水、采食，實(shí)驗(yàn)前禁食12 h。

1.1.2 主要試劑與儀器 TGP（南京景竹生物科技有限公司，貨號：JZ20130101）；秋水仙堿（上海寶曼生物科技有限公司，貨號：D0123）；尿酸鈉（上海一研生物科技有限公司，貨號：EY-5948）；TNF-α、IL-6、IL-1β ELISA 試劑盒（武漢菲恩生物科技有限公司，貨號：ER1393、ER0042、EH0185）；HE 染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，貨號：G1120-100）；蛋白提取試劑盒（武漢純度生物科技有限公司，貨號：CD-13559-ML）；BCA 蛋白檢測試劑盒、HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG 二抗抗體（北京百奧萊博科技有限公司，貨號：HR0329-ZHV、JN0200-GLH）；兔抗β-actin、p-NF-κB p65、NF-κB p65、p-IκBα、IκBα、NLRP3、Caspase-1 抗 體（Cell Signaling Technology，貨 號：4970、3033、8242、2859、9242、15101、2225）。Invitrogen 凝膠成像系統(tǒng)購自賽默飛世爾；RT2100C 全自動酶標(biāo)儀購自德國IFP公司。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型構(gòu)建 60只SD大鼠以每組10只隨機(jī)分為對照組、AGA組、秋水仙堿組（0.65 mg/kg）、TGP-L 組（10 mg/kg）、TGP-M 組（20 mg/kg）、TGP-H組（40 mg/kg）［8-9］。對照組和AGA 組于每天9：00 灌胃生理鹽水，秋水仙堿組、TGP-L組、TGP-M組、TGP-H組每天分別灌胃0.65 mg/kg 秋水仙堿及10、20、 40 mg/kg TGP，進(jìn)行7 d，第5 天給藥1 h 后，除對照 組外其余大鼠右側(cè)踝關(guān)節(jié)背側(cè)注射0.2 ml MSU （100 mg/ml），誘導(dǎo)AGA模型，肉眼可見關(guān)節(jié)處僵硬、紅腫及行動受限則表明造模成功，對照組注射等量生理鹽水，造模結(jié)束后，再灌胃2 d，觀察大鼠一般情況［10］。

1.2.2 大鼠步態(tài)及關(guān)節(jié)炎癥指數(shù)評價(jià) 造模24 h后進(jìn)行大鼠步態(tài)分級：0 級，行走正常；1 級，下肢微彎、跛行；2 級，下肢僅接觸地面、中度跛行；3 級， 三足行走，跛行嚴(yán)重。關(guān)節(jié)炎癥指數(shù)評價(jià)：0 級，關(guān)節(jié)正常；1級，骨標(biāo)志明顯、關(guān)節(jié)輕度紅腫；2級，骨標(biāo)志不明顯、關(guān)節(jié)紅腫明顯；3 級，出現(xiàn)關(guān)節(jié)外紅腫 現(xiàn)象［11］。

1.2.3 大鼠關(guān)節(jié)腫脹程度檢測 于造模前及造模后6 h、12 h、24 h、48 h檢測大鼠右側(cè)踝關(guān)節(jié)容積，腫脹程度（%）=（造模前關(guān)節(jié)容積-測試時(shí)間點(diǎn)關(guān)節(jié)容積）×100%。

1.2.4 HE 染色觀察大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織病理學(xué)變化 隨機(jī)選取5 只大鼠，頸椎脫臼處死后于關(guān)節(jié)腔中注射生理鹽水（1 ml），活動關(guān)節(jié)后收集關(guān)節(jié)液，隨后取踝關(guān)節(jié)滑膜組織于多聚甲醛（4%）中固定24 h，乙醇脫水（5 min）、石蠟包埋后進(jìn)行常規(guī)切片（4 μm）、二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化、蘇木精-伊紅染色、梯度乙醇脫水，封片后顯微鏡觀察（n=5）。

