胡運洲 王小軍 張亞奇 崔紅斌 陳 昊 李 剛 （天水市第二人民醫(yī)院，天水 741000）

目前約有40%的結(jié)腸癌患者在以手術(shù)結(jié)合化療、放療的治療策略中無法獲得更加顯著的生存效益，免疫治療作為腫瘤治療的新興策略之一，部分單克隆抗體在結(jié)腸癌的治療中已展現(xiàn)出顯著的生存效益。國外首次通過基因微陣列/RNA 測序驗證了角蛋白17（keratin 17，KRT17）可作為結(jié)腸癌穩(wěn)健的預(yù)后生物標志物，在現(xiàn)有的高危因素基礎(chǔ)上提供額外的預(yù)后分層［1］。KRT17是上皮細胞中典型的中間纖維蛋白，其陽性表達的非小細胞肺癌、胃癌、食管鱗癌細胞相較于其他類型的細胞，在增殖、侵襲、預(yù)后及腫瘤細胞其他生物學行為上均表現(xiàn)出高度惡性［2-4］。在結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移、侵襲過程中，KRT17 參與上 皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）過程，協(xié)助釋放促癌因子，參與癌癥的發(fā)生和發(fā)展機制［1］。由此看來，掌握KRT17 在涉及結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展的生物學行為中所介導的潛在機制對結(jié)腸癌的臨床診治具有重要指導價值。然而，針對KRT17 對結(jié)腸癌生物學行為影響的相關(guān)報道仍然較少，以致其難以轉(zhuǎn)化為用于診斷和治療的潛在可靠生物標志物。本研究通過評估不同表達水平的KRT17 對結(jié)腸癌細胞增殖、侵襲、遷移等生物學行為的影響，分析其可能參與結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展?jié)撛诘姆肿訖C制，以期為KRT17 作為結(jié)腸癌的分子標志物提供體外實驗證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織標本、細胞株 在病理標本庫收集2013 年1 月至2015 年12 月于天水市第二人民醫(yī)院行手術(shù)確診的結(jié)腸癌患者癌組織標本及配對癌旁組織（距離癌組織＞5 cm）33例。其中男19例，女14例；年齡42～79歲，中位年齡65歲，≥65歲者22例，＜65歲者11 例；發(fā)病部位左21 例，右12 例；乳頭狀腺癌 7 例，管狀腺癌18 例，其他腺癌8 例；高分化8 例，中分化16例，低分化9例；Dukes分期A/B 期22例，C/D期11 例；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移19 例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移14 例；獲取患者五年生存預(yù)后數(shù)據(jù)，術(shù)后五年出現(xiàn)復發(fā)/轉(zhuǎn)移/死亡為預(yù)后不良，反之為預(yù)后良好，預(yù)后不良者24例，預(yù)后良好者9例。

人結(jié)腸癌SW480 細胞和人結(jié)腸癌SW620 細胞購自上海一研生物科技有限公司（貨號：EY-X0739、EY-X1067）；本研究獲得天水市第二人民醫(yī)院醫(yī)學倫理會批準，實驗符合癌細胞處理和使用相關(guān)規(guī)定。

1.1.2 主要試劑與儀器 RPMI1640 培養(yǎng)基（上海信裕生物科技有限公司，貨號：AAPR123）；Lipofectamine2000 轉(zhuǎn)染試劑盒（上海恪敏生物科技有限公司）；小鼠抗人單克隆抗體anti-KRT17（艾美捷科技有限公司，貨號：MAB1985）；RIPA蛋白裂解液（武漢博士德生物工程有限公司）；BCA 試劑盒（賽默飛世爾科技有限公司，貨號：23221-23230）；ECL 發(fā)光試劑盒（聯(lián)邁生物）。CO2培養(yǎng)箱（上海新諾儀器設(shè)備有限公司，型號：WJ-3-160T）；Multiskan FC 酶標儀（美國賽默飛世爾公司）；CytoFLEX 流式細胞儀（美國Beckman公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)、傳代與轉(zhuǎn)染 細胞置于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，于37 ℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；顯微鏡觀察細胞生長情況，當細胞匯合度達到80%及以上時加入0.25%的胰酶消化細胞制成單細胞懸液；吸取單細胞懸液至離心管，800 r/min離心5 min；棄上清液，加入含10%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)基重懸，細胞移至培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)；待細胞生長狀態(tài)良好時換為無血清培養(yǎng)基同步化24 h，按照Lipofectamine2000 轉(zhuǎn)染說明書轉(zhuǎn)染siRNA 寡核苷酸，敲除細胞內(nèi)KRT17，將人結(jié)腸癌SW480 細胞分為對照組（轉(zhuǎn)染陰性對照組原液KRT17-control）、KRT17 組（轉(zhuǎn)染小鼠抗人單克隆抗體anti-KRT17），8株/組，轉(zhuǎn)染72 h后觀察轉(zhuǎn)染效果。

