張妤亭 張 敏 王歆瑋 吳海燕 黃維金 王佑春 鄭源強(qiáng) 石艷春 陳國(guó)江

（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)內(nèi)蒙古自治區(qū)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 呼和浩特 010058）

埃博拉病毒病（Ebola virus disease，EVD）是由埃博拉病毒（Ebola virus，EBOV）感染導(dǎo)致的一種致命的急性傳染病，潛伏2～21 d 后出現(xiàn)癥狀，并導(dǎo)致嚴(yán)重的全身疾病，病死率為25%～90%［1］。EBOV 屬于絲狀病毒科EBOV屬，該病毒屬由扎伊爾EBOV等6個(gè)亞種組成［2-3］。EBOV是單股負(fù)鏈RNA病毒，基因組約19 kb，共編碼7 種蛋白：核蛋白（nucleoprotein，NP）、聚合酶輔助因子VP35、基質(zhì)蛋白VP40、糖蛋白（glycoprotein，GP）、轉(zhuǎn)錄因子VP30、核衣殼相關(guān)蛋白VP24、RNA 依賴的RNA 聚合酶L［4］。GP 是由GP1-GP2 異源二聚體組成的同源三聚體跨膜糖蛋白，被宿主蛋白酶切割為GP1 和GP2 兩個(gè)亞基［5］。其中GP1介導(dǎo)病毒附著及受體結(jié)合，GP2促進(jìn)膜融合［6-7］。

EBOV自1976年首次發(fā)現(xiàn)以來已引起多次暴發(fā)流行，也是引發(fā)疫情的主要病原體［8］。大量人與人傳播為EBOV 提供了適應(yīng)人類宿主的機(jī)會(huì)。對(duì) 2013-2016 年埃博拉流行過程的監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示， EBOV Makona 整個(gè)基因組發(fā)生了突變［9-11］。雖然在流行期間檢測(cè)到的大多數(shù)非同義突變可能對(duì)病毒的適應(yīng)度影響不大，但其中一些突變可能增強(qiáng)了EBOV 在人類之間的傳播。GP 蛋白的微小變化可以影響其介導(dǎo)病毒進(jìn)入不同哺乳動(dòng)物細(xì)胞的能力［12］。82V 是突變頻率較高的一株突變體，在疫情早期出現(xiàn)并在傳播中占主導(dǎo)，感染率迅速超過了母本Makona EBOV［13］。此外，一些研究人員將感染增強(qiáng)歸因于I544，其通過增加周圍氨基酸疏水性穩(wěn)定GP 結(jié)構(gòu)，對(duì)病毒-宿主膜融合至關(guān)重要［6，14-15］。有研究人員通過比較2013～2016年西非埃博拉爆發(fā)期間的1 610 個(gè)EBOV-Makona 病毒全長(zhǎng)基因組序列，發(fā)現(xiàn)一些突變體在感染A549、Huh7 和BEAS-2B 細(xì)胞時(shí)感染力均有不同程度增強(qiáng)，其中A82V-I371V、

A82V-T230A、R29K-A82V、A82V-T206M、N107DP330S-G480D 和A82V-P202L-L239S 感 染 力 明 顯 增強(qiáng)［16］。此外，研究者將病毒在Vero E6 中連續(xù)傳代獲得D552N 和I584L 突變體，突變后的病毒復(fù)制能力提高［17］。因此對(duì)于突變體的治療尤為重要。

單克隆抗體由于其特異性以及高效性成為抗埃博拉藥物研發(fā)的重要目標(biāo)。目前已有1個(gè)單抗和2 個(gè)抗體雞尾酒療法——mAb114、ZMapp 和REGNEB3 進(jìn)入臨床研究，均靶向GP 蛋白［18-21］。mAb114、ADI-15946、rEBOV-520是從幸存者血液中分離出來的 單 抗［19，22-23］。其 中mAb114 主 要 作 用 于GP1 的RBD區(qū)，在非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物感染EBOV 5 d后仍能夠提供保護(hù)作用［24］。ADI-15946 和rEBOV-520 主要識(shí)別GP2，并對(duì)EBOV等3類假病毒均具有中和能力。