1.2.5 ELISA 法檢測大鼠關(guān)節(jié)液中炎癥因子水平 通過ELISA檢測試劑盒檢測所得關(guān)節(jié)液中腫瘤TNF-α、IL-1β、IL-6水平，按試劑盒說明書操作。

1.2.6 Western blot 檢測大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織各蛋白表達(dá)情況 取余下5 只大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織，使用組織裂解液裂解組織后提取總蛋白，根據(jù)BCA 試劑盒說明書檢測組織總蛋白含量；取上樣緩沖液與蛋白混勻后100 ℃變性5 min，進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳（40 μg/孔），低溫轉(zhuǎn)至PVDF膜，經(jīng)過5%脫脂奶粉封閉1 h 后，加入兔抗β-actin、p-NF-κB p65、NFκB p65、p-IκBα、IκBα、NLRP3、Caspase-1（1∶1 000）一抗4 ℃孵育過夜，PBS 清洗3 次，添加HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（1∶3 000）孵育2 h，添加發(fā)光試劑（ECL Reagent）顯色，蛋白凝膠成像儀觀察后進(jìn)行定量分析（n=5）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 SPSS20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以±s描述計(jì)量資料，采用單因素方差分析進(jìn)行多組間比較，采用SNK-q檢驗(yàn)多組間的兩兩比較，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況比較 對照組大鼠關(guān)節(jié)無腫脹現(xiàn)象、皮毛光亮、運(yùn)動靈活；AGA 組大鼠關(guān)節(jié)腫脹、跛行、皮毛無光澤、精神倦怠、活動量及進(jìn)食量減少；秋水仙堿組、TGP-L 組、TGP-M 組、TGP-H 組大鼠關(guān)節(jié)腫脹、皮毛光澤度、飲食、精神狀態(tài)及行動均得到有效改善。

2.2 TGP 對AGA 大鼠步態(tài)與關(guān)節(jié)炎癥指數(shù)的影響 與對照組相比，AGA 組大鼠步態(tài)級別與關(guān)節(jié)炎癥指數(shù)顯著升高（P＜0.05）；與AGA 組相比，秋水仙堿組、TGP-L組、TGP-M組和TGP-H組大鼠步態(tài)級別與關(guān)節(jié)炎癥指數(shù)顯著降低，存在TGP劑量依賴性（P＜0.05）；與秋水仙堿組相比，TGP-H 組大鼠步態(tài)級別與關(guān)節(jié)炎癥指數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 TGP 對AGA 大鼠步態(tài)與關(guān)節(jié)炎癥指數(shù)的影響（±s， n=10）Tab.1 Effects of TGP on gait and arthritis index of AGA rats （±s，n=10）

表1 TGP 對AGA 大鼠步態(tài)與關(guān)節(jié)炎癥指數(shù)的影響（±s， n=10）Tab.1 Effects of TGP on gait and arthritis index of AGA rats （±s，n=10）

Note：Compared with control group， 1）P＜0.05； compared with AGA group， 2）P＜0.05； compared with TGP-L group， 3）P＜0.05； compared with TGP-M group， 4）P＜0.05.

2.3 TGP 對AGA 大鼠關(guān)節(jié)腫脹的影響 AGA 組、秋水仙堿組、TGP-L組、TGP-M組和TGP-H組大鼠關(guān)節(jié)腫脹程度在6 h 時(shí)最大，隨著時(shí)間的增加，腫脹程度逐漸減輕；與對照組相比，AGA 組大鼠各時(shí)間點(diǎn)關(guān)節(jié)腫脹程度顯著提高（P＜0.05）；與AGA 組相比，秋水仙堿組、TGP-L組、TGP-M組和TGP-H組各時(shí)間點(diǎn)大鼠關(guān)節(jié)腫脹程度顯著降低，存在TGP 劑量依賴性（P＜0.05）；與秋水仙堿組相比，TGP-H 組各時(shí)間點(diǎn)大鼠關(guān)節(jié)腫脹程度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖1。

圖1 TGP對AGA大鼠關(guān)節(jié)腫脹的影響Fig.1 Effect of TGP on joint swelling in AGA rats

2.4 大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織病理學(xué)觀察 對照組大鼠關(guān)節(jié)滑膜結(jié)構(gòu)正常，無炎癥細(xì)胞浸潤現(xiàn)象發(fā)生；AGA 組滑膜水腫、充血、增生現(xiàn)象明顯，炎癥細(xì)胞浸潤嚴(yán)重；秋水仙堿組、TGP-L 組、TGP-M 組和TGP-H組滑膜水腫、增生現(xiàn)象減輕，炎癥細(xì)胞浸潤程度得到改善，見圖2。

圖2 大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織病理學(xué)觀察（HE，×200）Fig.2 Histopathological observation of synovium of ankle joint in rats （HE， ×200）

