張愛(ài)建 秦紅艷 鄭寶壽 王劍華 （大理大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科，大理 671000）

前列腺癌（prostate cancer， PCa）是男性常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅患者的健康［1-2］。鐵死亡是一種新的受調(diào)控的細(xì)胞死亡形式，其特征在于細(xì)胞內(nèi)亞鐵離子（Fe2+）的產(chǎn)生、活性氧（reactive oxygen species，ROS）的積累和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶4（glutathione peroxidase 4， GPX4）的失活［3］。GPX4 在鐵死亡中起關(guān)鍵作用，是鐵死亡的抑制劑。據(jù)報(bào)道，GPX4 在PCa 中呈高表達(dá)，下調(diào)其表達(dá)可誘導(dǎo)PCa 細(xì)胞 鐵 死 亡［4］。故GPX4 是PCa 的 重 要 調(diào) 控 靶 點(diǎn)。miR-214-3p 是一種在癌癥中被廣泛研究的抑制性miRNA，在PCa 組織中表達(dá)下調(diào)，也是PCa 腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子［5］。研究顯示，GPX4 是miR-214-3p的直接靶標(biāo)［6-7］。然而，PCa 中GPX4 高表達(dá)是否與miR-214-3p表達(dá)降低有關(guān)尚未明確。

環(huán)狀RNA（circRNA）在包括PCa 在內(nèi)的腫瘤發(fā)生中發(fā)揮關(guān)鍵作用［8］。最近的一項(xiàng)研究顯示，circ-ZMIZ1 在PCa 患者中呈高表達(dá)，參與了PCa 的發(fā)生和發(fā)展；敲低circZMIZ1 可抑制PCa 細(xì)胞增殖［9］。通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)網(wǎng)站預(yù)測(cè)circZMIZ1 可能吸附的miRNA，發(fā)現(xiàn)miR-214-3p 是circZMIZ1 的候選靶標(biāo)之一。circZMIZ1 是否可通過(guò)與miR-214-3p 相互作用調(diào)節(jié)PCa 細(xì)胞的鐵死亡仍不清楚。因此，本研究旨 在 探 討PCa 細(xì) 胞 中circZMIZ1、miR-214-3p 和GPX4之間的相互作用和功能關(guān)聯(lián)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 20 只雄性BALB/c 裸鼠（4周齡，體質(zhì)量20 g）購(gòu)自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司［許可證號(hào)：SCXK（魯）20190003］，并飼養(yǎng)在特定的無(wú)病原體環(huán)境中。人正常前列腺上皮細(xì)胞（RWPE-1）購(gòu)自美國(guó)ATCC 細(xì)胞庫(kù)（EY-X0718）；PCa細(xì)胞系（22Rv1、VCaP、PC3 和DU145）購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司（CL-0004、CL-0241、CL-0185、CL-0075）；所有細(xì)胞于37 ℃和5%CO2條件下在含有10%胎牛血清（FBS）、100 U/ml青霉素G和100 μg/ml鏈霉素的RPMI1640 培養(yǎng)基中培養(yǎng)。慢病毒載體由上海GenePharma公司構(gòu)建。

1.1.2 主要試劑與儀器 靶向circZMIZ1 的小分子干擾RNA（si-circZMIZ1）、miR-214-3p mimic、miR-214-3p inhibitor 及其陰性對(duì)照（si-NC、miR-NC、inhibitor-NC）由廣州Ribobio 設(shè)計(jì)和合成；MTT 細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒（M1020）、膜聯(lián)蛋白V（Annexin-V）- FITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（CA1020）購(gòu)自北京Solarbio 公司；乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）（A020-1-2）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）（A003-1-2）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）（A006-2-1）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物技術(shù)研究所；Fe2+檢測(cè)試劑盒（E-BC-K304-S）購(gòu)自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；ROS 檢測(cè)試劑盒（YT290）購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司；Magna RIP 試劑盒（17-700）購(gòu)自Millipore；兔抗人GPX4抗體（ab125066）購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；ABI Prism?7500型熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystems 公司；FACS Calibur流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD Biosciences 公司；IX53/DP80 熒光顯微鏡購(gòu)自日本Olympus 公司；生物素標(biāo)記的野生型或突變型miR-214-3p（Biotin-miR-214-3p-WT 或Biotin-miR-214-3p-MUT）探針由廣州Ribo-Bio合成。

