肖 磊 楊志雄 賴微微 劉升明 （廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院番禺院區(qū)呼吸內(nèi)科，廣州 510140）

肺癌是全球癌癥患者死亡的主要原因，針對腫瘤中特定分子改變的靶向治療已在肺癌治療中取得一定進(jìn)展，但多用于腺癌，且存在一定局限性，因此深入研究其分子作用機制，從而研發(fā)新的靶向藥物，精確指導(dǎo)癌癥治療至關(guān)重要［1-2］。環(huán)狀RNA （circRNA）是一類新的非編碼RNA，在人類疾病中起重要作用；差異表達(dá)的circRNA 可作為肺癌診斷的潛在生物標(biāo)志物。進(jìn)一步研究circRNA 在肺癌發(fā)病機制和調(diào)控途徑中的作用有利于開發(fā)診斷和準(zhǔn)確治療肺癌的新方法［3］。研究報道，結(jié)直腸癌組織中circ_0026344表達(dá)下調(diào)，circ_0026344異位表達(dá)通過海綿化miR-21 和miR-31 抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞生長和侵襲，并促進(jìn)其凋亡［4］。胃癌組織中circ_0026344表達(dá)降低，其表達(dá)與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期和浸潤深度顯著相關(guān)；circ_0026344 表達(dá)下調(diào)與腫瘤惡性行為有關(guān)，且是胃癌預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物［5］。但circ_0026344 在肺癌中的表達(dá)及其對肺癌A549細(xì)胞遷移、侵襲及凋亡的影響及分子機制尚不清楚。研究表明，miRNA 可能在包括肺癌在內(nèi)的各種癌癥進(jìn)展中起關(guān)鍵作用，如肺腺癌組織中miR-938 水平上調(diào)，其表達(dá)與腫瘤大小顯著相關(guān)，miR-938 通過調(diào)節(jié)RNA 結(jié)合基序蛋白5（RNA-binding motif protein 5，RBM5）促進(jìn) 肺 腺 癌 細(xì) 胞 增 殖［6］。miR-938 通過抑制PH 結(jié)構(gòu)域和富含亮氨酸重復(fù)序列的蛋白質(zhì)磷酸酶2（PH domain and leucine rich repeat protein phosphatases isoform 2，PHLPP2）促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖［7］。因此，本研究旨在探討circ_0026344 在肺癌中的表達(dá)及其對肺癌細(xì)胞A549 遷移、侵襲及凋亡的影響及分子機制是否與miR-938有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織來源 選取2017年1月至2019年12 月 廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院病理科存檔且已確診為肺癌的患者腫瘤組織及相應(yīng)癌旁組織39 例， 年齡25～78歲，平均（41.6±1.6）歲。

1.1.2 細(xì)胞與主要試劑 肺癌細(xì)胞A549購自上海雅吉生物科技有限公司；RPMI1640 培養(yǎng)基購自美國Gibco 公司；Trizol 試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR 試劑盒購自上海聯(lián)碩生物科技有限公司；Transwell小室、Matrigel購自美國BD 公司； BCA 試劑盒、Annexin V-FITC/PI 凋亡檢測試劑盒、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞處理與分組 肺癌A549 細(xì)胞采用 RPMI1640 培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞，分別轉(zhuǎn)染pcDNA、pcDNA-circ_0026344、si-NC、si-circ_0026344、anti-miR-NC、anti-miR-938，記為pcDNA組、pcDNA-circ_0026344組、si-NC組、si-circ_0026344組、anti-miR-NC 組、anti-miR-938 組；將pcDNA-circ_00-26344 分別與miR-NC、miR-938 共轉(zhuǎn)染至A549 細(xì)胞，記為pcDNA-circ_0026344+miR-NC 組、pcDNAcirc_0026344+miR-938組。

1.2.2 RT-qPCR 檢 測circ_0026344 和miR-938 表達(dá) 提取組織和細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，按照試劑盒說明進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系：2 μl反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、10 μl SYBR Green Mix、正反向引物各0.5 μl、 7 μl 無菌水；循環(huán)條件：95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s；72 ℃ 30 s，共40 個循環(huán)；circ_0026344 和miR-938 分別以GAPDH和U6為內(nèi)參，2-ΔΔCt法計算。

