宋丹丹 宋明旭 孫 鴻 （江南大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚科，無錫 214122）

皮膚鱗狀細(xì)胞癌是我國常見的惡性腫瘤，目前其發(fā)病機制尚未闡明，隨著醫(yī)療技術(shù)的進步，分子靶向治療成為皮膚鱗狀細(xì)胞癌的重點研究［1-2］。環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）不具有5'端帽子結(jié)構(gòu)與3'端多聚腺苷酸尾巴結(jié)構(gòu)，具有穩(wěn)定性與組織特異性，circRNA 可充當(dāng)微小RNA（miRNA）的海綿分子而調(diào)節(jié)其靶基因表達，研究表明circRNA 在皮膚鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生及發(fā)展過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用［3-4］。circAGFG1 在三陰性乳腺癌中表達上調(diào)，可通過充當(dāng)miR-195-5p 的海綿分子而抑制三陰性乳腺癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移下調(diào)其表達［5］。Starbase 預(yù)測顯示circAGFG1與miR-653-5p存在結(jié)合位點。研究表明miR-653-5p 在黑色素瘤中呈低表達，上調(diào)其表達可抑制黑色素瘤增殖及轉(zhuǎn)移［6］。但circAGFG1/miR-653-5p 分子軸在皮膚鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生及發(fā)展過程中的作用機制尚未明確。因此，本研究主要探討circAGFG1是否可通過靶向調(diào)控miR-653-5p表達而調(diào)節(jié)皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖及遷移。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 臨床資料 收集2018 年3 月至2020 年5 月江南大學(xué)附屬醫(yī)院收治的46 例皮膚鱗狀細(xì)胞癌患者的癌組織及其相應(yīng)癌旁組織標(biāo)本，置于-80 ℃超低溫冰箱內(nèi)保存。其中男26 例，女20 例，年齡44～63 歲，平均年齡（52.35±3.26）歲，所有患者均經(jīng)手術(shù)組織病理證實為皮膚鱗狀細(xì)胞癌。本研究經(jīng)江南大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者知情且簽署同意書。

1.1.2 細(xì)胞與試劑 人皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞SCC13 購自美國ATCC；LipofectamineTM3000 Transfection Reagent 購自美國Invitrogen；DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、Trizol 試劑購自上海碧云天生物；反轉(zhuǎn)錄試劑與SYBR 熒光定量試劑購自北京天根生化；si-NC、si-circAGFG1、miR-NC、miR-653-5p mimics、antimiR-NC、anti-miR-653-5p 購自廣州銳博生物；野生型載體WT-circAGFG1、突變型載體MUT-circAGFG1 與雙熒光素酶活性檢測試劑盒購自美國Promega。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組 將SCC13 細(xì)胞接種于6 孔板 （1×105個/孔），待細(xì)胞生長融合度約為70%時進行轉(zhuǎn)染，細(xì)胞分為si-NC 組（轉(zhuǎn)染50 nmol/L circAGFG小干擾RNA 的陰性對照）、si-circAGFG1 組（轉(zhuǎn)染 50 nmol/L circAGFG 小干擾RNA）、miR-NC 組（轉(zhuǎn)染50 nmol/L miR-653-5p 寡核苷酸模擬物的陰性對照mimic NC 序列）、miR-653-5p 組（轉(zhuǎn)染50 nmol/L miR-653-5p 寡核苷酸模擬物）、si-circAGFG1+antimiR-NC 組（共轉(zhuǎn)染50 nmol/L si-circAGFG1 與miR-653-5p特異性寡核苷酸抑制劑的陰性對照）、si-circ-AGFG1+anti-miR-653-5p組（共轉(zhuǎn)染50 nmol/L si-circ-AGFG1與miR-653-5p特異性寡核苷酸抑制劑）。

1.2.2 qRT-PCR 檢測circAGFG1、miR-653-5p 的表達水平 皮膚鱗狀細(xì)胞癌組織、癌旁組織與各組SCC13 細(xì)胞加入1 ml Trizol 試劑提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，qRT-PCR 擴增反應(yīng)體系：SYBR Green Master Mix 10 μl、正反向引物0.8 μl、cDNA 1 μl，ddH2O 補足體系至20 μl；反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性 5 min 循環(huán)1 次，95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共循環(huán)40 次。circAGFG1 以GAPDH 為內(nèi)參，miR-653-5p 以U6 為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算circ-AGFG1、miR-653-5p相對表達量。

1.2.3 CCK-8 實驗檢測細(xì)胞增殖 收集各組SCC13 細(xì)胞接種于96 孔板（3×103個/孔），每孔加入10 μl CCK-8 溶液，于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2 h，采用酶標(biāo)儀檢測450 nm波長處的光密度值（OD值）。

