韓金承，孟 鑫，吳慎威，閆伊狄，陳瑞琦

（錦州醫(yī)科大學(xué)食品與健康學(xué)院，遼寧 錦州 121000）

氧化應(yīng)激反應(yīng)是指生物體氧化與抗氧化能力失衡的一種狀態(tài)[1]。當(dāng)生物體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)無法與過量自由基結(jié)合時，過量的自由基會從鄰近的分子（如蛋白質(zhì)、脂肪酸、核酸等）上奪取電子，使機體組織產(chǎn)生不可逆的損傷，從而引起一系列如衰老、動脈粥樣硬化、腫瘤等問題[2-3]。因此食用天然抗氧化成分是對抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的有效手段之一。

苦杏仁油是從薔薇科植物杏的成熟干燥種子中經(jīng)提取得到的一種營養(yǎng)價值極高的植物油脂，其脂肪酸組成中約60%為油酸（順式-9-十八烯酸）[4]?？茖W(xué)家們研究發(fā)現(xiàn)，油酸具有極佳的抗氧化、延緩衰老和清除自由基的能力[5-6]。因此研究苦杏仁油在抗氧化方面的作用具有一定的實際應(yīng)用價值。

目前常用的抗氧化能力測試方法有體外測試法和體內(nèi)測試法。體外測試法主要是測定物質(zhì)對1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（DPPH·）、超氧陰離子自由基（）、羥自由基（·OH）等自由基的清除能力[7]；體內(nèi)測試法主要是通過建立動物模型，測定血清或部分器官中抗氧化酶類的活性和氧化代謝產(chǎn)物的含量來判斷物質(zhì)的抗氧化能力[8]。體外試驗具有反應(yīng)迅速、試驗周期短等優(yōu)點，但難以反映出體內(nèi)真實的抗氧化水平；體內(nèi)試驗可以較準(zhǔn)確地反映機體真實的抗氧化能力。本研究先通過體外試驗測試苦杏仁油對自由基的清除能力和總還原能力，再通過體內(nèi)試驗測試苦杏仁油對小鼠血清中超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量的影響，綜合判斷苦杏仁油的抗氧化能力。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

苦杏仁：購于錦州中藥材市場；堿性蛋白酶：酶活性2×105U/g，購自南寧龐博生物工程有限公司；雄性昆明小鼠40 只（SPF 級、4 周齡），體重（20±3）g，由錦州醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供（生產(chǎn)許可證號：SCXK（遼）2019—0003；實驗許可證號：SYXK（遼）2019-0007）；飼養(yǎng)條件：空調(diào)房間，溫度20～25 ℃，相對濕度50%～60%，分籠飼養(yǎng)，自由飲水、進(jìn)食，每天更換墊料。

無水乙醇、無水甲醇、氫氧化鈉、鹽酸、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、Tris-HCl 緩沖溶液、鄰苯三酚、磷酸鹽緩沖液、硫酸亞鐵、過氧化氫、鐵氰化鉀、三氯乙酸、氯化鐵，均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；SPF 大小鼠生長繁殖飼料（許可證號：SCXK（京）2019—0003）、實驗動物玉米芯墊料：北京科澳協(xié)力飼料有限公司；總超氧化物歧化酶測定試劑盒（批號：A001-3-1）、丙二醛測定試劑盒（批號：A003-1-2）：南京建成生物工程研究所。

1.1.2 儀器與設(shè)備

DK-98-1 型恒溫水浴鍋，天津市泰斯特儀器有限公司；Sorvall Legend Micro21R 型離心機，賽默飛世爾科技公司；PHS-3C 型pH 計，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；UV-5100B 型紫外可見分光光度計，上海元析儀器有限公司；DHG-9140 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科技有限公司；MYP11-2A 型磁力攪拌器，上海酶穎浦儀器儀表制造有限公司；SuPerMax型光柵酶標(biāo)儀，上海閃譜生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 苦杏仁的預(yù)處理

將苦杏仁投入沸水中保溫10 min 后取出脫皮，按照料液比1∶12（g/mL）的比例加入蒸餾水，超聲處理60 min（55 ℃、300 W），取出后于100 ℃鼓風(fēng)干燥箱中干燥至恒重[9-10]。