1.2.2 免疫熒光共聚焦實驗 對照組、KRT17 組細胞孵育24 h 后，PBS 沖洗，多聚甲醛固定10 min，HOE33342 染色劑染色，共聚焦顯微鏡下觀察綠色熒光細胞百分比（代表KRT17），徠卡LAS X 軟件分析圖像。獲得的溶液采用1×Tris Buffer 緩沖液洗滌，經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化，制備細胞懸液，結(jié)合1×Tris Buffer緩沖液重懸細胞，流式細胞術(shù)分析KRT17與癌細胞的相互作用。

1.2.3 免疫組織化學法觀察KRT17 表達 10%甲醛溶液固定癌組織和癌旁組織，脫水，石蠟包埋，切成4 μm 連續(xù)切片，依次脫蠟、修復、梯度乙醇水化、PBS漂洗、內(nèi)源性過氧化物酶活性消除，兩種組織滴加小鼠抗人KRT17 多克隆抗體（1∶100） 4 ℃孵育過夜，PBS 漂洗，再滴加即用型生物素化二抗37 ℃孵育30 min，PBS 漂洗，滴加辣根酶標記的鏈霉卵白素工作液，37 ℃孵育20 min，PBS 漂洗，經(jīng)DAB 顯色、蘇木素復染、脫水，透明后封片，觀察KRT17表達。

1.2.4 Western blot 檢測KRT17 蛋白表達 PBS 溶液沖洗癌細胞和癌旁細胞，RIPA 裂解后取上清，BCA 試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度；依次上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、漂洗，加KRT17（1∶500）、GAPDH 一抗 （1∶2 000），4 ℃冰箱過夜；漂洗后加二抗，25 ℃搖床1 h；漂洗后以ECL 發(fā)光試劑盒曝光、顯影。同法檢測對照組和KRT17組中KRT17的蛋白表達水平。

1.2.5 細胞CCK-8 增殖實驗 接種各組對數(shù)生長期細胞制成單細胞懸液，加入含10%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)基調(diào)整濃度為1×104個/ml，接種于 96 孔板，每孔含2 ml細胞懸液；37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h 至細胞匯合度達到90%及以上，加10 μl CCK-8 溶液培養(yǎng)180 min，低速振蕩10 min 后利用Multiskan FC 酶標儀測定其在570 nm 處的光密度（optical density，OD）值，重復實驗3次取平均值。

1.2.6 Transwell 細胞遷移、侵襲實驗 細胞劃痕實驗：取轉(zhuǎn)染后細胞使各組細胞密度約為90%，用200 μl 無菌槍頭對孔板培養(yǎng)細胞進行劃痕處理，PBS緩沖液洗滌3次，加入無血清培養(yǎng)基，于5%CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察細胞遷移軌跡。

Transwell：調(diào)整細胞濃度為5×105個/ml，向上室加入細胞懸液200 μl，下室加入700 μl 培養(yǎng)基（含20%FBS），48 h后PBS清洗Transwell小室，置于甲醛中固定15 min，0.2%結(jié)晶紫染色20 min，隨機選取 5 個視野拍照并進行計數(shù)統(tǒng)計；將Transwell 小室上表面鋪適量厚度的基質(zhì)膠，按上述步驟操作，顯微鏡下觀察小室下表面附著的侵襲細胞。

