朱晨華,周 舟,沈 杰,吳冬梅

(安捷倫科技(中國(guó))有限公司上海第一分公司,上海 200080)

重金屬元素對(duì)人體有嚴(yán)重的毒理效應(yīng),會(huì)損害人體神經(jīng)組織和器官等,給人類(lèi)健康帶來(lái)嚴(yán)重威脅[1-2]。藥品研發(fā)生產(chǎn)過(guò)程中可能引入元素雜質(zhì),從而對(duì)藥物穩(wěn)定性和保質(zhì)期造成負(fù)面影響。2017年12月22日,國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局藥品審評(píng)中心發(fā)布的《已上市化學(xué)仿制藥(注射劑)一致性評(píng)價(jià)技術(shù)要求》(征求意見(jiàn)稿)中明確規(guī)定了原料藥的元素雜質(zhì)、包材相容性和質(zhì)量工藝中元素雜質(zhì)的檢測(cè)等,并且還指出要“根據(jù)國(guó)際人用藥品注冊(cè)技術(shù)協(xié)調(diào)會(huì)議(ICH)元素雜質(zhì)指導(dǎo)原則Q3D(簡(jiǎn)稱(chēng)ICH Q3D)的規(guī)定,通過(guò)科學(xué)和基于風(fēng)險(xiǎn)的評(píng)估來(lái)確定制劑中元素雜質(zhì)的控制策略,包括原輔包、生產(chǎn)設(shè)備等可能引入的元素雜質(zhì)”[3]。因此,測(cè)定藥物中重金屬元素雜質(zhì)含量對(duì)保障人體健康至關(guān)重要[4]。ICH Q3D 規(guī)定了鋰、釩、鉻、鈷、鎳、銅、砷、硒、鉬、釕、銠、鈀、銀、鎘、錫、銻、鋇、鋨、銥、鉑、金、汞、鉈、鉛等24種元素雜質(zhì)的每日最大允許暴露量值(PDE),推薦的檢測(cè)方法為電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法(ICP-AES)和電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICP-MS)。ICP-MS因具有可多元素同時(shí)測(cè)定、質(zhì)譜干擾少、檢出限低以及專(zhuān)屬性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì),成為元素雜質(zhì)分析的首選方法[5-6]。

原料藥中元素雜質(zhì)檢測(cè)的前處理方法以酸溶、濕法消解或者微波消解為主,但這些方法需要消耗大量的酸,可能對(duì)待測(cè)元素造成干擾,而且阿司匹林、布洛芬等酸性藥物難以被徹底消解。因此,尋找一種快速的前處理方式[7-9],對(duì)原料藥的監(jiān)控有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。本工作以氨水溶解酸性原料藥,考察了乙二胺四乙酸(EDTA)對(duì)元素雜質(zhì)穩(wěn)定性的影響,根據(jù)ICH Q3D 和美國(guó)藥典(USP)〈232〉的要求對(duì)該方法進(jìn)行驗(yàn)證[10-13],提出了ICP-MS測(cè)定酸性原料藥中24種元素雜質(zhì)含量的方法。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

7900型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀,配Micromist霧化器、珀?duì)柼鋮s的石英霧化室、炬管(內(nèi)徑2.5 mm)、鎳錐。

碲、鈧、鍺、銦、镥、鉍的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液:碲質(zhì)量濃度為25 mg·L-1,鈧質(zhì)量濃度為10 mg·L-1,鍺、銦、镥、鉍質(zhì)量濃度均為5 mg·L-1。

EDTA 溶液:0.5 g·L-1,稱(chēng)取0.05 g EDTA,用水溶解后定容至100 mL,配制成0.5 g·L-1EDTA溶液。

混合內(nèi)標(biāo)溶液:稱(chēng)取0.05 g EDTA,加入50 mL水溶解,再加入2 mL 異丙醇,最后用水定容至100 mL。用該溶液逐級(jí)稀釋碲、鈧、鍺、銦、镥、鉍的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,得到碲質(zhì)量濃度為500μg·L-1,鈧質(zhì)量濃度為200μg·L-1,鍺、銦、镥、鉍質(zhì)量濃度均為100μg·L-1的混合內(nèi)標(biāo)溶液。