1.2.3 Transwell 檢測細(xì)胞遷移和侵襲 細(xì)胞遷移實驗：Transwell 小室上室和下室分別加入200 μl 細(xì)胞懸液和600 μl RPMI1640 完全培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h，多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，顯微鏡觀察并拍照，計算遷移細(xì)胞數(shù)。細(xì)胞侵襲實驗：采用基質(zhì)膠Matrigel包被Transwell上室，其余操作同細(xì)胞遷移實驗。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 收集各組細(xì)胞，漂洗，按試劑盒說明操作，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.2.5 Western blot 檢測蛋白表達(dá) 提取細(xì)胞總蛋白，定量后進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜，封閉液封閉后加入一抗4 ℃孵育過夜，加入二抗室溫孵育2 h，ECL 發(fā)光液顯影，分析蛋白條帶灰度值，以GAPDH為內(nèi)參計算目的蛋白相對表達(dá)。

1.2.6 雙熒光素酶報告實驗檢測circ_0026344 和miR-938 的靶向關(guān)系 構(gòu)建circ_0026344 的野生型和突變型熒光素酶表達(dá)載體WT-circ_0026344 和MUT-circ_0026344，采用LipofectamineTM2000 將其分別與miR-NC 和miR-938 共轉(zhuǎn)染至A549 細(xì)胞，按照說明書檢測熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，符合正態(tài)分布的計量資料用±s表示，兩組比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺癌組織circ_0026344 表達(dá) 與癌旁組織（1.00±0.05）比 較，肺 癌 組 織circ_0026344 表 達(dá)（0.33±0.04）降低（P＜0.05）。

2.2 circ_0026344 過表達(dá)對肺癌細(xì)胞A549 遷移、侵襲的影響 與pcDNA 組比較，pcDNA-circ_00-26344 組肺癌A549 細(xì)胞circ_0026344 表達(dá)升高，遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)減少，MMP-2、MMP-9 表達(dá)降低（P＜0.05，表1、圖1）。

圖1 遷移、侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)Fig.1 Migration and invasion related proteins expressions

表1 circ_0026344過表達(dá)對肺癌A549細(xì)胞遷移、侵襲的影響（±s，n=9）Tab.1 Effect of circ_0026344 over-expression on migration and invasion of lung cancer A549 cells （±s，n=9）

表1 circ_0026344過表達(dá)對肺癌A549細(xì)胞遷移、侵襲的影響（±s，n=9）Tab.1 Effect of circ_0026344 over-expression on migration and invasion of lung cancer A549 cells （±s，n=9）

Note：Compared with pcDNA group， 1）P＜0.05.

2.3 circ_0026344 過表達(dá)對肺癌A549 細(xì)胞凋亡的影響 與pcDNA 組比較，pcDNA-circ_0026344 組肺癌A549 細(xì)胞凋亡率升高，Bcl-2 表達(dá)降低，Bax 表達(dá)升高（P＜0.05，表2、圖2）。

圖2 circ_0026344過表達(dá)對肺癌A549細(xì)胞凋亡的影響Fig.2 Effect of circ_0026344 over-expression on apoptosis of lung cancer A549 cells

表2 circ_0026344 過表達(dá)對肺癌A549 細(xì)胞凋亡的影響 （±s，n=9）Tab.2 Effect of circ_0026344 over-expression on apoptosis of lung cancer A549 cells （±s，n=9）

表2 circ_0026344 過表達(dá)對肺癌A549 細(xì)胞凋亡的影響 （±s，n=9）Tab.2 Effect of circ_0026344 over-expression on apoptosis of lung cancer A549 cells （±s，n=9）

Note：Compared with pcDNA group， 1）P＜0.05.