1.2 方法

1.2.1 qRT-PCR 檢測(cè)細(xì)胞circZMIZ1、miR-214-3p和GPX4 表達(dá) 使用Trizol 試劑從RWPE-1 細(xì)胞和PCa 細(xì)胞中提取總RNA，使用cDNA 合成試劑盒將總RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，隨后在ABI Prism?7500 型熒光定量PCR 儀上使用SYBR Green Super Mix 試劑盒進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。熱循環(huán)條件如下：95 ℃ 10 min，95 ℃ 30 s、95 ℃ 15 s、60 ℃ 15 s 的40 個(gè)循環(huán)。引物序列見表1。GAPDH 為circZMIZ1 和GPX4 mRNA表達(dá)水平標(biāo)準(zhǔn)化的內(nèi)部對(duì)照，U6為miR-214-3p表達(dá)水平標(biāo)準(zhǔn)化的內(nèi)部對(duì)照，使用2-ΔΔCt方法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

表1 qRT-PCR引物Tab.1 qRT-PCR primers

1.2.2 Western blot 檢測(cè)細(xì)胞GPX4 蛋白表達(dá) 使用含有蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解緩沖液提取RWPE-1 細(xì)胞和PCa 細(xì)胞總蛋白，BCA 蛋白測(cè)定試劑測(cè)定蛋白濃度。SDS-PAGE 凝膠電泳分離等量蛋白樣品（40 μg）并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜。將膜用5%脫脂牛奶封閉1 h 后，與一抗GPX4 和GAPDH （1∶1 000）在4 ℃下孵育過(guò)夜，然后將膜與適當(dāng)?shù)腍RP偶聯(lián)二抗在室溫下孵育1 h。通過(guò)電化學(xué)發(fā)光試劑觀察免疫反應(yīng)條帶。Image J 軟件測(cè)定蛋白條帶的灰度值，目的蛋白與GAPDH 灰度值的比值用于統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.3 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè) 使用StarBase數(shù)據(jù)庫(kù)（https://starbase.sysu.edu.cn/index.php）預(yù)測(cè)miR-214-3p 與circZMIZ1 和GPX4 之間的結(jié)合位點(diǎn)。circZMIZ1 和GPX4 mRNA 的部分序列（包含與miR-214-3p 的互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)）通過(guò)PCR 擴(kuò)增并克隆到pmirGLO 載體中，這些野生型報(bào)告質(zhì)粒被稱為WT-circZMIZ1 和WT-GPX4。此外，將circZMIZ1 和GPX4 mRNA 中的突變序列構(gòu)建到pmirGLO 載體中以產(chǎn)生MUT-circZMIZ1 和MUT-GPX4。對(duì)于熒光素酶活性測(cè)定，將PC3 細(xì)胞以1×105個(gè)/孔的密度接種至24孔板，使用Lipofectamine 3000將這些熒光素酶重組質(zhì)粒與miR-214-3p mimic 或?qū)φ眨╩iR-NC）共轉(zhuǎn)染至PC3 細(xì)胞。37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)48 h后，使用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)螢火蟲熒光素酶活性，并將其標(biāo)準(zhǔn)化為海腎熒光素酶活性。

1.2.4 RNA pull-down 分析 將PC3 細(xì)胞在含有RNase 抑制劑的裂解緩沖液中裂解。將細(xì)胞裂解物（2 μg）與100 pmol Biotin-miR-214-3p-WT 或BiotinmiR-214-3p-MUT 共同孵育2 h。將鏈霉親和素瓊脂糖珠加入反應(yīng)體系中，室溫孵育1 h。隨后，在裂解緩沖液中洗滌糖珠，與糖珠結(jié)合的RNA 被捕獲并用Trizol提取，應(yīng)用qRT-PCR檢測(cè)circZMIZ1水平。

1.2.5 RNA 結(jié)合蛋白免疫沉淀（RNA binding protein immunoprecipitation，RIP）檢測(cè) 采用含有RNase抑制劑的RIPA緩沖液裂解細(xì)胞。將含有Argonaute-2抗體（Ago2）或免疫球蛋白G 抗體（IgG）的瓊脂糖珠與細(xì)胞裂解物在4 ℃下孵育過(guò)夜。然后，將糖珠洗滌并與蛋白酶K 共同孵育以去除蛋白質(zhì)。最后，提取免疫沉淀的RNA，并通過(guò)qRT-PCR 檢測(cè)circ-ZMIZ1和miR-214-3p的富集。

