肖丹丹 喻雙雪 梁玉靈 羅 丹 王文軍 （西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，瀘州 646000）

肺癌是全球最多的惡性腫瘤，也是癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一。非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）占80%以上，根據(jù)組織學(xué)主要分為兩類：肺腺癌（lung adenocarcinoma，LUAD）和肺鱗狀細胞癌（lung squamous cell carcinoma，LUSC），其中LUAD 為最常見的組織學(xué)亞型［1］。關(guān)于LUAD的新型治療方式越來越多，療效隨之提高，但肺癌的五年生存率為4%～17%［2］。因此，有必要通過多數(shù)據(jù)庫基因網(wǎng)絡(luò)探索治療LUAD 的新型靶點及尋找可以用于診斷及治療的新型標(biāo)志物。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，鐵代謝紊亂與肺癌的發(fā)生、發(fā)展、免疫逃避和耐藥性有關(guān)［3-5］。鐵是人體必需的微量元素，參與多種生理和細胞過程。此外，多種形式的細胞死亡（包括凋亡、壞死、鐵死亡等）也被證實與鐵水平有關(guān)［4-5］。

BOLA2 是BOLA 蛋白家族成員之一，作為鐵伴侶胞質(zhì)蛋白參與細胞內(nèi)鐵調(diào)控途徑及含鐵/硫簇蛋白（Fe/S 簇）的成熟，維持鐵穩(wěn)態(tài)［6-7］。近年來，研究發(fā)現(xiàn)BOLA2 在肝癌、卵巢癌中表達失調(diào)，并與患者預(yù)后密切相關(guān)［8-9］。BOLA2可能參與癌癥的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移過程。然而，BOLA2在LUAD中的表達模式和作用尚未闡明。本研究采用多種數(shù)據(jù)庫初步分析BOLA2 在LUAD 中的表達及臨床意義，并探討 BOLA2 可能參與的通路及在免疫微環(huán)境中的作用，以期尋找新的治療靶點和新型診斷及預(yù)后標(biāo)志物。

1 材料與方法

1.1 BOLA2 mRNA 差異表達分析 Oncomine 數(shù)據(jù)庫用于分析BOLA2 在多種癌癥中的差異表達。本研究分析BOLA2 在LUAD 與相鄰正常組織中的表達差異。篩選條件如下：①Gene：BOLA2；②Analysis type： cancervsnormal analysis；③Cancer type：lung cancer；④P＜0.05；Fold change：＞1.5；Gene ranking：top 10%；data type：mRNA。

1.2 探討B(tài)OLA2 表達量與臨床特征的關(guān)系 本研究通過UALCAN 分析BOLA2 在LUAD 中的表達量及其與臨床特征（如年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期、TP53 突變等）的關(guān)系。同時，探討B(tài)OLA2 在LUAD中的蛋白表達和甲基化水平。

1.3 BOLA2 表達對LUAD 患者預(yù)后的影響 采用Kaplan-Meier 數(shù)據(jù)庫分析BOLA2 與LUAD 總生存期（OS）、無進展生存期（FP）、進展后生存期（PPS）的關(guān)系。將BOLA2表達情況以中位數(shù)為臨界值分為高、低表達兩組。同時多因素Cox 回歸分析再次認證評估危險比（HR）、95%可信區(qū)間（CI）和log-rankP值。

1.4 相關(guān)基因篩選及KEEG 通路分析 通過LinkedOmics 中的LinkFinder 模 塊，在TCGA LUAD隊列（LUAD，n=515）中，篩選與BOLA2 相關(guān)的正負表達基因，并進一步利用LinkInterpreter 模塊分析KEEG 通路，選擇參數(shù)包括富集分析：KEEG pathway；錯誤率 （FDR）＜0.05；模擬500次。

1.5 BOLA2 與免疫細胞浸潤的關(guān)系 利用TISIDB數(shù)據(jù)庫中的Lymphocyte 模塊分析BOLA2 表達水平與各種免疫細胞浸潤之間的關(guān)系，并展示與BOLA2表達顯著相關(guān)的免疫細胞浸潤情況。

