王春梅 吳德慧 康 燕 魏順英 馬登云 （青海紅十字醫(yī)院婦一科，西寧 810000）

宮頸癌是婦科常見惡性腫瘤之一，發(fā)病率和病死率較高，且逐漸年輕化，嚴重威脅女性健康［1］。隨著醫(yī)學技術發(fā)展，早期宮頸癌可通過手術、放化療治療，但晚期或復發(fā)轉移患者預后較差［2］。隨著分子生物學發(fā)展，靶向治療為癌癥臨床治療提供了新思路，分析宮頸癌發(fā)展的相關機制可能為其臨床治療提供新方法［3］。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一類長度超過200 nt 的不具備蛋白編碼功能的RNA 分子，可與DNA、RNA 和蛋白相互作用，在表觀遺傳、轉錄和翻譯水平調節(jié)基因表達和蛋白活性，參與染色質修飾、轉錄激活和抑制等生物學過程［4］。lncRNA 不僅參與機體正常生理活動，在疾病發(fā)生發(fā)展尤其是腫瘤發(fā)生過程中具有重要作用，尋找宮頸癌中特異表達的lncRNA，并分析其在宮頸癌中的分子機制，可能有助于尋找宮頸癌治療靶點，為宮頸癌靶向治療提供新思路［5］。課題組前期生物信息學分析發(fā)現，宮頸癌中LINC01980表達顯著上調，與肝癌、食管癌發(fā)生發(fā)展及預后相關，但其在宮頸癌中的表達及其對宮頸癌的影響尚未闡明［6-8］。LIN28B 是一種保守RNA 結合蛋白，與宮頸癌、卵巢癌等女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤發(fā)生有關，可能是治療女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的潛在靶標［9-10］。本研究生物信息學預測結果表明，LIN28B 與LINC01980 具有相互作用位點，因此，本研究擬探討LINC01980在宮頸癌中的表達及其對宮頸癌細胞生長影響的可能機制，為宮頸癌治療提供新的靶標。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 研究對象 選取2020 年1 月至2021 年5 月青海紅十字醫(yī)院收治的病理學診斷為宮頸癌的患者60 例作為宮頸癌組，年齡35～67 歲，平均年齡（48.78±8.83）歲。排除標準：①接受手術、放化療等治療；②合并其他婦科疾病者；③合并肝、腎等重大功能臟器不全者；④合并其他惡性腫瘤患者。選取同期青海紅十字醫(yī)院健康體檢者（宮頸未發(fā)生病變）60 例作為健康組，年齡33～70 歲，平均年齡（47.95±10.89）歲。兩組研究對象年齡差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。研究經青海紅十字醫(yī)院倫理委員會審核批準。

1.1.2 試劑與儀器 人宮頸癌細胞系Hela（TCHu187）購自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫；MEM培養(yǎng)基（41500034）、胎牛血清（10099）、胰蛋白酶（25200056）購自美國Gibco 公司；Lipofectamine3000試劑盒（L3000015）購自美國Invitrogen公司；RNAiso plus（9108Q）購自日本TaKaRa 公司；反轉錄試劑盒（205311）、qRT-PCR 試劑盒（204443）購自德國QIAGEN 公司；CCK-8（C0037）、蛋白提取試劑盒（P0012）、BCA 蛋白定量試劑盒（C1062）購自上海碧云天生物技術公司；DNA 含量檢測試劑盒（細胞周期，CA1510）、AnnexinV Alexa Fluor488/PI凋亡檢測試劑盒（CA1040）購自北京索萊寶科技有限公司；protein A/G 磁珠（sc-2003）購自美國Santa Cruz Technology公司；Magna RIP Kit（17-701）購自美國Merck Millipore；PierceTM生物素 3'末端DNA 標記試劑盒（89818）購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；兔抗人細胞周期蛋白D1（CyclinD1，ab16663）、周期蛋白依賴性激酶4（Cyclin-dependent kinases 4，CDK4，ab108357）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase-3，ab32351）、β-actin（ab8227）、山羊抗兔IgG H&L（ab6721）購自英國Abcam公司；LINC01980、LIN28B、GAPDH 引物和siRNA 質粒、siNC 質粒、pcDNA3.1載體、pcDNA3.1-LINC28B 質粒由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；NanoDrop one 超微量分光光度計、Multiskan FC 酶標儀購自美國Thermo Fisher公司；CFX96 Touch 實時熒光定量PCR 儀、Gel-Doc XR蛋白凝膠成像儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學分析 生物信息學工具iBio Tools V5.0（http://www.chrisapp.xyz：3838/R/AnnoE2/，設置參數：P＜0.05，logFC=1）預測宮頸癌差異表達基因，catRAPID（http://service.tartaglialab.com/page/catrapid_group）預測lncRNA 與蛋白的相互結合關系，生物信息學預測LINC01980與LIN28B相互作用關系，提示辨識度（Discriminative Power）＞20%可能發(fā)生交互作用，＞75%極有可能存在交互作用。