2.4 circ_0026344 靶向調(diào)控miR-938 表達(dá) Circular RNA Interactome 預(yù)測顯示，circ_0026344 序列中含有與miR-938 互補的核苷酸序列（圖3）。與miRNC 組 比較，miR-938 組轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-circ_0026344 的細(xì)胞熒光素酶活性降低（P＜0.05，表3）。過表達(dá)circ_0026344，miR-938 表達(dá)降低，抑制circ_0026344 表達(dá)，miR-938表達(dá)升高（P＜0.05，表4）。

表3 雙熒光素酶報告實驗（±s，n=9）Tab.3 Double luciferase report experiment （±s，n=9）

表3 雙熒光素酶報告實驗（±s，n=9）Tab.3 Double luciferase report experiment （±s，n=9）

Note：Compared with miR-NC group， 1）P＜0.05.

表4 circ_0026344調(diào)控miR-938表達(dá)（±s，n=9）Tab.4 circ_0026344 regulates expression of miR-938 （±s，n=9）

表4 circ_0026344調(diào)控miR-938表達(dá)（±s，n=9）Tab.4 circ_0026344 regulates expression of miR-938 （±s，n=9）

Note：Compared with pcDNA group， 1）P＜0.05； compared with si-NC group， 2）P＜0.05.

圖3 circ_0026344 序列中含有與miR-938 互補的核苷酸序列Fig.3 Sequence of circ_0026344 contains a nucleotide sequence complementary to miR-938

2.5 抑制miR-938 表達(dá)對肺癌A549 細(xì)胞遷移、侵襲及凋亡的影響 與癌旁組織（1.00±0.08）比較，肺 癌 組 織miR-938 表 達(dá)（4.34±0.26）升 高（P＜0.05）；與anti-miR-NC 組比較，anti-miR-938 組肺癌A549 細(xì)胞miR-938 表達(dá)降低，遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)減少，細(xì)胞凋亡率升高，MMP-2、MMP-9、Bcl-2 表達(dá)降低，Bax表達(dá)升高（P＜0.05，圖4、表5）。

表5 抑制miR-938表達(dá)對肺癌A549細(xì)胞遷移、侵襲及凋亡的影響（±s，n=9）Tab.5 Effect of inhibiting expression of miR-938 on migration， invasion and apoptosis of lung cancer A549 cells （±s，n=9）

表5 抑制miR-938表達(dá)對肺癌A549細(xì)胞遷移、侵襲及凋亡的影響（±s，n=9）Tab.5 Effect of inhibiting expression of miR-938 on migration， invasion and apoptosis of lung cancer A549 cells （±s，n=9）

Note：Compared with anti-miR-NC group，1）P＜0.05.

Bax protein 0.21±0.02 0.58±0.041）24.820 0.000 Groups anti-miR-NC anti-miR-938 t P miR-938 1.00±0.06 0.24±0.021）36.050 0.000 Migration cell number 89.51±6.08 44.18±3.181）19.820 0.000 Invasive cell number 67.35±5.09 33.29±3.111）17.130 0.000 Apoptosis rate/%7.47±0.54 19.90±1.831）19.544 0.000 MMP-2 protein 0.69±0.05 0.30±0.021）21.726 0.000 MMP-9 protein 0.58±0.03 0.23±0.021）29.122 0.000 Bcl-2 protein 0.83±0.06 0.45±0.031）16.994 0.000

圖4 抑制miR-938表達(dá)對肺癌A549細(xì)胞遷移、侵襲及凋亡的影響Fig.4 Effect of inhibiting expression of miR-938 on migration， invasion and apoptosis of lung cancer A549 cells

2.6 miR-938過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了circ_0026344過表達(dá)對肺癌A549細(xì)胞遷移、侵襲及凋亡的作用 與pcDNAcirc_0026344+miR-NC組比較，pcDNA-circ_0026344+miR-938 組遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)增多，細(xì)胞凋亡率降低，MMP-2、MMP-9、Bcl-2 表達(dá)升高，Bax 表達(dá)降低 （P＜0.05，圖5、表6）。

表6 miR-938過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了circ_0026344過表達(dá)對肺癌A549細(xì)胞遷移、侵襲及凋亡的作用（±s，n=9）Tab.6 Over-expression of miR-938 reverses effect of over-expression of circ_0026344 on migration， invasion and apoptosis of lung cancer A549 cells （±s，n=9）

表6 miR-938過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了circ_0026344過表達(dá)對肺癌A549細(xì)胞遷移、侵襲及凋亡的作用（±s，n=9）Tab.6 Over-expression of miR-938 reverses effect of over-expression of circ_0026344 on migration， invasion and apoptosis of lung cancer A549 cells （±s，n=9）

Note：Compared with pcDNA-circ_0026344+miR-NC group， 1）P＜0.05.