1.2.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將PC3 細(xì)胞接種至6 孔板（1×105個(gè)/孔）并培養(yǎng)過(guò)夜。使用Lipofectamine 3000 試劑 將si-NC、si-circZMIZ1、inhibitor-NC、miR-214-3p inhibitor 轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。實(shí)驗(yàn)分為：對(duì)照組（NC 組，無(wú)轉(zhuǎn)染）、si-NC 組（轉(zhuǎn)染si-circZMIZ1 陰性對(duì)照si-NC）、si-circZMIZ1 組（轉(zhuǎn)染si-circZMIZ1）、si-circ-ZMIZ1+anti-NC 組（si-circZMIZ1 和miR-214-3p inhibitor 陰性對(duì)照inhibitor-NC 共轉(zhuǎn)染）、si-circZMIZ1+anti-miR-214-3p 組（si-circZMIZ1 和miR-214-3p inhibitor 共轉(zhuǎn)染）。轉(zhuǎn)染6 h，繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后，收集細(xì)胞，qRT-PCR 檢測(cè)細(xì)胞中circZMIZ1、miR-214-3p 和GPX4 mRNA 的表達(dá)水平，并采用Western blot 檢測(cè)細(xì)胞中GPX4蛋白表達(dá)。

1.2.7 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性 將轉(zhuǎn)染48 h 后的各組PC3細(xì)胞以5×103個(gè)/孔接種至96孔板。培養(yǎng)24 h、48 h 和72 h 后，向培養(yǎng)基中加入10 μl MTT 溶液（5 mg/ml），置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。隨后，以100 μl/孔加入DMSO 溶解甲臜產(chǎn)物。采用酶標(biāo)儀檢測(cè)570 nm處的吸光度值。

1.2.8 LDH 活性檢測(cè) 在6 孔板的每孔中接種 1×105個(gè)細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h 后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液并與反應(yīng)混合物混合。孵育30 min 后，在440 nm 處測(cè)量吸光度（A）評(píng)估LDH水平。

1.2.9 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將轉(zhuǎn)染48 h 后的細(xì)胞用胰蛋白酶化消化、離心并重懸于500 μl 1×結(jié)合緩沖液中（5×105個(gè)），將細(xì)胞在黑暗中采用 5 μl Annexin-V-FITC 和5 μl PI 染色15 min 后，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡率為細(xì)胞早期凋亡（Annexin V+PI-）和晚期凋亡（Annexin V+PI-）的百分比總和。

1.2.10 Fe2+含量和MDA、GSH水平測(cè)定 使用Fe2+檢測(cè)試劑盒測(cè)定細(xì)胞內(nèi)Fe2+水平。收集轉(zhuǎn)染48 h 后的各組細(xì)胞并采用PBS 洗滌2 次，隨后采用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞。在4 ℃下以13 000 g離心10 min，棄去沉淀物，收集上清液。將上清液與鐵還原劑在室溫下孵育30 min 后，與鐵探針混合并在室溫下孵育1 h。使用酶標(biāo)儀在593 nm 波長(zhǎng)處測(cè)量吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算Fe2+濃度。應(yīng)用MDA、GSH 測(cè)定試劑盒檢測(cè)上清液中MDA含量和細(xì)胞內(nèi)GSH水平。

1.2.11 ROS 活性測(cè)定 將細(xì)胞接種至6 孔板，轉(zhuǎn)染培養(yǎng)48 h 后，除去原培養(yǎng)基，將細(xì)胞在培養(yǎng)箱中用含10 μmol/L DCFH-DA 染料的新鮮培養(yǎng)基在37 ℃下避光染色30 min。收集細(xì)胞，洗滌并懸浮在PBS中，使用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。

1.2.12 裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn) 20只雄性BALB/c裸鼠分為si-NC 組、si-circZMIZ1 組、si-circZMIZ1+anti-NC 組和si-circZMIZ1+anti-miR-214-3p組（每組5只）。si-circ-ZMIZ1、miR-214-3p inhibitor 或si-NC、inhibitor-NC 分別通過(guò)慢病毒載體轉(zhuǎn)染PC3細(xì)胞獲得穩(wěn)定表達(dá)。隨后，BALB/c 裸鼠皮下注射轉(zhuǎn)染后的PC3 細(xì)胞懸液（2×106個(gè)/200 μl）。接種后每周使用游標(biāo)卡尺評(píng)估腫瘤體積（V=1/2×a×b2，a：腫瘤長(zhǎng)度；b：腫瘤寬度）； 4 周后，處死裸鼠，收獲腫瘤組織，立即測(cè)量腫瘤重量。將腫瘤組織分為兩部分，一部分用4%多聚甲醛固定、石蠟包埋，用于免疫組織化學(xué)（immunohistochemistry，IHC）染色；另一部分-80 ℃冰箱保存，采用qRT-PCR檢測(cè)circZMIZ1、miR-214-3p和GPX4的表達(dá)。