氨水、EDTA 均為色譜純;試驗(yàn)用水為去離子水。

1.2 儀器工作條件

射頻功率1 550 W;冷卻氣流量12 L·min-1,輔助氣流量1.0 L·min-1,載氣流量0.9 L·min-1;碰撞氣為氦氣,流量5 L·min-1;采樣深度10 mm。待測(cè)元素/內(nèi)標(biāo)同位素依次為6Li/45Sc、51V/45Sc、52Cr/45Sc、59Co/45Sc、60Ni/45Sc、63Cu/45Sc、75As/72Ge、78Se/72Ge、95Mo/115In、101Ru/115In、103Rh/115In、105Pd/115In、107Ag/115In、111Cd/115In、118Sn/115In、121Sb/125Te、137Ba/125Te、188Os/175Lu、193Ir/175Lu、194Pt/175Lu、197Au/175Lu、202Hg/209Bi、205Tl/209Bi、208Pb/209Bi。

1.3 試驗(yàn)方法

稱(chēng)取0.200 g樣品,加入25 mL EDTA 溶液,于90 ℃加熱10 min,冷 卻,加 入0.3 mL 氨 水,再 用EDTA 溶液定容至50 mL,渦旋3 min,得到供試品溶液,按照儀器工作條件進(jìn)行測(cè)定,通過(guò)蠕動(dòng)泵在線加入混合內(nèi)標(biāo)溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理方法的選擇

試驗(yàn)對(duì)比了二甲基亞砜(DMSO)、氨水及硝酸等試劑對(duì)樣品的溶解性能。結(jié)果表明:硝酸難以徹底消解帶有苯環(huán)的樣品,并且采用5%(體積分?jǐn)?shù))硝酸溶液消解時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量沉淀;DMSO、氨水對(duì)帶有苯環(huán)的原料藥均有良好的溶解性,但DMSO 屬于有機(jī)試劑,直接進(jìn)樣測(cè)定會(huì)在采樣錐表面形成大量的積碳,需要配置加氧設(shè)備及鉑錐等附件,若使用標(biāo)準(zhǔn)加入法或基體匹配法進(jìn)行定量,增加了儀器和操作時(shí)間成本;而酸性原料藥在0.6%(體積分?jǐn)?shù),下同)氨水溶液中有良好的溶解性,不會(huì)對(duì)ICP-MS石英進(jìn)樣系統(tǒng)造成腐蝕,減少了測(cè)試成本,同時(shí)方便日常操作。

雖然酸性原料藥可在0.6%氨水溶液中快速溶解,但多數(shù)元素雜質(zhì)在堿性環(huán)境中穩(wěn)定性差,甚至產(chǎn)生沉淀。分析結(jié)果表明,大多數(shù)元素雜質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線在0.6%氨水溶液中的相關(guān)系數(shù)小于0.990 0,測(cè)試結(jié)果不穩(wěn)定,不符合USP 要求。EDTA 是一種重要的絡(luò)合劑,它可以與多種元素形成穩(wěn)定絡(luò)合物。為解決元素雜質(zhì)在堿性條件下穩(wěn)定性差、測(cè)定結(jié)果精密度差的問(wèn)題,試驗(yàn)選用EDTA 對(duì)元素雜質(zhì)絡(luò)合后再進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn):當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)溶液中元素雜質(zhì)與EDTA 的物質(zhì)的量比為10∶1時(shí),在0.6%氨水溶液中出現(xiàn)絮狀沉淀;而元素雜質(zhì)與EDTA 的物質(zhì)的量比為1∶10時(shí),在0.6%氨水溶液中則可得到澄清溶液。為使元素雜質(zhì)充分絡(luò)合,經(jīng)多次試驗(yàn),最終選擇0.5 g·L-1EDTA 溶液為絡(luò)合劑。