1.2.2 苦杏仁油的提取

將預(yù)處理過的苦杏仁粉碎后，用40 目網(wǎng)篩篩選，按照料液比1∶8（g/mL）的比例加入體積分?jǐn)?shù)為20.5%的乙醇溶液混勻，調(diào)溶液pH 為9.5，向溶液中加入3.5%的堿性蛋白酶并混勻，于45 ℃、750 r/min 的條件下磁力攪拌酶解147 min，結(jié)束后將溶液置于90 ℃水浴鍋中水浴滅酶并揮發(fā)乙醇10 min，滅酶后的溶液于4 000 r/min 的條件下離心15 min，吸出油層。

1.2.3 苦杏仁油體外抗氧化試驗

1.2.3.1 苦杏仁油對DPPH 自由基的清除作用

用無水乙醇將苦杏仁油稀釋成濃度為0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mg/mL 的樣液待用，用蒸餾水將VC 稀釋成相同濃度并避光保存。空白管中加入2 mL 80% 甲醇溶液、3 mL 濃度為0.5 mmol/L 的DPPH甲醇溶液；測定管中加入2 mL 樣品液、3 mL 濃度為0.5 mmol/L 的DPPH 甲醇溶液；對照管中加入2 mL樣品液、3 mL 80%甲醇溶液，混勻后，在室溫條件下避光靜置30 min，于517 nm 處測定吸光值，無水乙醇調(diào)零[11]。DPPH 自由基清除率計算公式為：

式中：A測為測定管在波長517 nm 處的吸光度值；A對為對照管在波長517 nm 處的吸光度值；A空為空白管在波長517 nm 處的吸光度值。

式中：A測為測定管在波長325 nm 處的吸光度值；A對為對照管在波長325 nm 處的吸光度值；A空為空白管在波長325 nm 處的吸光度值。

1.2.3.3 苦杏仁油對·OH 的清除作用

采用Fenton 反應(yīng)測定苦杏仁油對·OH 的清除能力，以VC 為對照進(jìn)行試驗。試驗溶液配制：用無水乙醇將苦杏仁油稀釋成濃度為0.25、0.50、0.75、1.00、1.25 mg/mL 的樣液待用，用蒸餾水將VC 稀釋成相同濃度并避光保存。管中加入2.0 mL 濃度為0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液，1.5 mL 鄰二氮菲，空白管中加入1.0 mL 濃度為7.5 mmol/L 的硫酸亞鐵、5.5 mL 蒸餾水，對照管中加入1.0 mL 濃度為7.5 mmol/L 的硫酸亞鐵、4.5 mL 蒸餾水、1.0 mL 0.1% H2O2溶液，測定管中加入2.0 mL 濃度為7.5 mmol/L 的硫酸亞鐵、1.0 mL 樣品液、2.5 mL 蒸餾水、1.0 mL 0.1% H2O2溶液，將以上各管混勻，將各管置于37 ℃條件下保溫20 min，于510 nm 處測定吸光度，蒸餾水調(diào)零[13]?！H清除率計算公式為：

式中：A測為測定管在波長510 nm 處的吸光度值；A對為對照管在波長510 nm 處的吸光度值；A空為空白管在波長510 nm 處的吸光度值。

1.2.3.4 苦杏仁油還原力的測定

將苦杏仁油用無水乙醇稀釋成0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL 的樣液待用，用蒸餾水將VC 稀釋成相同濃度并避光保存。在離心管中加入1.0 mL 樣液和1.0 mL 濃度為0.2 mol/L 的磷酸鹽緩沖液（pH 6.6）混合，混勻后加入1.0 mL 1%的鐵氰化鉀溶液，混勻后于50 ℃水浴20 min 后冷卻，再加入1.0 mL 10%的三氯乙酸溶液，0.2 mL 0.1%的氯化鐵溶液和0.8 mL 蒸餾水混勻，靜置10 min 后，于3 000 r/min 離心10 min，取上清液于700 nm 處測定吸光度，蒸餾水調(diào)零[14]。

1.2.4 體內(nèi)抗氧化試驗

1.2.4.1 小鼠飼喂與建模

參照國食藥監(jiān)?；痆2012]107 號文件中反應(yīng)較迅速的乙醇氧化損傷造模法進(jìn)行建模[15]。將40 只動物適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，隨機分為5 組，每組8 只，依次設(shè)定為A（空白組）、B（對照組）、C（低劑量模型組）、D（中劑量模型組）、E（高劑量模型組）。分組后的小鼠先用基礎(chǔ)飼料飼喂4 周，再進(jìn)行灌胃處理4 周，空白組按照體重每只灌注0.05 mL/g 生理鹽水，對照組按照體重每只灌注0.05 mL/g VE，低劑量模型組按照體重每只灌注0.05 mL/g 苦杏仁油，中劑量模型組按照體重每只灌注0.15 mL/g 苦杏仁油，高劑量模型組按照體重每只灌注0.25 mL/g 苦杏仁油[16]。末次灌胃后禁食16 h（期間正常飲水），然后按照12 mL/kg mb的灌胃量一次性給予每只小鼠50%乙醇。6 h 后采用摘除眼球采血法取血，分別搜集血液于EP 管中，后采用頸椎脫臼法處死小鼠。

