鄭仲華 黃鑫鑫 張 歡 鄒麗容 胡 瑤 李振翠 郭前方 劉美真 梁麗君 李柏生

（廣東省疾病預防控制中心，廣東新發(fā)突發(fā)傳染病防治工作站，廣州 511430）

2019年12月以來，湖北省武漢市部分醫(yī)院陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了多例不明原因的肺炎病例，并在隨后的1 個多月內蔓延至全國［1］。引起此次疫情的病原體隨后被命名為新型冠狀病毒，屬于套式病毒目冠狀病毒科冠狀病毒屬，是一種具有不規(guī)則形狀的線性單股正鏈RNA病毒，直徑60～220 nm。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹，冠狀病毒可分為α、β、γ 和δ 4 種，SARS-CoV-2 是可分為A、B、C和D等4種亞群的β屬冠狀病毒［2］。

目前應對新型冠狀病毒疫情的最有效方法是“早發(fā)現(xiàn)、早隔離、早診斷、早治療”［3］。2020 年3 月 3 日，國家衛(wèi)生健康委發(fā)布了《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第七版）》，第一次將新冠抗體檢測納入臨床輔助診斷標準，同時國家藥監(jiān)局也應急審批了廣州萬孚（膠體金試紙條）、英諾特（唐山）、博奧塞斯（重慶）和廈門萬泰（化學發(fā)光法）等多家企業(yè)的新冠抗體檢測試劑盒注冊申請［4］。本研究選取膠體金法和化學發(fā)光法分別檢測新冠抗體，通過與病毒中和試驗檢測中和抗體滴度進行比較，從靈敏度、特異度和Kappa值等方面進行評價，并比較新冠抗體檢測方法的優(yōu)缺點，為國內新冠肺炎疫情常態(tài)化防控（尤其是大規(guī)模人群免疫后血清抗體監(jiān)測），選取合適的抗體檢測方法提供參考。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 一般資料 根據(jù)《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第八版）》標準將2021年2月7日至2021年2月25日由廣東省內各地市上送至廣東省疾病預防控制中心的92 例樣本分為確診病例組（67 例）和健康對照組（25例）。

1.1.2 SARS-CoV-2 病毒株 來源于2020 年1 月 1 例有武漢旅行史的疑似新型冠狀病毒肺炎患者由廣東省疾病預防控制中心病原微生物檢驗所分的離肺泡灌洗液，實驗室編號為20SF014［5］。

1.1.3 試劑和儀器 新型冠狀病毒IgM/IgG 抗體檢測試劑盒（膠體金法，醫(yī)療器械注冊證編號/產品技術要求編號：國械注準20203400177，生產許可證號：冀食藥監(jiān)械生產許20150033號）購自英諾特（唐山）生物技術有限公司；化學發(fā)光免疫分析儀 Axceed 260 購自博奧賽斯（天津）生物科技有限公司；胎牛血清和MEM 培養(yǎng)基購自美國Gibco 公司；倒置顯微鏡購自日本Nikon 株式會社；二級生物安全柜購自美國賽默飛世爾科技公司；Moxi Z 便攜式自動細胞計數(shù)儀購自美國Orflo 公司；含5%CO2的37 ℃細胞培養(yǎng)箱購自德國BINDER 公司；Eppendorf 5804R高速冷凍離心機購自德國Eppendorf公司。

1.2 方法

1.2.1 樣本收集與處理 采集所有研究對象靜脈血5 ml，置于含分離膠的黃頭真空采血管內，室溫下靜置20 min，3 000 r/min、4 ℃離心10 min 后，將血清分裝至3 個EP 管，200 μl/管，56 ℃金屬浴30 min 滅活，分別利用化學發(fā)光免疫分析儀、SARS-CoV-2 IgG/IgM 抗體檢測試劑盒（膠體金法）和微量病毒中和抗體試驗檢測SARS-CoV-2 臨床確診患者血清中的抗體水平。