2 結(jié)果

2.1 BOLA2 在LUAD 中的mRNA 表達 Oncomine數(shù)據(jù)庫分析表明，共有314 個研究比較了BOLA2 在癌癥組織與正常組織中的表達差異，其中有83項研究表明BOLA2 在腫瘤組織中過表達，僅在7 項研究中低表達。16 項研究中發(fā)現(xiàn)，與癌旁組織比較，肺癌組織中BOLA2 mRNA 均表達升高。進一步分析BOLA2 在LUAD 的表達情況表明，共有8 項研究分析LUAD 與癌旁組織的BOLA2 mRNA 表達，統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)BOLA2 在LUAD 中呈高表達（P=0.002）。如圖1、表1 所示，在多項研究中發(fā)現(xiàn)，LUAD 組織中BOLA2表達量升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖1 BOLA2 mRNA在不同癌癥中的表達水平Fig.1 mRNA expression levels of BOLA2 in different types of cancers

表1 LUAD中BOLA2 mRNA的表達水平（Oncomine）Tab.1 mRNA expressions of BOLA2 in LUAD （Oncomine）

2.2 BOLA2 表達量與LUAD 患者臨床特征之間的關(guān)系 利用UALCAN 數(shù)據(jù)庫研究BOLA2 與515 例LUAD 患者年齡、吸煙狀態(tài)、分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及TP53 突變之間的關(guān)系，結(jié)果顯示，BOLA2 較正常對照組而言，在LUAD 中呈高表達，與Oncomine 結(jié)果一致（圖2A、2B）。如圖2C，在年齡亞組分析中發(fā)現(xiàn)，中青年（21～40歲、41～60歲）的LUAD患者BOLA2 mRNA 表達量高于老年患者（61～80 歲、81～100 歲），說明BOLA2 表達水平可能在中青年患者中更高（BOLA2 在年齡亞組中有232 例患者年齡資料未獲得）。BOLA2 與患者吸煙狀態(tài)之間也相關(guān)（圖2D），吸煙的LUAD 患者中BOLA2 表達量高于未吸煙及既往吸煙的肺癌患者（BOLA2在吸煙亞組中有19例患者吸煙狀態(tài)未獲得）。對于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況，N0、N1、N2 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的BOLA2 表達水平顯著高于正常對照組，在N3 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的LUAD 患者中表達量最高（圖2E），提示BOLA2 可能與較差的臨床特征相關(guān)（BOLA2 在淋巴轉(zhuǎn)移亞組中有1 例患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移資料未獲得，另外11例患者無法評估有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移）。無論TP53 是否突變，在LUAD 中，BOLA2 表達升高（圖2F），并在TP53 突變患者中表達更為顯著（BOLA2在TP53 亞組其中有3 例患者樣本沒有完整的外顯子組測序數(shù)據(jù)）。但在分期亞型中，各分期中BOLA2 表達量高于正常對照組，但各分期間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

圖2 BOLA2表達與LUAD患者臨床特征的相關(guān)性Fig.2 Relationship between BOLA2 expression and clinic characteristics in patient with LUAD

2.3 BOLA2蛋白表達及甲基化水平 通過UALCAN數(shù)據(jù)庫進一步分析，與正常肺組織相比，BOLA2蛋白表達水平在LUAD 仍呈高表達，見圖3A。與BOLA2 mRNA 過表達結(jié)果一致，說明過表達的BOLA2 可能成為LUAD 診斷的新型標(biāo)志物。在LUAD 患者中，BOLA2 基因甲基化水平較正常肺組織中升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001，圖3B），BOLA2 在LUAD中高表達可能是異常甲基化所致。

圖3 BOLA2在LUAD患者中的蛋白表達和甲基化水平Fig.3 Protein expression and methylation level of BOLA2 in patients with LUAD

2.4 BOLA2表達量與LUAD患者生存期的關(guān)系 綜合上述結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LUAD 患者中，BOLA2 的mRNA和蛋白表達均高于正常對照組，進而研究BOLA2表達量與719 例LUAD 患者預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果顯示，高表達的BOLA2 可預(yù)測LUAD 患者較差的OS、FP 以及PPS（圖4）。本研究利用多因素Cox 回歸模型評估BOLA2 表達水平與LUAD 患者總預(yù)后的關(guān)系，納入腫瘤分期、性別、吸煙狀態(tài)等因素，發(fā)現(xiàn)過表達的BOLA2 是LUAD 患者預(yù)后的獨立危險因素（P=0.000 5，HR=2.32，表2）。

圖4 BOLA2與LUAD患者生存期的關(guān)系Fig.4 Relationship between BOLA2 and survival of patients with LUAD

