劉麗萍 褚福娟 （棗莊市中醫(yī)醫(yī)院藥劑科，棗莊 277000）

系膜增生性腎炎（mesangial proliferative glomerulo nephritis，MesPGN）是一種腎臟疾病，其特征為腎小球系膜細(xì)胞彌漫性增殖、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）積累，可能發(fā)展為腎小球硬化、腎間質(zhì)纖維化和終末期腎臟疾病。MesPGN約占中國(guó)原發(fā)性腎小球腎炎病的60%，是慢性腎臟疾病、慢性腎功能衰竭和尿毒癥的主要原因［1］。研究表明，TGF-β1 誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞增殖和ECM 積累是MesPGN 最重要的病理變化，隨著MesPGN 進(jìn)程中炎癥反應(yīng)發(fā)生，可能進(jìn)一步加重MesPGN［2］。目前MesPGN 療法在臨床實(shí)踐中并不理想［3］。因此，需要開發(fā)一種新的MesPGN 治療策略。近年研究表明，五味子在治療糖尿病腎病和慢性腎炎等疾病中發(fā)揮重要作用［4］。五味子多糖（schisandra chinensis polysaccharide，SCP）作為五味子的主要活性成分，具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗衰老、抗糖尿病和抗炎等功效。最新證據(jù)表明，SCP能夠降低2型糖尿病大鼠血糖，并改善胰島素抵抗，抑制炎癥反應(yīng)［5］。五味子乙素對(duì)糖尿病腎病大鼠腎臟具有保護(hù)作用［6］。但SCP 在MesPGN 中的作用尚不清楚。因此，本研究旨在探究SCP對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞炎癥反應(yīng)和ECM 積累的影響，并探究其潛在機(jī)制，以期為MesPGN治療提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 材料 人腎小球系膜細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)ATCC 細(xì)胞庫(kù)；SCP 購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所；RPMI- 1640 培養(yǎng)液和胎牛血清購(gòu)自天津博奧賽斯生物科技有限公司；IL-6、IL-1β、TNF-α 和MCP-1 ELISA 試劑盒購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；MTT 試劑和二甲基亞砜購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；FN、COL Ⅰ、TLR4、MyD88、NF-κB p65 和p-NF-κB p65 單克隆抗體及二抗購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；SDS-PAGE 凝膠試劑盒購(gòu)自上海碧云天研究所；RNA 提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green qRTPCR試劑盒、BCA蛋白定量檢測(cè)試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑購(gòu)自賽默飛世爾科技有限公司；倒置顯微鏡購(gòu)自日本Olympus 公司；全自動(dòng)酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)MDC公司；二氧化碳培養(yǎng)箱購(gòu)自德國(guó)Binder公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和分組 人腎小球系膜細(xì)胞在含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中37 ℃常規(guī)培養(yǎng)，顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，每2 d更換1次新培養(yǎng)液，細(xì)胞貼壁后傳代。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期腎小球系膜細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照（Con）組、模型（TGF-β1）組、SCP低、中、高濃度（SCP-L、SCP-M、SCP-H）組，TGF-β1組細(xì)胞采用4 ng/ml TGF-β1 干預(yù)48 h，SCP-L、SCP-M、SCP-H 組細(xì)胞分別采用200、400、800 μg/L SCP 干預(yù)48 h，Con組細(xì)胞不做任何處理。

1.2.2 MTT 檢測(cè)細(xì)胞增殖活性 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期腎小球系膜細(xì)胞以1.0×104個(gè)/孔接種至96 孔板，常規(guī)培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁后按1.2.1 分組處理，各組細(xì)胞干預(yù)48 h 后分別向各孔中添加5 mg/ml MTT，繼續(xù)培養(yǎng) 4 h，去培養(yǎng)液，100 μl/孔添加二甲基亞砜，振蕩至沉淀完全溶解，全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm 處各孔吸光度（OD）值。

1.2.3 ELISA 檢測(cè)IL-6、IL-1β、TNF-α 和MCP-1 含量 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期腎小球系膜細(xì)胞以1.0×104個(gè)/孔接種至96 孔板，常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后按照1.2.1分組處理，各組細(xì)胞干預(yù)48 h 后收集上清，IL-6、 IL-1β、TNF-α 和MCP-1 ELISA 試劑盒檢測(cè)上清中 IL-6、IL-1β、TNF-α 和MCP-1 含量，嚴(yán)格參照ELISA試劑盒說明書操作。