1.2.4 平板克隆形成實驗 取各組SCC13 細(xì)胞 （1 000個/孔），于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱培養(yǎng)14 d，棄培養(yǎng)基，預(yù)冷PBS 洗滌，加入500 μl 甲醇固定細(xì)胞20 min，400 μl 1%結(jié)晶紫染色液染色15 min，對≥30 個細(xì)胞的集落進行觀察，于顯微鏡下觀察細(xì)胞克隆形成數(shù)。

1.2.5 劃痕實驗 收集各組SCC13 細(xì)胞接種于 6孔板（1×104個/孔），待細(xì)胞生長融合度達到80%時，用200 μl移液槍的槍頭在細(xì)胞單層劃線，于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h 后于顯微鏡下觀察遷移距離，應(yīng)用Image J軟件檢測各組細(xì)胞遷移距離并計算細(xì)胞劃痕愈合率，愈合率（%）=（0 h 劃痕寬度-24 h 劃痕寬度）/0 h 劃痕寬度×100%。

1.2.6 Transwell 實驗檢測細(xì)胞遷移 收集各組SCC13 細(xì)胞加入0.25%胰蛋白酶消化，加入不含血清的DMEM 培養(yǎng)液制備單細(xì)胞懸液（5×104個/ml），取200 μl 細(xì)胞懸液接種于上室，下室加入600 μl 含有10%胎牛血清的培養(yǎng)液，培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，多聚甲醛固定20 min，0.1%結(jié)晶紫染液染色10 min，顯微鏡下隨機選取5個視野觀察遷移細(xì)胞數(shù)。

1.2.7 雙熒光素酶報告實驗檢測circAGFG1 與miR-653-5p 的靶向關(guān)系 Starbase 預(yù)測顯示circAGFG1 與miR-653-5p 存在結(jié)合位點，構(gòu)建熒光素酶報告基因載體：野生型載體WT-circAGFG1、突變型載體MUT-circAGFG1，分別將熒光素酶報告基因載體與miR-NC 或miR-653-5p mimics 共轉(zhuǎn)染至SCC13 細(xì)胞，于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，采用雙熒光素酶活性檢測試劑盒檢測細(xì)胞熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS21.0進行分析，計量資料以±s表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析；Pearson法進行相關(guān)性分析，以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 皮膚鱗狀細(xì)胞癌組織中circAGFG1 和miR-653-5p 的表達 與癌旁組織比較，皮膚鱗狀細(xì)胞癌組織中circAGFG1 的表達量升高（P＜0.05），miR-653-5p 的表達量降低（P＜0.05），見圖1A、1B。采用Pearson 法分析皮膚鱗狀細(xì)胞癌組織中circAGFG1與miR-653-5p 表達量的相關(guān)性，結(jié)果顯示，circAGFG1與miR-653-5p呈負(fù)相關(guān)（r=-0.571 7，P＜0.001），見圖1C。

圖1 circAGFG1 和miR-653-5p 在皮膚鱗狀細(xì)胞癌組織中表達的檢測及相關(guān)性分析Fig.1 Detection and correlation analysis of circAGFG1 and miR-653-5p expressions in skin squamous cell carcinoma

2.2 下調(diào)circAGFG1 對SCC13 細(xì)胞增殖、遷移的影響 與si-NC 組比較，si-circAGFG1 組miR-653-5p 的表達量升高（P＜0.05），細(xì)胞增殖抑制率升高（P＜0.05），劃痕愈合率降低（P＜0.05），細(xì)胞克隆形成數(shù)和遷移細(xì)胞數(shù)減少（P＜0.05），見表1。

表1 下調(diào)circAGFG1抑制SCC13細(xì)胞增殖、遷移（xˉ±s，n=9）Tab.1 Down-regulation of circAGFG1 inhibits proliferation and migration of SCC13 cells （xˉ±s，n=9）

2.3 circAGFG1 靶 向miR-653-5p circAGFG1 與miR-653-5p 存在結(jié)合位點，見圖2。共轉(zhuǎn)染野生型載體WT-circAGFG1 的細(xì)胞實驗中，與miR-NC 組比較，miR-653-5p 組細(xì)胞熒光素酶活性降低（P＜0.05），見表2。表明circAGFG1 與miR-653-5p 存在靶向調(diào)控作用。

圖2 circAGFG1與miR-653-5p存在結(jié)合位點Fig.2 There are binding sites for circAGFG1 and miR-653-5p