1.2.2 血液采集 宮頸癌患者于術前、對照組于體檢當日抽取肘部靜脈血3 ml，4 ℃、3 000 r/min 離心15 min，轉移上清至新離心管，-80 ℃保存。

1.2.3 細胞培養(yǎng)與分組 常規(guī)復蘇宮頸癌細胞系Hela，加至含10%胎牛血清的MEM 培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)，2～3 d 更換1 次培養(yǎng)液，細胞融合度達到80%左右時胰蛋白酶消化傳代。收集細胞，調整細胞數為6×105個/孔，接種至6 孔板，細胞融合度達到80%時更換為無血清DMEM 培養(yǎng)基，按照Lipofectamine3000 試 劑 盒 說 明 書 將 Lnc-NC、si-LINC01980、si-LINC01980+LIN28B-NC、si-LINC01980+LIN28B 分別轉染至Hela 細胞，分為Lnc-NC 組、si-LINC01980 組、si-LINC01980+LIN28B-NC 組 和si-LINC01980+LIN28B 組，對照組僅添加新鮮培養(yǎng)液，轉染48 h后收集細胞進行后續(xù)實驗。

1.2.4 qRT-PCR 檢測血清及細胞中LINC01980、LIN28B mRNA 表達 RNAiso Plus 試劑盒提取血清及Hela細胞中總RNA并檢測濃度，反轉錄試劑盒將RNA 反轉錄為cDNA，進行qRT-PCR 反應，反應條件：預變性95 ℃ 45 s，變性95 ℃ 30 s，退火60/58/62 ℃ 45 s，延伸72 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。以GAPDH為內參，2-ΔΔCt計算血清及Hela 細胞中LINC01980、LIN28B mRNA相對表達。引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.2.5 RNA 免疫共沉淀 收集Hela 細胞，離心，加入等體積RIP裂解緩沖液吹打懸浮，取5 g 蛋白抗體于免疫沉淀緩沖液內與protein A/G 磁珠結合2 h，加入100 μl 細胞裂解物，4 ℃輕柔攪動孵育1 h，離心，棄上清，加入400 μl洗脫緩沖液4 ℃孵育2 h，TRIzol提取RNA，qRT-PCR 檢測 LINC01980表達。

1.2.6 RNA pull-down 根據RNA pull-down 試劑盒說明書實驗，將生物素標記的LINC01980 轉染至Hela 細胞，培養(yǎng)48 h，收集細胞，加入細胞裂解液和鏈霉親和素瓊脂糖珠4 ℃孵育 3 h，預冷裂解緩沖液洗滌3 次，十二烷基硫酸鈉緩沖液中回收蛋白，Western blot檢測LIN28B表達。

1.2.7 CCK-8 檢測細胞活力 收集1.2.3 中轉染后的各組Hela 細胞，每組設置3 個重復，每個重復 3 個復孔，棄原培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)48 h，每孔加入10 μl CCK-8 試劑和100 μl 新鮮培養(yǎng)基，37 ℃避光培養(yǎng)2 h，棄上清，酶標儀檢測450 nm 處吸光度（OD）值，細胞活力（%）=實驗孔OD 值/對照孔OD值×100%。