1.2.7 細胞凋亡實驗 取轉(zhuǎn)染后細胞加入含10%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)基調(diào)整濃度為2×105～ 5×105個/ml，2 000 r/min 離心5 min，棄上清液；加入500 μl PBS 溶液重懸細胞，分別加入5 μl Annexin V-FITC 溶液和PI 溶液，室溫避光孵育5 min；流式細胞儀觀察細胞凋亡情況，計算細胞凋亡率，重復實驗3次取平均值。

1.3 統(tǒng)計學方法 使用SPSS21.0軟件進行統(tǒng)計分析，非正態(tài)分布的資料采用中位數(shù)（四分位數(shù)范圍）［M（P25～P75）］表示；計量資料以±s表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；計數(shù)資料用頻率或構(gòu)成比表示，兩組間比較采用卡方確切概率法檢驗；Med-Cale 統(tǒng)計軟件繪制受試者特征工作曲線（receiver characteristic working curve，ROC）曲線，并采用Z檢驗分析預(yù)測價值，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 KRT17 與結(jié)腸癌細胞的關(guān)系 KRT17 與SW480 細胞、SW620 細胞共表達時綠色熒光信號顯著增強，見圖1。KRT17與SW480細胞、SW620細胞被熒光標記的KRT17 包裹率分別為（77.80±3.79）%、（64.68±3.66）%，提示KRT17 被SW480 細胞、SW620 細胞內(nèi)化；KRT17 與SW480 細胞內(nèi)化程度均較為顯著，因此在后續(xù)實驗中選擇結(jié)腸癌SW480細胞進行實驗。

圖1 免疫熒光共聚焦實驗圖Fig.1 Diagram of immunofluorescence confocal experiment

2.2 結(jié)腸癌和癌旁組織中KRT17 的表達 KRT17主要定位于細胞質(zhì)，呈棕黃色顆粒；在結(jié)腸癌組織中，棕黃色顆粒較多且密集；癌旁組織中棕黃色顆粒較少且不清晰（圖2）。與癌旁組織相比，結(jié)腸癌組織蛋白條帶信號增強（圖3）；結(jié)腸癌組織中KRT17 蛋白 表 達量（3.22±1.03）高 于癌 旁 組織（2.06±0.87）（t=4.942，P＜0.001）。

圖2 免疫組化染色（SP，×200）Fig.2 Immunohistochemical staining （SP，×200）

圖3 結(jié)腸癌組和癌旁組中KRT17表達Fig.3 Expression of KRT17 in colon cancer group and adjacent group

2.3 KRT17 表達與結(jié)腸癌患者特征的關(guān)系 確定癌組織和癌旁組織中KRT17表達中位數(shù)為3.06，結(jié)腸癌組織中KRT17高表達率（＞3.06）為66.67%（22/33），高于癌旁組織中的39.39%（13/33）（χ2=4.927，P=0.026）。性別、部位、組織學類型、分化程度不同的結(jié)腸癌患者癌組織中KRT17 表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；年齡、Dukes分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、預(yù)后不同的結(jié)腸癌患者癌組織中KRT17 表達水平差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 不同臨床特征結(jié)腸癌患者KRT17表達比較［例（%）］Tab.1 Comparison of KRT17 expression in colon cancer patients with different clinical features ［n（%）］

2.4 KRT17 高表達率預(yù)測結(jié)腸癌進展的模型建立與確定 選擇因素方程中具有統(tǒng)計學意義的變量指標KRT17 高表達率及其回歸系數(shù)建立預(yù)測模型的多元回歸方程，建立多因素Logistic回歸模型：logitP=-4.118+1.241×KRT17高表達率，在預(yù)測模型中，KRT17 低表達定義為0、高表達定義為1，KRT17 高表達率臨床模型診斷結(jié)腸癌進展和預(yù)后發(fā)生的標準誤為0.066，AUC（95%CI）為0.847（0.802～0.911），敏感度為71.15%、特異度為82.22%，見圖4。