2.5 TGP 對AGA 大鼠膝關(guān)節(jié)腔沖洗液炎癥因子 水平的影響 與對照組相比，AGA 組大鼠關(guān)節(jié)腔沖洗 液中TNF-α、IL-6 和IL-1β 水 平顯 著 升 高（P＜0.05）；與AGA組相比，秋水仙堿組、TGP-L組、TGP-M組和TGP-H 組TNF-α、IL-6 和IL-1β 水平顯著降低，存在TGP 劑量依賴性（P＜0.05）；與秋水仙堿組相比，TGP-H 組TNF-α、IL-6 和IL-1β 水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

表2 TGP 對AGA 大鼠膝關(guān)節(jié)腔沖洗液炎癥因子水平的 影響（±s，n=5，ng/L）Tab.2 Effect of TGP on inflammatory factors in knee joint irrigation fluid of AGA rats （±s，n=5，ng/L）

表2 TGP 對AGA 大鼠膝關(guān)節(jié)腔沖洗液炎癥因子水平的 影響（±s，n=5，ng/L）Tab.2 Effect of TGP on inflammatory factors in knee joint irrigation fluid of AGA rats （±s，n=5，ng/L）

Note：Compared with control group， 1）P＜0.05； compared with AGA group， 2）P＜0.05； compared with TGP-L group， 3）P＜0.05； compared with TGP-M group， 4）P＜0.05.

2.6 TGP 對AGA 大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織NF-κB/NLRP3通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與對照組相比，AGA 組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織p-NF-κB p65/NF-κB p65、NLRP3、Caspase-1 表達(dá)顯著增加，而p-IκBα/IκBα 表達(dá)顯著降低（P＜0.05）；與AGA 組相比，秋水仙堿組、TGP-L組、TGP-M 組和TGP-H 組p-NF-κB p65/NF-κB p65、NLRP3、Caspase-1 表達(dá)顯著降低，p-IκBα/IκBα 表達(dá)顯著增加，存在TGP劑量依賴性（P＜0.05）；與秋水仙堿組相比，TGP-H組p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-IκBα/IκBα、NLRP3、Caspase-1 表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表3、圖3。

表3 TGP 對AGA 大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織NF-κB/NLRP3 通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（±s，n=5）Tab.3 Effect of TGP on expression of NF-κB/NLRP3 pathway related proteins in synovial tissue of AGA rats （±s，n=5）

表3 TGP 對AGA 大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織NF-κB/NLRP3 通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（±s，n=5）Tab.3 Effect of TGP on expression of NF-κB/NLRP3 pathway related proteins in synovial tissue of AGA rats （±s，n=5）

Note：Compared with control group， 1）P＜0.05； compared with AGA group， 2）P＜0.05； compared with TGP-L group， 3）P＜0.05； compared with TGP-M group， 4）P＜0.05.

Caspase-1/β-actin 0.53±0.10 1.51±0.281）0.56±0.112）1.26±0.212）0.89±0.152）3）0.57±0.092）3）4）Groups Control AGA Colchicine TGP-L TGP-M TGP-H p-NF-κB p65/NF-κB p65 0.49±0.10 1.58±0.341）0.58±0.112）1.30±0.212）0.96±0.182）3）0.60±0.132）3）4）p-IκBα/IκBα 1.66±0.36 0.63±0.121）1.41±0.232）0.81±0.122）1.15±0.182）3）1.40±0.242）3）4）NLRP3/β-actin 0.70±0.12 1.45±0.241）0.78±0.142）1.24±0.212）1.01±0.192）3）0.80±0.162）3）4）

圖3 TGP 對AGA 大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織NF-κB/NLRP3 通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.3 Effect of TGP on expressions of NF-κB/NLRP3 pathway related proteins in synovial tissue of AGA rats way

3 討論

AGA 是一種在男性中較為常見的炎癥性關(guān)節(jié)炎，由高尿酸血癥及MSU 晶體在關(guān)節(jié)和關(guān)節(jié)周圍組織沉積所引起，且高尿酸血癥作為AGA 發(fā)生的最主要因素，與心血管疾病、慢性腎臟病等多種合并癥相關(guān)［6-12］。降低炎癥反應(yīng)是AGA 臨床治療的主要目的，目前用于治療AGA 的常用藥物秋水仙堿和非甾體抗炎藥療效有限，且長期使用可導(dǎo)致胃腸道出血、腎毒性等副作用［6-12］。由于天然中草藥植物來源廣泛、療效好、副作用少，越來越多的研究人員將注意力逐漸集中到對其活性成分的研究中，以期尋找到有效替代藥物，提高療效，減少副作用發(fā)生［6］。