1.2.2 膠體金法測定 按照新型冠狀病毒IgM/IgG抗體檢測試劑盒說明書，采用免疫捕獲法原理檢測新型冠狀病毒IgM 抗體和IgG 抗體。打開檢測卡的鋁箔袋包裝，取出檢測卡平鋪，然后分別取10 μl 待測血清（或血漿）加至IgM 抗體和IgG 抗體檢測試劑的圓形樣本孔，再分別加80 μl（或兩滴）樣本稀釋液，室溫放置15 min觀察結果。IgM抗體和IgG抗體檢測試劑判讀窗口T 線和C 線位置出現(xiàn)清晰的紫紅色條帶，判讀為新型冠狀病毒IgM 抗體和IgG 抗體陽性；若僅在C線位置出現(xiàn)清晰的紫紅色條帶，判讀為新型冠狀病毒抗體陰性；若判讀窗口C 線無紫紅條帶為試驗無效，需重新檢測。

1.2.3 化學發(fā)光法測定 按照化學發(fā)光免疫分析儀 Axceed 260 說明書，先稀釋樣本，取15 μl 樣本血清和735 μl樣本稀釋液，使用旋渦混勻器混勻5 s后備用，IgM和IgG項目共用稀釋后的樣品。稀釋后的樣本上機檢測，首次出結果時間為47 min。結果解讀：S/CO=樣本發(fā)光值/cut-off 值（S 代表標本的OD值，CO即臨界值，是判斷檢測結果的標準）。S/CO＜1為陰性；S/CO≥1為陽性。建議盡快調查該患者的接觸史、發(fā)熱史、治療史，3～5 d 后再抽血復測IgM 和IgG抗體；S/CO介于0.7～1.0為灰區(qū)結果，建議3～5 d后再抽血復測。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS24.0軟件進行統(tǒng)計學分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。通過靈敏度、特異度、陰陽預測值、Kappa 值等篩檢評價指標對膠體金法和化學發(fā)光法兩種抗體檢測方法進行評價。

2 結果

2.1 病毒中和試驗結果 92 份樣本的微量病毒中和試驗∶新冠抗體滴度≥1∶4 者占比為72.83%（67/92），其中抗體最高滴度為1∶1 024，占比為3.26%（3/92），見表1。

表1 膠體金法和化學發(fā)光法檢測血清的結果（構成比）分布［例（%）］Tab.1 Distribution of results （constituent ratio） of serum detected by colloidal gold method and chemiluminescence method ［n（%）］

2.2 膠體金法檢測結果 92 份樣本中，新冠抗體陽性結果占比為52.17%（50/92），其中弱陽性結果占比為12.50%（6/48），見表2。

表2 膠體金法結果Tab.2 Results of colloidal gold method

2.3 化學發(fā)光法檢測結果 92 份樣本中，新冠抗體陽性結果占比為82.61%（76/92），其中IgM 陽性者占總陽性結果的44.74%（34/76），IgG 陽性者占總陽性結果的92.11%（70/76）；陰性占17.39%（16/92），見表3。

表3 化學發(fā)光法結果Tab.3 Results of chemiluminescence method

2.4 膠體金和化學發(fā)光法檢測結果比較 當以微量病毒中和抗體試驗的結果作為本研究的實驗室診斷金標準，膠體金法靈敏度小于化學發(fā)光法，但特異度大于化學發(fā)光法；兩種檢測方法的Kappa 值分別為0.525和0.721；膠體金法檢測新冠抗體的陰性預測值不如化學發(fā)光法，但陽性預測值較高，見表4。

表4 膠體金和化學發(fā)光法的檢測結果比較Tab.4 Comparison of detection results between colloidal gold kit and automatic chemiluminescence analyzer

3 討論

SARS-CoV-2 引起的新型冠狀病毒肺炎疫情已經在世界范圍內流行。截至2021年4月13日24時，國內累計治愈出院病例85 513 例，累計死亡病例 4 636 例，累計報告確診病例90 447 例［6］。同時，世界衛(wèi)生組織（WHO）統(tǒng)計，全球范圍累計確診病例136 996 364例，累計死亡病例2 951 832例［7］。