1.2.4.2 SOD、MDA 指標(biāo)測定

將裝有血液的離心管于4 ℃條件下離心10 min（4 000 r/min），輕輕吸取上層血清后，使用對應(yīng)的試劑盒進(jìn)行嚴(yán)格的指標(biāo)測定。

1.2.4.3 肝臟組織病理學(xué)觀察

解剖小鼠并取出肝臟后對小鼠肝臟進(jìn)行HE 染色，并于顯微鏡下觀察組織形態(tài)[17]。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計類試驗均重復(fù)3 次，采用SPSS 18.0 軟件分析數(shù)據(jù)，采用Origin Pro9 軟件統(tǒng)計數(shù)據(jù)并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 苦杏仁油體外抗氧化試驗

DPPH·是一種穩(wěn)定的以氮為中心的脂溶性自由基，其氮端有一個孤對電子，醇溶液呈紫色，加入抗氧化劑后，其孤對電子可以與氫配對，使紫色褪去，抗氧化劑能力越強，顏色褪去越明顯。是一個氧分子獲得一個電子而形成的，廣泛存在于細(xì)胞的線粒體中，可進(jìn)一步反應(yīng)生成對細(xì)胞破壞力更強的過氧化氫和羥自由基；在堿性環(huán)境中，鄰苯三酚可產(chǎn)生超氧陰離子自由基和帶有顏色的中間產(chǎn)物，在反應(yīng)體系中加入抗氧化劑可清除已產(chǎn)生的超氧陰離子并可以減緩鄰苯三酚的氧化，因此可以通過測定吸光度來判斷抗氧化劑的抗氧化能力。·OH 是機體氧化代謝過程中產(chǎn)生的氧化性最強的一種自由基，它可以破壞人體DNA 結(jié)構(gòu)，使其出現(xiàn)永久損傷，還會破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，從而誘發(fā)衰老和其他多種氧化代謝疾?。籉enton反應(yīng)生成·OH 促使Fe2+氧化為Fe3+，加入抗氧化劑會減緩這一反應(yīng)，通過測定吸光度可以判斷出其抗氧化能力。還原力與抗氧化能力成正比，常用鐵氰化鉀還原法來測定某一物質(zhì)的還原力，抗氧化劑提供電子給Fe3+，使得Fe3+還原成Fe2+，通過吸光度的大小判斷Fe2+的濃度，從而反映其抗氧化能力，吸光度越大，樣品的還原能力越強[18-20]。苦杏仁油對DPPH 自由基、、·OH 的清除能力及對Fe3+的還原力見圖1。

圖1 苦杏仁油體外抗氧化能力Fig. 1 Antioxidant capacities of bitter almond oil in vitro

根據(jù)測試結(jié)果可以看出：苦杏仁油對DPPH·的清除能力呈梯度增加，但較同濃度的VC 差，半數(shù)清除率（IC50）為0.215 mg/mL；苦杏仁油對清除能力呈梯度增加，但較同濃度的VC 差，半數(shù)清除率（IC50）為0.378 mg/mL；苦杏仁油對·OH 的清除能力呈梯度增加，但較同濃度VC 差，半數(shù)清除率（IC50）為0.679 mg/mL；苦杏仁油對Fe3+的還原能力隨劑量的增加而增強，但抗氧化能力弱于VC。出現(xiàn)以上情況可能是因為苦杏仁油中供氫體相對較少,且VC 作為水溶性抗氧化劑，反應(yīng)時間更短，因此苦杏仁油的抗氧化能力相比同濃度的VC 差。

2.2 苦杏仁油體內(nèi)抗氧化試驗

2.2.1 苦杏仁油對小鼠體重的影響

試驗期間各組小鼠體態(tài)生長良好，活潑好動，精神飽滿，皮毛順滑有光澤，飲食飲水正常，剛灌胃后出現(xiàn)短暫不適感，但片刻后即恢復(fù)正常。試驗期間小鼠平均體重測定結(jié)果見圖2。