1.2.13 IHC 染 色 檢 測(cè)腫瘤組織Ki-67 和GPX4 的表達(dá) 取4%多聚甲醛固定的腫瘤組織，石蠟包埋， 切成4 μm 切片。將切片在4 ℃下與一抗Ki-67 （1∶100）和GPX4（1∶100）共同孵育過(guò)夜。然后，加入二抗（1∶200）在室溫下孵育30 min。DAB顯色，蘇木精復(fù)染1 min。封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察Ki-67和GPX4 的陽(yáng)性表達(dá)，并用Image-Pro Plus 6.0 軟件計(jì)算平均光密度（mean optical density，MOD）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用GraphPad Prism 8.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以±s表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 circZMIZ1、miR-214-3p 和GPX4 在PCa 細(xì)胞中的表達(dá)水平 與RWPE-1 細(xì)胞相比，PCa 細(xì)胞系（22Rv1、VCaP、PC3 和DU145）中circZMIZ1、GPX4 mRNA和GPX4蛋白水平顯著升高，miR-214-3p水平顯著降低（P＜0.05）；其中，PC3 細(xì)胞中circZMIZ1、GPX4 mRNA 和GPX4 蛋白水平明顯高于其他細(xì)胞系，miR-214-3p 水平明顯低于其他細(xì)胞系，故選擇PC3細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見圖1。

圖1 不同PCa 細(xì)胞中circZMIZ1、miR-214-3p 和GPX4 水平比較Fig.1 Comparison of circZMIZ1， miR-214-3p and GPX4 levels in different PCa cells

2.2 circZMIZ1、miR-214-3p 和GPX4 的調(diào)控關(guān)系驗(yàn)證 StarBase數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)了circZMIZ1和miR-214-3p的靶向結(jié)合序列（圖2A）。雙熒光素酶檢測(cè)結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染miR-NC 相比，轉(zhuǎn)染miR-214-3p mimic后，含有WT-circZMIZ1 質(zhì)粒細(xì)胞的熒光素酶活性顯著降低（P＜0.05），而含有MUT-circZMIZ1 質(zhì)粒細(xì)胞的熒光素酶活性無(wú)顯著變化（P＞0.05，圖2B）。RNA pull-down 結(jié)果顯示，circZMIZ1 被生物素標(biāo)記的miR-214-3p（Biotin-miR-214-3p-WT）拉下，而不是突變體Biotin-miR-214-3p-MUT（圖2C）。RIP測(cè)定結(jié)果顯示，相對(duì)于IgG 對(duì)照組，circZMIZ1 和miR-214-3p在Ago2 免疫沉淀中顯著富集（P＜0.05，圖2D）。此外，StarBase 數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)顯示GPX4 的3'UTR 包含miR-214-3p 的可能結(jié)合位點(diǎn)（圖2E）。雙熒光素酶檢測(cè)結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染miR-NC 相比，轉(zhuǎn)染miR-214-3p mimic 后，含有WT-GPX4 質(zhì)粒細(xì)胞的熒光素酶活性顯著降低（P＜0.05），而含有MUT-GPX4 質(zhì)粒細(xì)胞的熒光素酶活性無(wú)顯著變化（P＞0.05，圖2F）。qRTPCR 和Western blot 結(jié)果顯示，與NC 組相比，si-circ-ZMIZ1 組circZMIZ1、GPX4 mRNA 和GPX4 蛋白水平顯著降低，miR-214-3p 水平顯著升高（P＜0.05）；與si-circZMIZ1 組、si-circZMIZ1+anti-NC 組相比，si-circZMIZ1+anti-miR-214-3p 組GPX4 mRNA 和GPX4 蛋白水平顯著升高，miR-214-3p 水平顯著降低（P＜0.05，圖2G～K）。

圖2 circZMIZ1、miR-214-3p和GPX4的調(diào)控關(guān)系驗(yàn)證Fig.2 Verification of regulatory relationship of circ-ZMIZ1， miR-214-3p and GPX4