目前SARS-CoV-2 病原學檢測方法主要包括病毒核酸檢測和血清抗體檢測，核酸檢測作為新冠病毒確診的金標準，主要采用RT-PCR 方法檢測鼻咽拭子、痰液等呼吸道樣本中的病毒RNA，但此方法的檢測結果易受病程、標本采集和存儲、檢測過程等因素影響，且對實驗室條件也有較高要求，應當至少按照二級生物安全、三級防護條件從事相關核酸檢測工作［8-10］。因此，新冠抗體檢測手段可以很好地作為輔助性診斷方法，且能夠同時檢測特異性IgM 和IgG 抗體：檢測IgM 抗體有助于早期診斷新型冠狀病毒感染；檢測IgG 抗體有助于檢測出是否是既往感染或免疫后產生的抗體。疫苗是人類抵抗傳染病最為有效的手段，截至2020年11月12日，有164 種新冠疫苗正在開發(fā)，國內已有多款新冠疫苗被批準用于緊急使用，隨著疫苗大規(guī)模在人群中接種，導致抗體檢測方法均無法有效區(qū)分是既往感染還是免疫產生的抗體［8］。因此，國家新冠肺炎疫情防控方案規(guī)定抗體檢測需結合流行病學史、臨床表現(xiàn)和基礎疾病等情況進行綜合判斷［9］。

本研究表明，若以微量病毒中和抗體試驗結果為抗體檢測金標準時，化學發(fā)光法的靈敏度、Kappa值均高于膠體金法，提示化學發(fā)光法在檢測同一組樣本時較膠體金法更好［11］。與童偉等［4］對兩種免疫學檢測方法的應用評價結果不同。初步懷疑是因為膠體金法檢測對弱陽性結果靠肉眼判斷結果不穩(wěn)定，易受實驗者個人因素影響，導致靈敏度波動；由于新型冠狀病毒導致的疫情較為嚴重，根據(jù)試劑盒說明書，在試劑盒開發(fā)時更大程度地提高診斷靈敏度，避免因漏檢造成嚴重后果。通過試劑盒截斷值（即臨界值，是判斷檢測結果的標準）的設定提高靈敏度，不同區(qū)域的截斷值有一定程度差異，可能會出現(xiàn)因截斷值差異導致的假陽性；同時患者血清樣本中可能存在內源性干擾物質導致假陽性。

微量病毒中和抗體試驗應在三級生物安全條件下進行，雖然結果準確可信，但也存在試驗過程人為判斷細胞病變以及耗時耗力的缺點［10］。本研究結果表明，相較于中和試驗，膠體金法與化學發(fā)光法在抗體檢測方面各有其優(yōu)缺點。膠體金法的靈敏度和Kappa值一般，但其檢測過程方便快捷，尤其是對實驗室條件無嚴格要求，且用時較短，非常適合于基層相關檢測部門進行快速的大規(guī)模人群檢測?；瘜W發(fā)光法的靈敏度和Kappa 值較高，結果相對穩(wěn)定可靠且用時較短；但自動化設備價格較昂貴，操作也相對復雜，因此，在新冠抗體復檢或少量監(jiān)測樣本時，具有較高使用價值。

因本研究收集到的樣本數(shù)量有限，對SARSCoV-2 兩種免疫學檢測方法的應用評價還不夠全面，需要進一步收集更多樣本數(shù)據(jù)進行研究以完善相關評價機制。參考試劑盒說明書，膠體金法和化學發(fā)光法均只能定性檢測，無法檢測保護性抗體含量。鑒于我國正在進行大規(guī)模人群注射新冠疫苗，如若無法找到可替代的定量抗體檢測方法，將無法有效判定抗體的保護效果，因此，中和抗體試驗仍將被長期用于保護性抗體監(jiān)測。部分疫苗（如羊布魯氏菌病疫苗）免疫一段時間后，利用試管凝集試驗（SAT）和虎紅平板凝集試驗（RBT）基本無法檢測到凝集抗體，但ELISA法的抗體陽性率依然可觀［11］。因此，本研究為新冠疫苗免疫后抗體水平的監(jiān)測提供了一種新的思考方向，是否可于免疫后利用多種監(jiān)測手段對新冠抗體水平進行監(jiān)測，尤其是利用高靈敏度的檢測方法，而后再利用中和試驗進行保護性抗體監(jiān)測。當然，本課題組希望利用大數(shù)據(jù)樣本抗體監(jiān)測找到更好、更快、更方便的抗體檢測方法，用于替代復雜的病毒中和抗體試驗。