Bax protein 0.62±0.04 0.32±0.031）18.000 0.000 Groups pcDNA-circ_0026344+miR-NC pcDNA-circ_0026344+miR-938 t P miR-938 1.00±0.05 3.08±0.221）27.658 0.000 Migration cell number 38.69±3.68 75.68±3.961）20.527 0.000 Invasive cell number 27.45±2.53 57.12±3.491）20.649 0.000 Apoptosis rate/%25.01±2.42 12.96±1.071）13.662 0.000 MMP-2 protein 0.23±0.02 0.58±0.031）29.122 0.000 MMP-9 protein 0.15±0.02 0.45±0.041）20.125 0.000 Bcl-2 protein 0.37±0.03 0.70±0.051）16.978 0.000

圖5 miR-938 過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了circ_0026344 過表達(dá)對肺癌A549細(xì)胞遷移、侵襲及凋亡的作用Fig.5 miR-938 over-expression reverses effect of circ_0026344 over-expression on migration，invasion and apoptosis of lung cancer A549 cells

3 討論

肺癌是全球發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤，隨著分子機制研究深入、分子診斷技術(shù)不斷發(fā)展，靶向藥物改善了肺癌傳統(tǒng)治療情況，為患者生存帶來了新希望［8-9］。越來越多的研究表明，circRNA 與肺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲有關(guān)，可作為肺癌診斷和預(yù)后的新型生物標(biāo)志物［10］。如沉默circ-BANP 在體外顯著抑制肺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲［11］。而circ_0026344 對肺癌的影響尚未有研究報道。本研究顯示，與癌旁組織比較，肺癌組織circ_0026344 表達(dá)降低；circ_0026344 過表達(dá)后，A549 細(xì)胞遷移、侵襲數(shù)減少，凋亡率升高，MMP-2、MMP-9、Bcl-2 表達(dá)降低，Bax 表達(dá)升高，表明circ_0026344 過表達(dá)可抑制肺癌細(xì)胞遷移、侵襲，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。研究報道，circ_0026344 過表達(dá)可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移和侵襲［12］。提示circ_0026344 在癌癥中可能起抑癌基因作用。

研究報道，替莫唑胺抗性亞型的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中miR-938 呈過表達(dá)［13］。本研究顯示，肺癌組織miR-938 表達(dá)升高，抑制miR-938 表達(dá)，A549 細(xì)胞遷移、侵襲數(shù)減少，凋亡率升高，說明抑制miR-938 表達(dá)可抑制肺癌A549 細(xì)胞遷移、侵襲，且促進(jìn)細(xì)胞凋亡。此外，circRNA 可充當(dāng)miRNA 的競爭性內(nèi)源性RNA 影響細(xì)胞增殖、遷移和侵襲等［14］。如circ_100395 過表達(dá)通過調(diào)控miR-1228 顯著抑制肺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲［15］。抑制circRNA_100146 通過調(diào)控miR-361-3p 和miR-615-5p 表達(dá)抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖和侵襲，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡［16］。本研究通過Circular RNA Interactome 預(yù)測circ_0026344 可能結(jié)合的miRNA，結(jié)果顯示circ_0026344 與miR-938存在結(jié)合位點。雙熒光素酶報告實驗驗證circ_0026344可靶向調(diào)控miR-938表達(dá)，進(jìn)一步同時過表達(dá)miR-938 和circ_0026344 后遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)增多，細(xì)胞凋亡率降低，說明miR-938 過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了circ_0026344 過表達(dá)對肺癌A549 細(xì)胞遷移、侵襲及凋亡的作用。提示circ_0026344可能通過調(diào)控miR-938表達(dá)影響肺癌細(xì)胞遷移、侵襲及凋亡。

綜上所述，circ_0026344 過表達(dá)可能通過靶向下調(diào)miR-938 表達(dá)抑制肺癌A549 細(xì)胞遷移、侵襲，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。