1.2.8 流式細胞術檢測HTR-8/Svneo 細胞周期及凋亡 收集1.2.3 中轉染48 h 的各組Hela 細胞，每組設置3 個重復，每個重復3 個復孔，PBS 洗滌， 1 500 r/min 離心5 min，收集細胞并調整濃度為 1×106個/ml，吸取1 ml 細胞懸液，離心，棄上清，70%預冷乙醇固定2 h，PBS 洗滌，離心，加100 μl RNase A 溶液，重懸細胞，37 ℃水浴30 min，加入400 μl PI染色液混勻，4 ℃遮光孵育30 min，流式細胞儀檢測細胞周期。收集1.2.3 中轉染48 h 的各組Hela 細胞，每組設置3 個重復，每個重復3 個復孔，調整細胞濃度為1×106個/ml，PBS 洗滌，Binding Buffer 重懸細胞，吸取100 μl細胞懸液加至流式管，再加入5 μl室溫遮光孵育10 min，加入5 μl PI 染色液室溫遮光孵育5 min，加入PBS 至500 μl，混勻，流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.2.9 Western blot 檢測細胞蛋白表達 收集1.2.3 中培養(yǎng)48 h 的各組細胞，調整細胞數為 5×104個/孔，加至24孔板，棄上清，PBS洗滌，每組設置3 個重復，每個重復3 個復孔，試劑盒提取細胞總蛋白并檢測蛋白濃度，SDS-PAGE 凝膠電泳，封閉，分別加入兔抗人CyclinD1、CDK4、caspase-3、β-actin 稀釋液4 ℃孵育過夜，TBST 洗膜，加入山羊抗兔IgG H&L 二抗稀釋液（1∶2 000 稀釋），室溫孵育1 h，TBST 洗膜，蛋白凝膠成像儀成像，Image J 分析蛋白相對表達。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS25.0軟件進行數據分析，計量資料采用±s表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間比較采用SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 宮頸癌組與健康組血清LINC01980、LIN28B mRNA 表達比較 生物信息學工具iBio Tools V5.0（http://www.chrisapp.xyz：3838/R/AnnoE2/）預測結果表明，LINC01980在宮頸癌組織中表達上調（圖1A）。與健康組比較，宮頸癌組血清LINC01980、LIN28B mRNA表達顯著升高（P＜0.001，圖1B）。

圖1 兩組血清LINC01980、LIN28B mRNA表達Fig.1 Expressions of serum LINC01980 and LIN28B mRNA in two groups

2.2 生物信息學網站預測LINC01980 結合蛋白 生物信息學網站（http://service.tartaglialab.com/page/catrapid_group）預測結果表明：LINC01980 RNA 與LIN28B 存在結合位點，且在1841-1990 處辨識度達88%，極有可能發(fā)生相互作用（表2）。

表2 生物信息學網站預測LINC01980結合蛋白Tab.2 Binding proteins of LINC01980 predicted by bioinformatics website

2.3 RNA 免 疫 共 沉 淀、RNA pull-down 檢 測LINC01980 與LIN28B 結合 RNA 免疫共沉淀實驗結果顯示，與IgG 相比，免疫沉淀復合物中LINC01980 含量顯著升高（P＜0.001，圖2A），RNA pull-down 實驗結果顯示，LINC01980 正義鏈下拉的沉淀物中檢測出LIN28B 表達（圖2B）。提示LINC01980與LIN28B發(fā)生相互作用。

圖2 LINC01980、LIN28B結合驗證圖Fig.2 LINC01980 and LIN28B combination verification diagram

2.4 沉 默LINC01980 對Hela 細 胞LINC01980、LIN28B mRNA 表達的影響 與對照組比較，Lnc-NC組LINC01980、LIN28B mRNA 表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），si-LINC01980 組 LINC01980、LIN28B mRNA表達顯著降低（P＜0.05，圖3）。

圖3 Hela細胞LINC01980、LIN28B mRNA表達Fig.3 LINC01980 and LIN28B mRNA expressions in Hela cells

2.5 沉默LINC01980 對Hela 細胞生長的影響 與對照組比較，Lnc-NC 組細胞活力、細胞凋亡率、細胞周期G0/G1期、S 期、G2/M 期細胞百分比、CyclinD1、CDK4、caspase-3 蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），si-LINC01980 組細胞活力、S 期、G2/M 期細胞百分比、CyclinD1、CDK4、LIN28B 蛋白表達顯著降低，細胞凋亡率、G0/G1期細胞百分比、caspase-3 蛋白表達顯著升高（P＜0.001，圖4）。

圖4 沉默LINC01980表達對Hela細胞生長的影響Fig.4 Effect of silencing LINC01980 expression on Hela cell growth

2.6 過表達LIN28B逆轉了沉默LINC01980對宮頸癌細胞生長的抑制作用 與si-LINC01980 組比較，si-LINC01980+LIN28B NC 組Hela 細胞活力、細胞凋亡率、G0/G1期、S 期、G2/M 期細胞百分比、CyclinD1、CDK4、caspase-3 蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），si-LINC01980+LIN28B 組細胞活力、S 期、G2/M 期細胞百分比、CyclinD1、CDK4、LIN28B蛋白表達顯著升高，細胞凋亡率、G0/G1期細胞百分比、caspase-3蛋白表達顯著降低（P＜0.001，圖5）。