1.2.4 qRT-PCR 檢測(cè)FN 和COLⅠmRNA 表達(dá) 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期腎小球系膜細(xì)胞以1.0×104個(gè)/孔接種至 96孔板，常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后按照1.2.1分組處理，干預(yù)48 h 后收集各組細(xì)胞，采用RNA 提取試劑盒分別抽提各組細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用SYBR Green 試劑盒進(jìn)行qRT-PCR 檢測(cè)。反應(yīng)程序：94 ℃ 5 min，40 個(gè)循環(huán)：94 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 20 s。以GAPDH 為內(nèi)參，2-ΔΔCt分別計(jì)算各組細(xì)胞FN 和COLⅠ基因相對(duì)表達(dá)。引物序列為FN F：5'-GATGTCCGAACAGCTATTTACCA-3'，R：5'-CC- TTGCGACTTCAGCCACT-3'；COL ⅠF：5'-GCTCCT- CTTAGGGGCCACT-3'；R：5'-CCACGTCTCACCATTGGGG-3'；GAPDH F：5'-GAATGGGCAGCCGTTAGGAA-3'，R：5'-AAAAGCATCACCCGGAGGAG-3'。

1.2.5 Western blot檢測(cè)FN、COLⅠ、TLR4、MyD88、 p-NF-κB p65 和NF-κB p65 蛋白表達(dá) 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期腎小球系膜細(xì)胞以1.0×104個(gè)/孔接種至96 孔板，常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后按照1.2.1 分組處理，干預(yù)48 h 后收集各組細(xì)胞，裂解后離心，上清即為總蛋白，BCA 試劑盒測(cè)定蛋白含量。沸水浴加熱使蛋白變性，等量蛋白上樣，行SDS-PAG 凝膠電泳，蛋白分離后轉(zhuǎn)至PVDF 膜，封阻1.5 h，洗膜，浸入1∶800 稀釋的FN、COLⅠ、TLR4、MyD88、p-NF-κB p65和NF-κB p65一抗中4 ℃搖床過夜孵育，洗膜，浸入1∶2 000稀釋的二抗中孵育2 h，ECL 顯影，成像系統(tǒng)獲取圖像，以GAPDH 為內(nèi)參，采用Image J 軟件分析條帶灰度值，分別計(jì)算各組細(xì)胞FN、COLⅠ、TLR4、MyD88、 p-NF-κB p65和NF-κB p65表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SCP 對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞增殖的影響 各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h 后，MTT 檢測(cè)細(xì)胞增殖活性，結(jié)果顯示，與Con 組相比，TGF-β1 組細(xì)胞增殖活性顯著升高（P＜0.05）；與TGF-β1 組相比，隨著SCP濃度升高，細(xì)胞增殖活性依次降低（P＜0.05，表1）。

表1 各組腎小球系膜細(xì)胞增殖活性比較（±s，n=3）Tab.1 Comparison of proliferation activity of glomerular mesangial cells in each group （±s，n=3）

表1 各組腎小球系膜細(xì)胞增殖活性比較（±s，n=3）Tab.1 Comparison of proliferation activity of glomerular mesangial cells in each group （±s，n=3）

Note：Compared with Con group， 1）P＜0.05； compared with TGF-β1 group， 2）P＜0.05.

2.2 SCP 對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的影響 各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h 后，ELISA 檢測(cè)炎癥因子表達(dá)，結(jié)果顯示，與Con 組相比，TGF-β1 組炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α 和MCP-1 含量明顯升高（P＜0.05）；與TGF-β1 組相比，隨著SCP 濃度升高，炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α 和MCP-1 含量逐漸降低（P＜0.05，表2）。

表2 各組炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α和MCP-1含量比較（±s，n=3， pg/ml）Tab.2 Comparison of levels of inflammatory factors IL-6， IL-1β， TNF-α and MCP-1 in each group （±s， n=3， pg/ml）

表2 各組炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α和MCP-1含量比較（±s，n=3， pg/ml）Tab.2 Comparison of levels of inflammatory factors IL-6， IL-1β， TNF-α and MCP-1 in each group （±s， n=3， pg/ml）

Note：Compared with Con group， 1）P＜0.05； compared with TGF-β1 group， 2）P＜0.05.

2.3 SCP 對(duì)TGF-β1 誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞FN 和COLⅠ mRNA 表達(dá)的影響 各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h 后，qRT-PCR 檢測(cè)細(xì)胞外基質(zhì)成分FN 和COLⅠ mRNA表達(dá)，結(jié)果顯示，與Con 組相比，TGF-β1 組細(xì)胞FN和COLⅠ mRNA表達(dá)均明顯升高（P＜0.05）；與TGF-β1組相比，隨著SCP 濃度升高，F(xiàn)N 和COLⅠ mRNA 表達(dá)逐漸降低（P＜0.05，表3）。

表3 各組細(xì)胞FN和COLⅠ mRNA表達(dá)比較（±s，n=3）Tab.3 Comparison of expressions of FN and COL Ⅰ mRNA in each group of cells （±s，n=3）

表3 各組細(xì)胞FN和COLⅠ mRNA表達(dá)比較（±s，n=3）Tab.3 Comparison of expressions of FN and COL Ⅰ mRNA in each group of cells （±s，n=3）

Note：Compared with Con group， 1）P＜0.05； compared with TGF-β1 group， 2）P＜0.05.