本實(shí)驗(yàn)室利用pSG3.ΔEnv.CMV.Fluc HIV骨架載體建立了含螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因的EBOV 系統(tǒng)，由于該重組質(zhì)粒缺失HIV 的Nef、Env 和Vpr 基因，包裝的假病毒僅能一次感染，無復(fù)制能力，可以在P2實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，肝、腎、肺是感染EBOV 早期重要的靶器官［25-28]。因此選擇在Huh7、HEK293T 和A549 三個(gè)不同來源的細(xì)胞系上進(jìn)行假病毒感染實(shí)驗(yàn)。另外考慮到單核巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞是EBOV 感染靶細(xì)胞之一［25]，因此在THP-1細(xì)胞中評(píng)價(jià)了14 株埃博拉突變體假病毒的感染能力，并對(duì)3 株抗埃博拉抗體（mAb114、ADI-15946、 rEBOV-520）的功能活性進(jìn)行檢測(cè)，為應(yīng)對(duì)EBOV 突變提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料 HEK293T、Huh7、A549、THP-1 細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存；HIV 骨架質(zhì)粒pSG3. ΔEnv. CMV.Fluc、EBOV（Genbank：A0A068J419）及 其 突 變 體A82V、T544I、D552N、A82V-D552N、A82V-T544ID552N、A82V-T230A 和A82V-I371V GP 表達(dá)質(zhì)粒由中國(guó)食品藥品檢定研究院惠贈(zèng)；N107D-P330SG480D 和A82V-P202L-L239S 由蘇州金唯智生物 科技有限公司合成；EBOV 單抗（rEBOV-520、ADI-15946、mAb114）由本實(shí)驗(yàn)室制備和保存；大腸桿菌TOP10 感受態(tài)細(xì)胞（北京擎科生物科技有限公司）；基因合成及測(cè)序由蘇州金唯智生物科技有限公司完成；無內(nèi)毒素大提試劑盒（貨號(hào)：W9811，北京天根生物科技有限公司）；DMEM培養(yǎng)基（貨號(hào)：8121489，Gibco 公司）；胎牛血清（貨號(hào)：20190816，天津康源生物技術(shù)有限公司）；轉(zhuǎn)染試劑jetPRIME（貨號(hào)：25Y1801N5，Polyplus-transfection 公司）；HIV-1 p24抗原定量檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)：K12P2401，北京科躍中楷生物技術(shù)有限公司）；Bright-LumiTM Ⅱ螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)：082521211008，碧云天生物技術(shù)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 埃博拉突變體GP 表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建 T544ID552N、A82V-I584L、R29K-A82V、A82V-T206M 突變體為overlap PCR 合成。以A82V 和D552N-T544I質(zhì)粒為模板，通過2 對(duì)（p-up+p2 和p-down+p1）引物擴(kuò)增含有突變位點(diǎn)的2 個(gè)片段（PCR 引物見表1）。擴(kuò)增條件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，共30 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。膠回收對(duì)應(yīng)產(chǎn)物，分別取200 ng 不加任何引物先擴(kuò)增3 個(gè)循環(huán)。再加引物p-up 和p-down 進(jìn)行擴(kuò)增，膠回收2 kb 大小擴(kuò)增產(chǎn)物，產(chǎn)物經(jīng)酶切過夜，克隆GP表達(dá)載體pcDNA3.1。

表1 突變株引物Tab.1 Mutant strain primers

1.2.2 假病毒制備 接種HEK293T 于10 cm 細(xì)胞培養(yǎng)皿，待細(xì)胞密度達(dá)到60%～80%時(shí)按照jetPRIME轉(zhuǎn)染試劑說明書，將GP 或突變體GP-pcDNA3.1 表達(dá)質(zhì)粒與pSG3.ΔEnv.CMV.Fluc 質(zhì)粒按照1∶4 的比例共轉(zhuǎn)染HEK293T 細(xì)胞，48 h 后取培養(yǎng)上清。4 ℃下3 000 r/min 離心10 min，上清經(jīng)0.45 μm 濾膜過濾，分裝凍存于-80 ℃。