2.3 敲低circZMIZ1對(duì)PC3細(xì)胞的影響 MTT結(jié)果顯示，在48 h、72 h 時(shí)，與NC 組相比，si-circZMIZ1 組PC3 細(xì)胞增殖活性顯著降低（P＜0.05）；與si-circ-ZMIZ1組、si-circZMIZ1+anti-NC組相比，si-circZMIZ1+anti-miR-214-3p 組PC3 細(xì)胞增殖活性顯著升高（P＜0.05，圖3A）。與NC 組相比，si-circZMIZ1 組PC3 細(xì)胞培養(yǎng)上清液中LDH 水平顯著升高（P＜0.05）；與si-circZMIZ1組、si-circZMIZ1+anti-NC組相比，si-circ-ZMIZ1+anti-miR-214-3p 組LDH 水平顯著降低（P＜0.05，圖3B）。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與NC 組相比，si-circZMIZ1組PC3細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.05）；與si-circZMIZ1 組、si-circZMIZ1+anti-NC 組相比，sicircZMIZ1+anti-miR-214-3p 組細(xì)胞凋亡率顯著降低（P＜0.05，圖3C、3D）。此外，與NC 組相比，si-circ-ZMIZ1 組Fe2+含量和MDA、ROS 水平顯著升高，GSH水平顯著降低（P＜0.05）；與si-circZMIZ1 組、si-circ-ZMIZ1+anti-NC 組相比，si-circZMIZ1+anti-miR-214-3p 組Fe2+含量和MDA、ROS 水平顯著降低，GSH 水平顯著升高（P＜0.05，圖3E～I(xiàn)）。

圖3 敲低circZMIZ1對(duì)PC3細(xì)胞的影響Fig.3 Effect of circZMIZ1 knockdown on PC3 cells

2.4 敲低circZMIZ1 對(duì)裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的影響 與si-NC 組相比，si-circZMIZ1 組腫瘤體積和重量顯著降低（P＜0.05）；與si-circZMIZ1 組、si-circZMIZ1+anti-NC 組相比，si-circZMIZ1+anti-miR-214-3p 組腫瘤體積和重量顯著升高（P＜0.05，圖4A、4B）。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，與si-NC 組相比，si-circ-ZMIZ1 組腫瘤組織中Ki-67 和GPX4 陽(yáng)性表達(dá)顯著降低（P＜0.05）；與si-circZMIZ1 組、si-circZMIZ1+anti-NC 組相比，si-circZMIZ1+anti-miR-214-3p 組腫瘤組織中Ki-67 和GPX4 陽(yáng)性表達(dá)顯著升高（P＜0.05，圖4C、4D）。qRT-PCR結(jié)果顯示，與si-NC組相比，sicircZMIZ1 組腫瘤組織中circZMIZ1 和GPX4 mRNA水平顯著降低，miR-214-3p 水平顯著升高（P＜0.05）；與si-circZMIZ1 組、si-circZMIZ1+anti-NC 組相比，si-circZMIZ1+anti-miR-214-3p 組腫瘤組織中GPX4 mRNA水平顯著升高，miR-214-3p水平顯著降低（P＜0.05，圖4E）。

圖4 敲低circZMIZ1對(duì)裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的影響Fig.4 Effect of circZMIZ1 knockdown on tumor growth in nude mice

3 討論

鐵死亡是一種細(xì)胞死亡形式，其特征在于細(xì)胞中鐵依賴性脂質(zhì)過(guò)氧化物的積累。引發(fā)鐵死亡已成為一種有前途的癌癥治療策略，包括PCa［4，10］。circRNA 是通過(guò)選擇性剪接從其親本線性RNA衍生而來(lái)的閉合環(huán)狀RNA。由于其高穩(wěn)定性和對(duì)RNase的抗性，circRNA 成為早期診斷和治療多種癌癥的理想生物標(biāo)志物。最近的研究表明，circRNA 可調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞中的鐵死亡［11］。據(jù)報(bào)道，circZMIZ1 在PCa 中上調(diào)，敲低其表達(dá)可抑制PCa 細(xì)胞增殖并導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯［9］。在本研究中，circZMIZ1 在PCa細(xì)胞系中的表達(dá)明顯高于人正常前列腺上皮細(xì)胞，敲低circZMIZ1 可降低PCa 細(xì)胞活力和體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)，并誘導(dǎo)PCa 細(xì)胞凋亡，與既往研究一致。表明circZMIZ1 可能在PCa 進(jìn)展中發(fā)揮重要作用，但其對(duì)PCa鐵死亡的作用仍不清楚。