2.4 SCP 對(duì)TGF-β1 誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞FN 和COLⅠ蛋白表達(dá)的影響 各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h 后，采用Western blot 檢測(cè)細(xì)胞外基質(zhì)成分FN 和COLⅠ蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，與Con 組相比，TGF-β1 組細(xì)胞FN和COLⅠ蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.05）；與TGF-β1組相比，隨著SCP 濃度升高，細(xì)胞FN 和COLⅠ蛋白表達(dá)逐漸降低（P＜0.05，圖1、表4）。

圖1 Western blot檢測(cè)ECM成分中FN和COLⅠ蛋白表達(dá)Fig.1 Western blot detection of expressions of ECM components FN and COLⅠ protein

表4 各組細(xì)胞中FN和COLⅠ蛋白表達(dá)比較（±s，n=3）Tab.4 Comparison of FN and COL Ⅰ protein expressions in cells of each group （±s，n=3）

表4 各組細(xì)胞中FN和COLⅠ蛋白表達(dá)比較（±s，n=3）Tab.4 Comparison of FN and COL Ⅰ protein expressions in cells of each group （±s，n=3）

Note：Compared with Con group， 1）P＜0.05； compared with TGF-β1 group， 2）P＜0.05.

2.5 SCP 對(duì)TGF-β1 誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞TLR4/NF-κB 信號(hào)通路的影響 各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h 后，Western blot 檢測(cè)細(xì)胞TLR4/NF-κB 信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，與Con 組相比，TGF-β1 組細(xì)胞TLR4、MyD88 和p-NF-κB p65 蛋白表達(dá)明顯升高 （P＜0.05）；與TGF-β1 組相比，隨著SCP 濃度升高，細(xì)胞TLR4、MyD88 和p-NF-κB p65 蛋白表達(dá)逐漸降低（P＜0.05，圖2、表5）。

圖2 Western blot 檢 測(cè)TLR4、MyD88、p-NF-κB p65 和 NF-κB p65蛋白表達(dá)Fig.2 Western blot detection of TLR4，MyD88，p-NF-κB p65 and NF-κB p65 protein expressions

表5 各組細(xì)胞TLR4、MyD88、p-NF-κB p65 和NF-κB p65蛋白表達(dá)比較（±s，n=3）Tab.5 Comparison of TLR4， MyD88， p-NF-κB p65 and NF-κB p65 protein expressions in each group of cells （±s，n=3）

表5 各組細(xì)胞TLR4、MyD88、p-NF-κB p65 和NF-κB p65蛋白表達(dá)比較（±s，n=3）Tab.5 Comparison of TLR4， MyD88， p-NF-κB p65 and NF-κB p65 protein expressions in each group of cells （±s，n=3）

Note：Compared with Con group， 1）P＜0.05； compared with TGF-β1 group， 2）P＜0.05.

3 討論

MesPGN 是一種常見腎臟疾病，我國(guó)20%～40%MesPGN 患者已發(fā)展為終末期腎臟疾?。?］。MesPGN主要病理變化為腎小球膜細(xì)胞增殖、炎癥和ECM 積聚，進(jìn)而損害腎小球功能。腎小球系膜細(xì)胞對(duì)維持正常腎小球結(jié)構(gòu)和功能至關(guān)重要，主要通過提供正確的機(jī)械張力并產(chǎn)生各種細(xì)胞因子發(fā)揮作用，對(duì)調(diào)節(jié)ECM 轉(zhuǎn)換至關(guān)重要［8］。腎小球系膜細(xì)胞和腎小管間質(zhì)ECM 蛋白積累會(huì)增強(qiáng)纖維化，是慢性腎臟疾病的標(biāo)志，也是腎功能不全的主要驅(qū)動(dòng)力。腎功能不全的主要調(diào)節(jié)因子TGF-β1 是由代謝損傷產(chǎn)生的［9］。已有研究采用TGF-β1 誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞構(gòu)建MesPGN 體外細(xì)胞模型，探究MesPGN 的發(fā)生機(jī)制［10］。研究證實(shí)，SCP具有多種生理功能，如抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、保肝、降血脂、抗疲勞、抗糖尿病和降血糖、止咳、鎮(zhèn)痛和抗衰老［11-12］。SCP 無明顯毒性，幾乎無副作用，可作為一種安全有效的補(bǔ)充療法用于多種疾病治療，包括腎臟疾?。?3］。本研究證明SCP 能夠減輕TGF-β1 誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞炎癥反應(yīng)和ECM積累，表明SCP可能成為MesPGN 的潛在治療藥物。