1.2.3 假病毒定量及鑒定 將25 μl生物素標(biāo)記的多克隆抗體加入到預(yù)先包被p24單克隆抗體的酶標(biāo)板，隨后加入500、5 000 倍稀釋的假病毒樣品以及校準(zhǔn)品（75 μl/孔），37 ℃孵育1 h。洗板后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素（HRP-SA），37 ℃孵育30 min，最后加入HRP 底物顯色液進(jìn)行顯色，測(cè)定OD450。根據(jù)校準(zhǔn)品做標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算假病毒原液的p24抗原濃度，按照該濃度對(duì)突變體進(jìn)行定量。按照定量結(jié)果將EBOV GP 和VSV 假病毒的上清感染293T 細(xì)胞，36 h 后收取細(xì)胞上清，將VSV 假病毒感染的細(xì)胞作為對(duì)照，假病毒中的p24 作為內(nèi)參。在收取的細(xì)胞上清中加5×Loading Buffer，沸水浴 10 min。采用12%的預(yù)制膠進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳，室溫恒壓160 V，蛋白分離后轉(zhuǎn)至PVDF 膜。采用5%脫脂牛奶室溫封閉置于搖床1 h，再采用5%的牛奶孵育mAb114 和p24 抗體4 ℃過夜。TBST 洗膜3 次后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h。TBST洗膜3遍后ECL顯影。

1.2.4 假病毒感染細(xì)胞實(shí)驗(yàn) 將假病毒用無血清的DMEM 按照p24 定量結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化進(jìn)行稀釋，保證各突變體投入病毒量一致。設(shè)置復(fù)孔，分別感染HEK293T、Huh7、A549 和THP-1 細(xì)胞。向96 孔板中加入HEK293T、Huh7、A549、THP-1細(xì)胞3×104個(gè)/孔，假病毒和細(xì)胞各100 μl/孔，設(shè)置未加假病毒的孔為陰性對(duì)照。置于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育36 h后，每孔棄去100 μl上清，加入100 μl螢火蟲熒光素酶底物，避光反應(yīng)5 min 后測(cè)熒光素酶活性。將測(cè)出的結(jié)果中母本EBOV的發(fā)光值比作1，計(jì)算各突變體感染值的倍數(shù)變化。

1.2.5 抗體中和實(shí)驗(yàn) 采用無血清的DMEM 將假病毒進(jìn)行40 倍稀釋、抗體稀釋為高、中、低3 個(gè)濃度，同時(shí)設(shè)置未加抗體組。將稀釋的假病毒（50 μl）與相應(yīng)濃度的抗體（50 μl）加入96 孔板，預(yù)先置于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1 h，再加入3×104個(gè)/孔HEK293T 細(xì)胞，終體系200 μl。置于37 ℃培養(yǎng)箱孵育36 h后，每孔棄去100 μl上清，加入100 μl螢火蟲熒光素酶底物，避光反應(yīng)5 min 后測(cè)熒光素酶活性。計(jì)算抑制率，抑制率（%）=(未加抗體組發(fā)光強(qiáng)度-樣品組發(fā)光強(qiáng)度)/未加抗體組發(fā)光強(qiáng)度×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS25.0 軟件處理分析，數(shù)據(jù)表示為±s，兩組間比較采用t檢驗(yàn)分析，使用GraphPad Prism 8.0 軟件作圖并分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 埃博拉突變體GP 表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 Overlap PCR 產(chǎn)物經(jīng)BamHⅠ和XbaⅠ酶切位點(diǎn)克隆于載體pcDNA3.1，瓊脂糖凝膠電泳酶切鑒定顯示正確插入（圖1），GP 大小約為2 000 bp，pcDNA3.1 大小為 5 428 bp。利用通用引物BGH-R 或T7 引物進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示突變體質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖1 埃博拉突變體經(jīng)BamHⅠ/XbaⅠ雙酶切鑒定Fig.1 EBOV was identified by BamHⅠ/XbaⅠ