TGP作為白芍活性成分，具有鎮(zhèn)痛、抗炎和免疫調(diào)節(jié)的作用，已被用于多種免疫性疾病的治療［13］。TGP 通過抑制Ⅱ型膠原所誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型小鼠STAT3信號通路抑制骨質(zhì)破壞［13］。TGP在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠中可能通過下調(diào)Toll 樣受體-2（Toll-like receptor-2，TLR-2）/TNF受體關(guān)聯(lián)因子6（TNF receptor associated factor 6，TRAF6）/NF-κB 通路及調(diào)節(jié)T 細(xì)胞亞群發(fā)揮抗炎作用［14］。定痛湯合白芍總苷膠囊在痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎中臨床療效甚佳，可縮短病程，改善疾病癥狀［15］。還有研究發(fā)現(xiàn)，TGP 可降低AGA 大鼠血清中TNF-α、IL-6 及IL-1β 水平，抑制炎癥反應(yīng)［5］。本研究發(fā)現(xiàn)，TGP 不僅可改善關(guān)節(jié)腫脹、跛行、皮毛無光澤、精神倦怠等癥狀，還可顯著降低AGA 大鼠步態(tài)級別、關(guān)節(jié)炎癥指數(shù)、關(guān)節(jié)腫脹程度、組織病理學(xué)程度，該結(jié)果表明，TGP 對AGA 大鼠不良癥狀及關(guān)節(jié)病理學(xué)程度具有改善作用。本研究還發(fā)現(xiàn)TGP 可顯著降低TNF-α、IL-6、IL-1β 表達(dá)水平，與既往研究結(jié)果相一致，該結(jié)果表明，TGP 可有效抑制AGA大鼠關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)。

NF-κB 是炎癥和能量衰竭的中介，控制促炎因子的產(chǎn)生［1］。IκBα 是NF-κB 抑制劑，在正常狀態(tài)下，NF-κB 與IκBα 在胞質(zhì)中相互結(jié)合，當(dāng)炎癥發(fā)生時(shí)，IκBα 快速降解并與NF-κB 分離，NF-κB 轉(zhuǎn)位至胞核內(nèi)調(diào)節(jié)促炎因子的轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)NLRP3 信號通路的激活［1］。NLRP3 是MSU 晶體所誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵因素，因此，阻斷其激活或影響其活性可抑制AGA的發(fā)生［6-16］。當(dāng)MSU晶體在關(guān)節(jié)腔內(nèi)沉積后，會引發(fā)強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)，激活NLRP3 炎癥小體和Caspase-1，刺激IL-1β 等炎癥體依賴性細(xì)胞因子的釋放，從而進(jìn)一步激活免疫細(xì)胞釋放TNF-α、IL-6 等其他促炎癥細(xì)胞因子，加重炎癥反應(yīng)［17-18］。NF-κB 信號通路及NLRP3 炎癥體軸在AGA 中被激活［19］。研究發(fā)現(xiàn)，TGP可通過抑制人肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1（metastasis associated in lung denocarcinoma transcript 1），MALAT1/微小RNA 876-5p（microRNA 876-5p，miR-876-5p/NLRP3 抑制MSU 誘導(dǎo)的THP-1巨噬細(xì)胞炎癥［7］。本研究發(fā)現(xiàn)TGP 可顯著降低 p-NF-κB p65/NF-κB p65、NLRP3 和Caspase-1 水平，顯著提高p-IκBα/IκBα 水平。該結(jié)果表明，TGP 可能通過抑制NF-κB/NLRP3 信號通路激活從而降低炎癥因子的表達(dá)，以此抑制AGA大鼠炎癥反應(yīng)。

綜上所述，TGP 可能通過抑制NF-κB/NLRP3 信號通路達(dá)到改善AGA 大鼠炎癥狀態(tài)的效果。本研究為TGP 在AGA 疾病治療機(jī)制中的研究提供參考，但關(guān)于TGP 在AGA 中是否還通過調(diào)控其他通路發(fā)揮治療作用還需進(jìn)一步探究。