表2 肺腺癌患者預(yù)后的多因素分析Tab.2 Multivariate analysis of prognosis in patients with LUAD

2.5 相關(guān)基因篩選 如圖5 所示，在TCGA_LUAD數(shù)據(jù)集中，與BOLA2 共表達的顯著正相關(guān)基因共 6 004 個，負相關(guān)基因共7 153 個。據(jù)熱圖顯示，PPP4C、POP7、ROMO1、MRPS12、MRPL12 與BOLA2呈顯著正相關(guān)，KIAA1109 與BOLA2 呈顯著負相關(guān)。對相關(guān)基因進行KEEG 通路分析，結(jié)果表明，相關(guān)基因主要富集于核糖體、蛋白酶體、嘌呤嘧啶代謝、剪接體、DNA 復(fù)制、真核生物中的核糖體生物發(fā)生、碳代謝、谷胱甘肽代謝等通路過程，表明BOLA2 可能通過影響代謝通路、生物合成等過程，促進LUAD 的發(fā)生、發(fā)展。

圖5 LUAD患者中BOLA2的共表達基因Fig.5 Co-expressed genes of BOLA2 in patients with LUAD

2.6 在LUAD 中BOLA2 表達量與免疫細胞浸潤的關(guān)系 多種癌癥中發(fā)現(xiàn)鐵代謝與腫瘤免疫微環(huán)境密切相關(guān)，進一步分析BOLA2表達與免疫細胞之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)BOLA2表達與多種癌癥微環(huán)境中的免疫浸潤水平存在聯(lián)系。LUAD 患者中，BOLA2 表達水平與多種免疫細胞相關(guān)。如圖6 所示，BOLA2 表達與自然殺傷細胞（NK，RHO=-0.359，P=2.79e-17）、肥大細胞（Mast，RHO=-0.341，P=2.17e-15）、未成熟B 細胞（Imm_B，RHO=-0.289，P=2.72e-11）、效應(yīng) 記 憶CD4T 細 胞（Tem_CD4，RHO=-0.263，P=1.4e-9）呈顯著負相關(guān)。

圖6 BOLA2表達與免疫細胞浸潤的關(guān)系Fig.6 Relationship between BOLA2 expression and immune cell infiltration

3 討論

在許多國家中LUAD 的發(fā)病率及病死率位于惡性腫瘤的前列，嚴重影響人類生活質(zhì)量及生命［1］。然而，LUAD 的傳統(tǒng)治療方式、靶向治療以及免疫治療尚未達到理想的療效，有必要探索新型的標(biāo)志物及治療靶點。越來越多的證據(jù)表明，多種癌癥（包括肺癌）中存在鐵代謝紊亂［3，10］。鐵是合成鐵硫簇（Fe/S 簇）的重要元素，而Fe/S 簇參與多種重要生物酶合成，這些酶在細胞呼吸、氧化代謝、核苷酸代謝、DNA 復(fù)制及修復(fù)等過程中起到重要的作用［11］。高濃度的鐵和含F(xiàn)e/S 簇的酶能顯著促進腫瘤細胞生長［10］。鐵水平與Wnt、Myc 以及缺氧誘導(dǎo)因子等致癌及促癌信號通路相關(guān)［12］。研究發(fā)現(xiàn)，在NSCLC細胞中，高濃度鐵可通過干擾細胞氧化應(yīng)激，誘導(dǎo)癌癥干細胞亞群形成，促進癌細胞增殖及轉(zhuǎn)移［13］。因此，癌細胞比正常細胞對鐵的依賴性更強。

鐵伴侶蛋白BOLA2 可與GLRX3 形成［2Fe-2S］橋接的異二聚體復(fù)合物，連接細胞中的亞鐵和鐵硫分配系統(tǒng)，是細胞內(nèi)鐵穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子［5-6］。近年來，多項研究表明，BOLA2 表達與肺部疾病有關(guān)。在高空氣污染地區(qū)，BOLA2 表達與兒童哮喘之間存在關(guān)聯(lián)，并對比哮喘與非哮喘患者，氣道上皮細胞中BOLA2 有顯著差異性表達［14］。呼吸道合胞病毒感染人支氣管和小氣道上皮細胞后會上調(diào)BOLA2表達［15］。此外，BOLA2 在癌癥中也發(fā)揮著重要作用。BOLA2 可通過干擾P62-Keap1-Nrf2 通路，參與肝癌細胞自噬和氧化應(yīng)激過程，維持肝癌細胞增殖、侵襲［7］。BOLA2 也能促進肝癌致癌基因Myc 的表達［16］。高表達的BOLA2 可預(yù)測肝癌伴腫瘤出血患者的不良預(yù)后。在卵巢癌中，BOLA2 呈過表達，與癌癥患者的較差臨床特征及預(yù)后顯著相關(guān)［7-8］。然而BOLA2 在NSCLC 中的作用機制及預(yù)后價值尚未闡明。