2.2 假病毒制備及鑒定 為了進(jìn)一步驗(yàn)證收取的上清為含有EBOV GP 的假病毒，采用特異的抗GP單抗mAb114 和p24 抗體進(jìn)行Western blot 檢測(cè)，結(jié)果顯示：上清中可檢測(cè)到EBOV GP 約為150 kD，p24大小約為25 kD（圖2），證實(shí)GP 表達(dá)質(zhì)粒與pSG3.ΔEnv.CMV.Fluc 共轉(zhuǎn)染HEK293T 細(xì)胞后成功包裝出埃博拉假病毒。

圖2 Western blot檢測(cè)EBOV GP表達(dá)Fig.2 Detection of EBOV GP expression by Western blot

2.3 EBOV 及其突變體假病毒感染細(xì)胞實(shí)驗(yàn) 將含有EBOV 的假病毒上清10 倍稀釋后，感染HEK293T、Huh7、A549細(xì)胞，36 h后進(jìn)行熒光素酶檢測(cè)，結(jié)果顯示，埃博拉假病毒對(duì)3個(gè)細(xì)胞系均具有感染力（圖3）。

圖3 EBOV 假 病 毒 和pSG3. ΔEnv. CMV. Fluc 感 染 的HEK293T、Huh7和A549細(xì)胞熒光素酶活性Fig.3 Luciferase activity of EBOV pseudovirus and HEK293T，Huh7 and A549 cells infected by pSG3.ΔEnv.CMV.Fluc

經(jīng)EBOV 及突變體假病毒p24 含量測(cè)定和 EBOV GP與p24比例進(jìn)行GP定量后，將突變體假病毒的GP 含量調(diào)整為一致，分別感染HEK293T、Huh7、A549和THP-1細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)多點(diǎn)聯(lián)合突變?cè)鰪?qiáng)了病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞的效率，突變體較母本感染力增強(qiáng)，且在不同細(xì)胞系呈現(xiàn)不同感染力。假病毒感染HEK293T 細(xì)胞的感染力較母本增強(qiáng)2 倍及以上的有T544I、D552N、A82V-T544I、T544I-D552N、A82V-D552N、A82V-T544I-D552N、A82V-I371V、A82VI584L、A82V-P202L-L239S（圖4A）。在Huh7 細(xì)胞中感染力較母本增強(qiáng)2 倍及以上的有T5440I、D552N、A82V-T544I、T544I-D552N、A82V-D552N、A82VT544I-D552N、A82V-T230A、A82V-I371V、A82VI584L、R29K-A82V（圖4B）。在A549 和THP-1 細(xì)胞上的感染值較HEK293T 和Huh7 細(xì)胞低，感染力增強(qiáng)2 倍 的 分 別 為T544I、A82V-T544I、A82V-T544ID552N、A82V-I371V、A82V-I584L、A82V-T206M 和D552N、A82V-T544I、A82V-D552N、A82V-T544ID552N、A82V-I371V（圖4C、4D）。對(duì)原代NK 細(xì)胞、Jurkat 和Raji 細(xì)胞進(jìn)行了評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示，感染值較低且突變株和母本間感染性差異不明顯。

圖4 EBOV及突變體假病毒感染細(xì)胞的倍數(shù)變化Fig.4 Fold change of EBOV and mutants pseudovirus infected cells

2.4 抗體中和實(shí)驗(yàn) 為了檢測(cè)EBOV 突變是否導(dǎo)致抗體逃逸，對(duì)3 株單抗mAb114、ADI-15946、rEBOV-520的中和活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示，相比于母本，rEBOV-520 對(duì)大多數(shù)天然及傳代所致的高侵襲性突變體均有中和活性，且具有量效關(guān)系。然而，rEBOV-520 對(duì)3 株 突 變 體（A82V-T544I-D552N、A82V-T230A、N107D-P330S-G480D）的中和作用減弱，尤其是對(duì)N107D-P330S-G480D 突變體中和作用顯著降低（圖5A）。ADI-15946 對(duì)4 株突變體（T544I、A82V-T230A、A82V-I371V、A82V-I584L）的中和作用減弱（圖5B）。然而，mAb114 不僅對(duì)所有被檢測(cè)的突變體中和作用沒有減弱，且對(duì)多個(gè)突變體（A82V、A82V-T544I、A82V-D552N、A82V-T544ID552N）的中和作用顯著增強(qiáng)，提示mAb114 可能是用于防治未來潛在的突變體感染較好的抗體藥物。