表2 雙熒光素酶報告實驗（xˉ±s，n=9）Tab.2 Double luciferase report experiment （xˉ±s，n=9）

2.4 miR-653-5p對SCC13細(xì)胞增殖、遷移的影響 與miR-NC 組比較，miR-653-5p 組細(xì)胞增殖抑制率升高（P＜0.05），劃痕愈合率降低（P＜0.05），細(xì)胞克隆形成數(shù)和遷移細(xì)胞數(shù)減少（P＜0.05），見表3。

表3 miR-653-5p抑制SCC13細(xì)胞增殖、遷移（xˉ±s，n=9）Tab.3 miR-653-5p inhibits proliferation and migration of SCC13 cells （xˉ±s，n=9）

2.5 抑制miR-653-5p 對下調(diào)circAGFG1 處理的SCC13 細(xì)胞增殖、遷移的影響 與si-circAGFG1+ anti-miR-NC 組比較，si-circAGFG1+anti-miR-653-5p組細(xì)胞增殖抑制率降低（P＜0.05），劃痕愈合率升高（P＜0.05），細(xì)胞克隆形成數(shù)和遷移細(xì)胞數(shù)增多（P＜0.05），見表4。

表4 抑制miR-653-5p可逆轉(zhuǎn)下調(diào)circAGFG1對SCC13細(xì)胞增殖、遷移的抑制作用（xˉ±s，n=9）Tab.4 Inhibition of miR-653-5p can reverse inhibitory effect of down-regulation of circAGFG1 on proliferation and migration of SCC13 cells （xˉ±s，n=9）

3 討論

circRNA 可通過充當(dāng)miRNA 的海綿分子而間接調(diào)控靶基因表達，研究表明circRNA 在皮膚鱗狀細(xì)胞癌中表達異常，并可調(diào)節(jié)細(xì)胞生物學(xué)行為［7-9］。circRNA 可通過調(diào)節(jié)miRNA/mRNA 分子軸從而影響皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖、凋亡等生物學(xué)過程，還可能作為皮膚鱗狀細(xì)胞癌靶向治療的潛在靶點［10-11］。

circAGFG1 可通過調(diào)節(jié)YY1/CTNNB1 分子軸促進結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移［12］。circAGFG1 可充當(dāng)miR-28-5p的海綿分子調(diào)節(jié)HIF-1α 的表達而促進非小細(xì)胞肺癌進展［13］。circAGFG1 可通過下調(diào)p53 表達而促進宮頸癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移［14］。但circAGFG1在皮膚鱗狀細(xì)胞癌中表達及其可能作用機制尚未明確。本研究結(jié)果顯示，皮膚鱗狀細(xì)胞癌組織中circAGFG1 的表達量升高，下調(diào)circAGFG1 表達后皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖抑制率升高，劃痕愈合率降低，細(xì)胞克隆形成數(shù)和遷移細(xì)胞數(shù)減少，提示下調(diào)circAGFG1 表達可抑制皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖、克隆形成及遷移。

miR-653-5p 在胃癌中表達下調(diào)，上調(diào)其表達可抑制胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移［15］。miR-653-5p 表達上調(diào)可抑制宮頸癌細(xì)胞增殖［16］。miR-653-5p 通過靶向調(diào)控MAPK6 而抑制乳腺癌細(xì)胞生長及遷移［17］。miR-653-5p 表達上調(diào)可抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞生長和侵襲［18］。本研究結(jié)果顯示，皮膚鱗狀細(xì)胞癌組織中miR-653-5p 的表達量降低，circAGFG1 與miR-653-5p 呈負(fù)相關(guān)，circAGFG1 可充當(dāng)miR-653-5p 的海綿分子，并可負(fù)向調(diào)控miR-653-5p的表達，miR-653-5p過表達可抑制皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖、克隆形成及遷移，而抑制miR-653-5p表達可拮抗下調(diào)circAGFG1 表達對皮膚鱗狀細(xì)胞癌增殖、克隆形成及遷移的抑制作用。提示circAGFG1可通過靶向調(diào)控miR-653-5p 表達而促進皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖、克隆形成及遷移。

綜上所述，皮膚鱗狀細(xì)胞癌組織中circAGFG1表達水平升高，miR-653-5p 的表達水平降低，circ-AGFG1 可靶向結(jié)合miR-653-5p，下調(diào)circAGFG1 表達可通過促進miR-653-5p 表達而抑制皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖、克隆形成及遷移，circAGFG1 可能作為皮膚鱗狀細(xì)胞癌治療的潛在靶點。但關(guān)于其具體作用機制尚需進一步探究。