越來越多的證據(jù)表明，腎小球系膜細(xì)胞是一種主要的腎臟駐留細(xì)胞，且與MesPGN 發(fā)生和發(fā)展高度相關(guān)［14］。腎小球系膜細(xì)胞過度增殖是與MesPGN相關(guān)病理生理機(jī)制的主要因素［15］。已有報(bào)道TGF-β1刺激增強(qiáng)腎小球系膜細(xì)胞增殖并最終促進(jìn)腎間質(zhì)纖維化［16］。與既往研究結(jié)論相符，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TGF-β1誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞增殖活性明顯升高，但SCP能夠降低TGF-β1誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞增殖活性。越來越多的證據(jù)表明，腎小球系膜中ECM 過度積累與MesPGN 發(fā)展密切相關(guān)［8］。ECM 由多種細(xì)胞外分子組成，膠原蛋白是其中最豐富的成員。TGF-β1在系膜增生性腎炎腎組織中高表達(dá)，是腎纖維化的關(guān)鍵標(biāo)志物。TGF-β1 可上調(diào)FN 表達(dá)，F(xiàn)N 是ECM 的關(guān)鍵分子，主要在腎纖維化期間合成。大量研究表明，TGF-β1 可能增強(qiáng)COLⅠ和FN 分泌［17-18］。本研究通過檢測(cè)FN 和COLⅠ反映ECM 表達(dá)是基于既往多項(xiàng)研究結(jié)果，如YAN 等［18］發(fā)現(xiàn)球囊導(dǎo)管在血管內(nèi)膜損傷后可引起明顯內(nèi)膜增生，增生性內(nèi)膜COLⅠ和FN表達(dá)增加，說明增生性血管內(nèi)膜ECM 合成增多，進(jìn)一步促進(jìn)了血管平滑肌細(xì)胞增殖和內(nèi)膜增生。LI 等［19］研究顯示，機(jī)械和電聯(lián)合刺激更大程度上促進(jìn)COLⅠ和FN 表達(dá)增強(qiáng)前成骨細(xì)胞ECM 合成。此外，有研究顯示，內(nèi)脂素能夠通過上調(diào)COLⅠ和FN 表達(dá)促進(jìn)腎小球系膜細(xì)胞ECM 表達(dá)［20］。這些研究均采用FN 和COLⅠ表達(dá)表示ECM表達(dá)，因此，本研究同樣采用FN 和COLⅠ表達(dá)體現(xiàn)ECM 表達(dá)。本研究TGF-β1 刺激的腎小球系膜細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)COLⅠ和FN 表達(dá)有明顯上升趨勢(shì)，而SCP能夠有效抑制COLⅠ和FN表達(dá)，表明SCP能夠減少腎小球系膜細(xì)胞中TGF-β1 誘導(dǎo)的ECM 積累。過度的炎癥反應(yīng)和ECM 沉積是MesPGN 的關(guān)鍵致病因素。已有文獻(xiàn)證明，TGF-β1處理可誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞中炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生［21］。與既往研究結(jié)果一致，本實(shí)驗(yàn)觀察到TGF-β1 刺激能夠顯著促進(jìn)腎小球系膜細(xì)胞增殖，促進(jìn)炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α和MCP-1 表達(dá)，且ECM 積累增加。而SCP 能夠有效抑制TGF-β1 誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞增殖，降低炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α 和MCP-1 表達(dá)，減少ECM積累。表明SCP 能夠通過抑制腎小球系膜細(xì)胞增殖、炎癥反應(yīng)和ECM 積累抑制MesPGN 發(fā)生和進(jìn)展。研究表明，通過激活的TLR4/NF-κB 誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞因子表達(dá)，誘發(fā)炎癥反應(yīng)，參與MesPGN 發(fā)病［22-23］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TGF-β1 誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞中TLR4、MyD88 和p-NF-κB p65 表達(dá)明顯升高，而SCP 能夠有效降低TLR4、MyD88 和p-NF-κB p65 表達(dá)。提示SCP 可能通過阻斷TLR4/NF-κB 信號(hào)通路激活抑制TGF-β1 誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞炎癥反應(yīng)和ECM積累。

本研究表明，SCP 能夠抑制TGF-β1誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞增殖、炎癥和ECM 積累，其作用機(jī)制可能與抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路有關(guān)，表明SCP可能成為MesPGN 的潛在治療藥物。但本研究存在一定局限性，未涉及信號(hào)傳導(dǎo)途徑的特異性抑制劑和動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，因此有必要進(jìn)一步研究以了解SCP 在MesPGN 中的作用及機(jī)制。此外，本研究顯示炎癥因子表達(dá)降低，但是短暫抑制還是消除了炎癥反應(yīng)尚不清楚，后續(xù)將對(duì)此進(jìn)行深入探究。