circRNA 通過(guò)作為miRNA 海綿調(diào)控miRNA 介導(dǎo)的靶mRNA 表達(dá)［12］。為了研究circZMIZ1 介導(dǎo)的PCa 發(fā)生發(fā)展的潛在機(jī)制，通過(guò)生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)探索了circZMIZ1 介導(dǎo)的競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源性RNA 網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)miR-214-3p 是circZMIZ1 的候選靶標(biāo)之一。miR-214-3p 已被證實(shí)是PCa 的腫瘤抑制因子［5］。與既往的研究一致，在本研究中miR-214-3p 在PCa 細(xì)胞系中呈低表達(dá)。由于miR-214-3p 與circZMIZ1 在PCa 中的表達(dá)趨勢(shì)相反及其在多種癌癥中的抑癌作用，因此選擇miR-214-3p 進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因分析、RNA pull-down 實(shí)驗(yàn)和RIP實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-214-3p 與circZMIZ1 在PCa 細(xì)胞中的直接靶標(biāo)相互作用。隨后，通過(guò)使用qRT-PCR 分析circZMIZ1 敲低對(duì)miR-214-3p 的影響，結(jié)果顯示， circZMIZ1 敲低可升高miR-214-3p 表達(dá)，且下調(diào)miR-214-3p 可明顯減弱circZMIZ1 敲低對(duì)PCa 細(xì)胞增殖和體內(nèi)移植瘤生長(zhǎng)的抑制作用和凋亡的促進(jìn)作用。提示，circZMIZ1通過(guò)海綿化下調(diào)miR-214-3p表達(dá)促進(jìn)PCa進(jìn)展。

此外，GPX4 是miR-214-3p 的靶標(biāo)。HE 等［6］的研究顯示，上調(diào)miR-214-3p 可抑制GPX4 表達(dá)，進(jìn)而抑制肝癌細(xì)胞的活力并誘導(dǎo)鐵死亡。在本研究中，生物信息學(xué)分析揭示了miR-214-3p 與GPX4 mRNA的3'UTR 之間的潛在相互作用，雙熒光素酶報(bào)告基因測(cè)定隨后驗(yàn)證了miR-214-3p 和GPX4 在PCa 細(xì)胞中的直接相互作用。qRT-PCR 和Western blot 檢測(cè)人PCa 細(xì)胞系中GPX4 的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)GPX4 的mRNA和蛋白水平在PCa 細(xì)胞中呈高表達(dá)，與PCa 中miR-214-3p的表達(dá)趨勢(shì)相反，與circZMIZ1的表達(dá)趨勢(shì)一致。作為鐵死亡的關(guān)鍵抑制劑，GPX4 與GSH 相互作用以減少生物膜內(nèi)的過(guò)氧化物酶反應(yīng)，從而抑制脂質(zhì)ROS 的積累和鐵死亡的激活［13］。鐵死亡誘導(dǎo)的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞可導(dǎo)致細(xì)胞外釋放LDH。在本研究中，細(xì)胞死亡生物標(biāo)志物L(fēng)DH 水平升高證實(shí)了circZMIZ1 敲低后誘導(dǎo)的細(xì)胞鐵死亡。鐵死亡的獨(dú)特生化特征包括積累的亞鐵和脂質(zhì)ROS。因此，本研究評(píng)估了Fe2+、ROS 和脂質(zhì)過(guò)氧化MDA 的積累，結(jié)果顯示，circZMIZ1 敲低在上調(diào)miR-214-3p 表達(dá)，降低GPX4 表達(dá)的同時(shí)增加了Fe2+和MDA、ROS 的產(chǎn)生，降低了GSH 水平；且下調(diào)miR-214-3p 可明顯升高GPX4 表達(dá)，降低了circZMIZ1 敲低誘導(dǎo)的鐵沉積和ROS、MDA 水平。以上提示，circZMIZ1 敲低可能通過(guò)miR-214-3p/GPX4 軸在PCa 細(xì)胞中引發(fā)鐵死亡。

綜上所述，敲低circZMIZ1 可能通過(guò)miR-214-3p/GPX4 軸誘導(dǎo)PCa 細(xì)胞鐵死亡。本研究結(jié)果將為PCa 的治療提供新的見解和靶點(diǎn)。但本研究?jī)H評(píng)估了一種PCa 細(xì)胞系，在未來(lái)的研究中將采用其他PCa細(xì)胞系進(jìn)行驗(yàn)證。