圖5 過表達LIN28B逆轉了沉默LINC01980對宮頸癌細胞生長的抑制作用Fig.5 Overexpression of LIN28B reversed inhibitory effect of silencing LINC01980 on growth of cervical cancer cells

3 討論

宮頸癌是最常見的女性生殖道惡性腫瘤，同時也是女性第四大常見惡性腫瘤，其發(fā)生主要與高危型人乳頭狀瘤病毒（human papillomaviruses，HPV）持續(xù)感染有關［11］。手術和放化療等雖然有效降低了宮頸癌病死率，但晚期宮頸癌患者預后較差，宮頸癌仍是導致癌癥死亡的主要原因之一［12］。lncRNA是由200～300 個核苷酸組成的非編碼RNA，其異常表達與腫瘤細胞增殖、遷移、侵襲、凋亡和上皮-間質轉化有關，部分lncRNA 可作為惡性腫瘤診斷和預后的潛在靶標和生物標志物［13-14］。LINC01980 是 一種新發(fā)現的癌癥相關lncRNA，研究表明肝癌組織中LINC01980 表達顯著高于癌旁組織，LINC01980高表達的肝癌患者預后較差，且敲除LINC01980 能夠抑制肝癌細胞Huh7 和Hep3B 增殖，促進細胞凋亡［6］。微列陣分析表明，LINC01980 在食管鱗狀細胞癌組織中顯著上調，且與癌癥TNM 分期、組織浸潤和患者預后有關，體內外實驗均表明LINC01980能夠促進食管鱗狀細胞癌生長［8］。本研究生物信息學分析結果表明，LINC01980在宮頸癌中表達上調，臨床試驗顯示宮頸癌患者血清中LINC01980表達顯著高于健康對照組，提示在宮頸癌中LINC01980 表達異常。體外實驗結果顯示，沉默LINC01980 可抑制宮頸癌細胞Hela 活力，提高G0/G1期細胞百分比，促進細胞凋亡。CyclinD1是調節(jié)細胞周期的主要蛋白之一，與CDK4 形成復合物調控G1期細胞向S 期過 渡［15］。本 研 究Western blot 結 果 表 明，沉 默LINC01980 能夠抑制蛋白CyclinD1 和CDK4 表達，提示LINC01980可能通過調控細胞周期和凋亡參與宮頸癌Hela 細胞生長和增殖，具體機制有待進一步分析。

lncRNA 通過堿基互補和二級結構形成頸環(huán)，能夠與DNA、RNA 和蛋白相互作用，在表觀遺傳、轉錄和轉錄后水平影響基因表達，進而參與染色質修飾、轉錄激活和抑制、核內運輸等過程［16-17］。lncRNA?；撬嵘险{基因1（taurine-upregulated gene 1，TUG1）通過靶向極光激酶A（aurora kinase A，AURKA）促進上皮性卵巢癌細胞SK-OV-3增殖和侵襲［18］。生物信息學數據庫分析表明，LINC01980 與LIN28B 存在相互作用。LIN28B 是一種高度保守的RNA 結合蛋白，在胚胎干細胞和發(fā)育組織中高表達，參與細胞發(fā)育、代謝重編程、腫瘤發(fā)生等多種生物學過程［19］。LIN28B 可通過直接結合mRNA 或阻斷miRNA 生物合成調節(jié)基因表達［20］。Let-7是一種腫瘤抑制因子，研究表明LIN28B 能夠通過與let-7 前體末端相結合阻斷Let-7 生物合成［21］。本研究表明，在Hela 細胞中沉默LINC01980 表達，LIN28B 表達降低，過表達LIN28B 可逆轉沉默LINC01980 對宮頸癌細胞生長的抑制作用，提示LINC01980 協(xié)同LIN28B 在Hela細胞增殖、凋亡中發(fā)揮作用。本研究證實LIN28B是LINC01980 的結合蛋白且存在相互作用，提示LINC01980 可結合LIN28B，抑制Hela 細胞增殖，促進細胞凋亡，但LINC01980與LIN28B蛋白的結合序列及具體作用機制尚不明確，是后續(xù)研究重點。

綜上，LINC01980 在宮頸癌中過表達，沉默LINC01980 能夠抑制宮頸癌Hela 細胞生長，可能與LINC01980 調控LIN28B 有關。但本研究僅通過生物學分析及體外細胞實驗探討了LINC01980可能通過調控LIN28B 影響宮頸癌Hela 細胞生長，需在體內進一步驗證，且LINC01980 是否通過其他途徑影響宮頸癌Hela細胞生長有待后續(xù)研究。