圖5 rEBOV-520、ADI-15946、mAb114中和EBOV及突變體假病毒Fig.5 rEBOV-520，ADI-15946，mAb114 neutralize EBOV and mutants pseudovirus

3 討論

本文基于含螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因的EBOV假病毒系統(tǒng)，在不同細(xì)胞系中比較了EBOV 假病毒母本及突變體的感染力。發(fā)現(xiàn)在肝和腎細(xì)胞系中突變體感染力均呈不同程度增強(qiáng)。有研究報(bào)道，突變株（A82V、T544I）與母本EBOV 相比GP 融合前構(gòu)象穩(wěn)定性降低，因此通過降低宿主因子組織蛋白酶B 和Niemann-Pick C1（NPC1）觸發(fā)的膜融合活性閾值而增強(qiáng)感染［29-31］。隨后采用3 株靶向單抗進(jìn)行功能評(píng)價(jià)，其中突變體N107D-P330S-G480D 中和作用顯著降低，原因可能是EBOV GP 的104、106、107、545-547、549位是rEBOV-520結(jié)合位點(diǎn)，該突變體的107 位突變導(dǎo)致抗體結(jié)合能力大大降低［22］。ADI-15946 對(duì)T544I、A82V-T230A、A82V-I371V、A82VI584L 的中和作用減弱，可能的原因是ADI-15946結(jié)合位點(diǎn)位于GP2，使抗體和突變株的結(jié)合受到影響［23］。而mAb114 對(duì)所有被檢測(cè)的突變體中和作用沒有減弱，且對(duì)多個(gè)突變體中和作用顯著增強(qiáng)的原因可能是A82V 位于受體結(jié)合區(qū)（RBD），RBD 高度保守，是mAb114 與GP 的結(jié)合位點(diǎn)［18］。因此推測(cè)突變發(fā)生在抗體表位附近時(shí)，抗體中和作用會(huì)受影響導(dǎo)致中和作用降低甚至失效，以此可根據(jù)抗體表位預(yù)測(cè)其對(duì)突變體的中和是否仍有效，這一推測(cè)需要后續(xù)更多的數(shù)據(jù)進(jìn)行驗(yàn)證。

由于EBOV 的致死率較高，且引發(fā)大規(guī)模流行的疫情頻次較低，目前，在感染人群中檢測(cè)到的突變有限。本文研究的14 株突變體包含了一些文獻(xiàn)報(bào)道的在細(xì)胞培養(yǎng)過程中篩選出的突變（T544I、D552N、I584L），后續(xù)如果有新的突變，可以用該評(píng)價(jià)體系快速對(duì)其感染性進(jìn)行檢測(cè)。本文的另一局限是對(duì)這些突變體僅進(jìn)行了3 株抗體的評(píng)價(jià)，其他抗體對(duì)突變株的作用有待進(jìn)一步研究，且本文的體外評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)仍有待在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中選取真病毒進(jìn)行驗(yàn)證。由于病毒在傳播中易產(chǎn)生突變，突變株能夠避開免疫系統(tǒng)的攻擊，突變后使現(xiàn)有的抗體失效，可以考慮多個(gè)單抗聯(lián)合使用彌補(bǔ)單一抗體作用不足，實(shí)現(xiàn)“1+1＞2”的效果。

EBOV 的高危性和暴發(fā)的不可預(yù)測(cè)性使絲狀病毒成為生物防御的研究重點(diǎn)，目前候選藥物中最有前景的方法之一是注射靶向EBOV GP 的單抗［32］。2020 年FDA 批準(zhǔn)了兩種靶向GP 的單抗藥物InmazebTM（REGN-EB3）和EbangaTM（mAb114）［33］，但這些單抗僅對(duì)EBOV 有效，SUDV 和BDBV 的治療藥物仍有待探索。