本研究通過生物信息學(xué)方法對BOLA2 在NSCLC 中的轉(zhuǎn)錄水平、預(yù)后價值和潛在作用進行全面研究?；贠ncomine 和UALCAN 數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，BOLA2 在乳腺癌、肝癌、淋巴瘤、前列腺癌等多種癌癥中均呈過表達，兩個數(shù)據(jù)庫相互驗證發(fā)現(xiàn)，LUAD患者中的BOLA2 表達量均高于正常對照組，并與LUAD 患者的臨床特征相關(guān)。BOLA2 在吸煙、TP53突變、N3 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的LUAD 患者中表達升高。既往研究表明，上述因素已被證明是LUAD 不良預(yù)后的因素，說明BOLA2 可能為LUAD 的促癌基因［17-18］。從蛋白水平研究發(fā)現(xiàn)，111 例LUAD 患者的BOLA2蛋白表達水平高于正常對照組。另外，從基因甲基化水平發(fā)現(xiàn)，BOLA2 的甲基化水平較正常對照組明顯升高。既往研究發(fā)現(xiàn)，異常甲基化表達發(fā)生于腫瘤早期，并隨著腫瘤進展而增加［19］。一項研究也表明，BOLA2 基因高甲基化水平與哮喘患者對激素的反應(yīng)性相關(guān)［14］。因此，BOLA2 甲基化修飾改變可能與LUAD 的起始、進展相關(guān)。生存分析顯示，過表達的BOLA2 與LUAD 患者短的生存期顯著相關(guān)。綜上所述，在LUAD患者中，BOLA2在轉(zhuǎn)錄及蛋白表達水平均呈高表達，可能參與LUAD 的發(fā)生發(fā)展，是LUAD預(yù)后的一個不利因素。

進一步探究BOLA2 在LUAD 中潛在的作用機制，使用LinkedOmics 數(shù)據(jù)庫分析得到與BOLA2 呈顯著正相關(guān)的基因（如PPP4C、POP7、ROMO1、MRPS12、MRPL12 等），這些基因認為與癌癥的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及侵襲相關(guān)［20-22］。此外，利用相關(guān)基因進行KEEG 通路分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BOLA2 相關(guān)基因參與的通路可能包括核糖體、真核生物中的核糖體生物發(fā)生、蛋白酶體、嘌呤嘧啶代謝等，這些通路均被報道參與了腫瘤的發(fā)生。如核糖體數(shù)量的增加和修飾的改變均驅(qū)動腫瘤發(fā)生。核糖體生物發(fā)生能維持腫瘤細胞生長和增殖［23］。蛋白酶參與受損蛋白質(zhì)降解，調(diào)節(jié)細胞周期及轉(zhuǎn)錄蛋白，干擾凋亡、Wnt 通路等過程，在多種癌癥中發(fā)揮作用［24］。在癌癥進展過程中，鐵代謝紊亂可干擾免疫應(yīng)答，導(dǎo)致腫瘤細胞免疫逃逸。在LUAD 中，高表達BOLA2 與多種免疫淋巴細胞減少相關(guān)。既往研究表明，免疫微環(huán)境中免疫淋巴細胞減少與LUAD 患者不良預(yù)后相關(guān)［25］，說明過表達BOLA2 的LUAD 患者預(yù)后不良可能是免疫細胞被抑制所致。BOLA2 在免疫微環(huán)境中的作用如何，以及能否聯(lián)合免疫治療作為新型治療靶點需要進一步研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，過表達BOLA2 可能介導(dǎo)LUAD 的發(fā)生和進展，影響免疫細胞浸潤水平，并與不良預(yù)后相關(guān)，可能是新的預(yù)后指標(biāo)和潛在的治療靶點。這些發(fā)現(xiàn)利于理解BOLA2 在LUAD 中的作用，但對其致癌機制的分析和新型藥物研究需進一步探討。