圖4 臨床模型診斷的ROC曲線Fig.4 ROC curve of clinical model diagnosis

2.5 對照組和KRT17組SW480細胞增殖率 與對照組相比，KRT17 組SW480 細胞在48 h、72 h、96 h的OD 值增大（P＜0.05），見表2。轉(zhuǎn)染KRT17 后，SW480細胞增殖得到促進；48 h、72 h、96 h時，KRT17組SW480 細胞計數(shù)高于對照組，且細胞計數(shù)隨時間延長增加速度更顯著，見圖5。

圖5 兩組細胞增殖率比較Fig.5 Comparison of cell proliferation rate of two groups

表2 兩組SW480細胞轉(zhuǎn)染不同時間的OD值（±s，n=8）Tab.2 OD values of SW480 cells transfected in two groups at different times （±s，n=8）

表2 兩組SW480細胞轉(zhuǎn)染不同時間的OD值（±s，n=8）Tab.2 OD values of SW480 cells transfected in two groups at different times （±s，n=8）

2.6 對照組和KRT17組SW480細胞遷移能力 培養(yǎng)24 h 后，KRT17 組SW480 細胞劃痕面積大于對照組，見圖6。

圖6 兩組SW480細胞遷移能力Fig.6 Migration ability of SW480 cell in tow groups

2.7 對照組和KRT17 組SW480 細胞侵襲能力 KRT17 組SW480 細胞向器官表面靠攏，基底層可見較多偽足，形成大范圍癌巢；對照組SW480 細胞較少，不見偽足或僅有少量偽足，未形成癌巢，見圖7A。轉(zhuǎn)染KRT17 后，SW480 細胞侵襲能力得到促進，KRT17組穿過小室膜的細胞數(shù)［（226.35±52.36）個］多 于 對 照 組［（170.62±48.47）個］（t=2.209，P=0.043），見圖7B。

圖7 兩組SW480細胞侵襲能力（×100）Fig.7 Invasion ability of SW480 cells in two groups （×100）

2.8 對照組和KRT17組SW480細胞凋亡率 流式細胞術(shù)結(jié)果表明，KRT17 組SW480 細胞凋亡率低于對照組，見圖8。

圖8 SW480凋亡實驗Fig.8 SW480 apoptosis experiment

3 討論

CHEN 等［5］認為結(jié)腸癌的發(fā)生、侵襲及轉(zhuǎn)移與抑癌基因失活、癌基因突變、血管形成、DNA 去甲基化、癌基因激活等密切相關(guān)，且抑癌基因失活對結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展的影響尤為顯著。近年臨床開始關(guān)注結(jié)腸癌的免疫治療，目前DNA 錯配修復（DNA mismatch repair，MMR）是推薦在結(jié)腸癌A/B 期患者中臨床使用的唯一有效標志物，其中dMMR 患者在不進行輔助治療的情況下有良好的預(yù)后［6］。而實際上，一些預(yù)后生物標志物研究對T3/pMMR 腫瘤Ⅱ期患者的分層較敏感。KRT17 表達在T3/pMMR 亞組中具有顯著的預(yù)后價值［7-8］，考慮KRT17免疫組織化治療單獨或與常規(guī)因素聯(lián)合有可能完善影響術(shù)后決策的預(yù)后。