圖2 試驗期間小鼠體重測定結(jié)果（n=8）Fig. 2 Body weights of mice during the experiment(n=8)

2.2.2 苦杏仁油對小鼠血清中SOD 活性和MDA 含量的影響

SOD 是生物體內(nèi)源性抗氧化酶系統(tǒng)組成之一，可以清除機體產(chǎn)生的超氧陰離子和過氧化物等，減少生物體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生和蓄積，從而發(fā)揮清除自由基、保護(hù)細(xì)胞完整性等抗氧化的功效，生物體內(nèi)SOD活性越高說明機體清除自由基、抗氧化能力越強。MDA 是體內(nèi)細(xì)胞膜上不飽和脂肪酸與活性氧簇氧化代謝產(chǎn)生的脂質(zhì)過氧化物，其含量可以反映細(xì)胞的氧化損傷程度，含量越低說明細(xì)胞被氧化損傷的程度越低[21]。各組動物血清中SOD 活性和MDA 含量的測定結(jié)果見圖3。

圖3 苦杏仁油對小鼠血清中SOD 活性和MDA 含量的影響（n=8）Fig. 3 Effects of bitter almond oil on SOD activity and MDA content in mice sera(n=8)

由圖3 可以看出：低劑量模型組SOD 活性與空白組之間存在顯著差異（P＜0.05），其余各組與空白組之間則存在極顯著差異（P＜0.01）；各組MDA 含量與空白組之間均存在極顯著差異（P＜0.01）；各組SOD 活性均高于空白組，MDA 含量均低于空白組，表明苦杏仁油對氧化損傷具有一定的保護(hù)作用。中劑量模型組小鼠血清SOD 活性值最高且MDA 含量最低，說明該劑量對氧化損傷的保護(hù)作用最強。

低、中、高劑量模型組中SOD 活性及MDA 含量均與對照組之間存在極顯著差異（P＜0.01），中劑量模型組小鼠抗氧化能力與對照組最接近，其次為高劑量模型組，最后為低劑量模型組。

盡管苦杏仁油對生物體具有一定的抗氧化效果，但隨著苦杏仁油攝入量增大，卻表現(xiàn)出了抗氧化能力降低的情況，造成這種情況的原因可能是由于攝入過多苦杏仁油，延長了機體吸收利用的時間，反而導(dǎo)致油脂產(chǎn)生了促氧化效果，從而使得抗氧化能力有所下降[22]。因此苦杏仁油攝入量并不是越多越好，攝入量過多也許會產(chǎn)生負(fù)面效應(yīng)。

2.2.3 苦杏仁油對小鼠肝臟組織病理形態(tài)學(xué)的影響

對各組小鼠肝臟切片進(jìn)行HE 染色觀察，結(jié)果見圖4。肝臟是生物體內(nèi)最重要的代謝器官，短時間內(nèi)攝入大量乙醇會激發(fā)生物體氧分子發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，產(chǎn)生自由基，從而引起組織細(xì)胞過氧化效應(yīng)，造成肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷和功能損傷，因此通過觀察小鼠肝臟細(xì)胞的形態(tài)可以初步判斷出其氧化損傷的情況。通過顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，空白組小鼠肝細(xì)胞之間連接松散、排列分散、界限模糊，對照組、中劑量模型組小鼠肝臟組織均勻、肝細(xì)胞形態(tài)完整，無明顯脂肪浸潤現(xiàn)象，無明顯病理反應(yīng)；低劑量模型組和高劑量模型組的小鼠肝臟出現(xiàn)不同程度的肝細(xì)胞形態(tài)不完整、脂肪浸潤的現(xiàn)象，其中高劑量模型組的小鼠此種情況更為嚴(yán)重。這可能是因為低劑量模型組的小鼠體內(nèi)拮抗氧自由基的供氫體含量較少，肝臟無法代謝短時間內(nèi)攝入的大量乙醇，導(dǎo)致過多的乙醇對肝細(xì)胞造成破壞；高劑量模型組的小鼠由于長期攝入過多脂肪，能量過剩，富裕的脂肪轉(zhuǎn)換為糖原儲存在肝臟中導(dǎo)致肝細(xì)胞增大，同時肝細(xì)胞無法快速代謝短時間攝入的乙醇，從而造成了肝細(xì)胞形態(tài)破損和脂肪浸潤現(xiàn)象[23]。

圖4 小鼠肝臟切片HE 染色結(jié)果（200×）Fig. 4 HE staining results of mice livers slices（200×）

3 結(jié)論