KRT 為正常血管生長過程中的必需因子，自發(fā)現(xiàn)以來已被證實可參與多種腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移過程：劉金生等［9］研究顯示KRT19 在肝細胞癌組織中高表達，且高表達KRT17 組侵襲能力更強；HAO 等［3］、CHIVU 等［10］指出高表達KRT17 可促進膀胱癌細胞增殖、遷移、侵襲過程；YAN 等［11］的體外實驗結(jié)果顯示，KRT17 在骨肉瘤細胞中高表達，可調(diào)節(jié)腫瘤細胞與腫瘤微環(huán)境的相互作用；KRT17在結(jié)腸癌中高表達，下調(diào)KRT17 表達可抑制癌細胞血管浸潤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，且提示該病預(yù)后較好［1］。本研究結(jié)腸癌組織中KRT17 呈高表達，與上述研究數(shù)據(jù)分析一致。同時，年齡≥65 歲、Dukes 分期C/D期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、預(yù)后不良的結(jié)腸癌患者KRT17高表達率低，考慮KRT17 的表達與結(jié)腸癌進展、預(yù)后有一定關(guān)系。通過KRT17 高表達率建立臨床預(yù)測模型，在區(qū)分度評估中，AUC 為0.847，提示準確度高。本文預(yù)測準確度高于類似研究結(jié)果：秦瓊等［12］通過癌結(jié)節(jié)對Ⅲ期結(jié)腸癌患者預(yù)后及TNM 分期進行整體評估，結(jié)果癌結(jié)節(jié)數(shù)目納入淋巴結(jié)數(shù)目整體評估決定TNM 分期，更能準確地反映患者預(yù)后，但準確率僅達到80%；K-ras基因突變、硫酸酯酶1均可預(yù)測預(yù)后，但不具有特異性，并未在臨床中得以應(yīng)用［13-14］。KRT17 的表達以組織特異性和環(huán)境依賴方式受到嚴格調(diào)控，有助于維持細胞完整性［15］。KRT17 在各種腺體的基底和肌上皮細胞中表達，與血管生成素具有相似結(jié)構(gòu)域及高度同源性，可協(xié)同血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）共同調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞增殖及血管生成［16］。KRT17 在健康皮膚中不表達，應(yīng)激狀態(tài)下可迅速在皮膚上皮細胞中誘導，導致細胞生長和炎癥反應(yīng)［17］。本文采用CCK-8 法檢測不同時間對結(jié)腸癌SW480 細胞增殖的影響，生長曲線圖顯示，過表達KRT17 可有效促進癌細胞生長增殖，提示KRT17 在參與結(jié)腸癌病理性進展中發(fā)揮促癌作用。根據(jù)轉(zhuǎn)染時間圖發(fā)現(xiàn)，過表達KRT17 對結(jié)腸癌細胞作用機制呈時間依賴性，時間越長，促進效應(yīng)越明顯。劉金生等［9］的平板克隆實驗結(jié)果顯示，敲除KRT17 可明顯降低單細胞克隆形成率，達到有效抑制肝細胞癌細胞增殖作用。Transwell 侵襲實驗結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染組穿過小室膜的細胞數(shù)更少，細胞遷移率更低，表明KRT17 可有效促進結(jié)腸癌細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移，證實KRT17 是一種可在體內(nèi)外調(diào)節(jié)腫瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)移的調(diào)控因子。ZHAO等［18］發(fā)現(xiàn)KRT17能擴大其他眾多癌基因轉(zhuǎn)錄，其主要通過靶向調(diào)節(jié)特異性信號蛋白通路促進結(jié)腸癌侵襲能力。有研究顯示，敲除KRT17 可通過加強血管內(nèi)皮細胞周圍的支持細胞聯(lián)系以維持血管完整和穩(wěn)定［19］。YAN 等［11］敲除小鼠KRT17 基因后其內(nèi)皮細胞形態(tài)恢復正常，血管穩(wěn)定性改善，且其與周圍細胞及基質(zhì)的聯(lián)系變好。有研究認為KRT17 可能通過Wnt/β-catenin/PI3K/Akt 信號通路促進結(jié)直腸癌HCT116 細胞系的遷移、增殖、侵襲等生物學行為的發(fā)生［20］，但仍有待進一步研究。

綜上所述，KRT17 在結(jié)直腸癌組織和細胞中高表達，KRT17 高表達的結(jié)腸癌細胞具有更強的增殖、遷移和侵襲能力，建立KRT17 表達的臨床模型可預(yù)測結(jié)腸癌患者的進展和預(yù)后。但本研究未對其他細胞株進行研究，可能存在局限性和誤差，有待后期研究繼續(xù)探討。