由于大多數(shù)絡(luò)合物在弱酸性至中性條件下更穩(wěn)定,而EDTA 為弱酸性,有利于形成絡(luò)合物,因此將樣品先加入到EDTA 溶液中,使元素雜質(zhì)絡(luò)合后再用氨水溶解。但某些元素(如鉻)在常溫下與EDTA形成絡(luò)合物的時(shí)間較長(zhǎng),延長(zhǎng)了前處理的時(shí)間,因此試驗(yàn)選擇在90 ℃條件下加熱10 min,從而提高絡(luò)合效率。按照此方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,24種元素雜質(zhì)的相關(guān)系數(shù)均大于0.999 0,滿(mǎn)足USP要求。

2.2 增敏劑的選擇

參考《中華人民共和國(guó)藥典》(2020年版),采用內(nèi)標(biāo)校正的標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行定量,但試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)采用ICP-MS分析時(shí),供試品溶液中的有機(jī)物會(huì)對(duì)部分元素產(chǎn)生有機(jī)增敏效應(yīng)[14-15],導(dǎo)致砷、汞等元素的加標(biāo)回收率超過(guò)120%。為減少有機(jī)物對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響,試驗(yàn)選擇在混合內(nèi)標(biāo)溶液中加入有機(jī)物異丙醇,以減少標(biāo)準(zhǔn)溶液和供試品溶液中有機(jī)物含量的差異。結(jié)果表明,以2%(體積分?jǐn)?shù))異丙醇溶液配制混合內(nèi)標(biāo)溶液時(shí),各元素的加標(biāo)回收率均在70.0%～150%內(nèi)。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

ICH Q3D 與USP〈232〉規(guī)定了藥物中24種元素雜質(zhì)的PDE。對(duì)于需要消解或稀釋的樣品,必須根據(jù)樣品稀釋倍數(shù)和推薦的藥物每日最大劑量將PDE轉(zhuǎn)化為制得試樣中測(cè)得的濃度限值(J值),24種元素雜質(zhì)的J 值見(jiàn)表1。使用專(zhuān)用的ICH Q3D/USP多元素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,以2%(體積分?jǐn)?shù))硝酸為溶劑,按照USP〈232〉要求配制成各待測(cè)元素質(zhì)量濃度為各 自J值的0.5,1.0,1.5 倍(0.5 J,1.0 J,1.5 J)的多元素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列,按照儀器工作條件進(jìn)行測(cè)定。以各待測(cè)元素質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),以待測(cè)元素與內(nèi)標(biāo)響應(yīng)強(qiáng)度比值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,線性參數(shù)見(jiàn)表1。

連續(xù)測(cè)定7份空白樣品溶液,以3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差(s)計(jì)算檢出限(3s),結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 24種元素雜質(zhì)的J值、線性參數(shù)和檢出限Tab.1 J values,linearity parameters and detection limits of 24 impurity elements

表1 (續(xù))

2.4 系統(tǒng)適用性

根據(jù)USP〈232〉漂移性能測(cè)試要求,在測(cè)定樣品溶液前后,分別對(duì)1.5 J混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定,計(jì)算漂移率,兩次測(cè)定時(shí)間間隔約為3 h。結(jié)果顯示:24種元素雜質(zhì)漂移率為-6.9%～5.1%,滿(mǎn)足漂移率的絕對(duì)值不超過(guò)20%的要求。

2.5 樣品分析

按照試驗(yàn)方法測(cè)定阿司匹林、布洛芬、雙氯芬酸等3種酸性原料藥中24種元素雜質(zhì)的含量,結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品分析結(jié)果Tab.2 Analytical results of the samples μg·kg-1

2.6 回收試驗(yàn)

根據(jù)USP〈232〉要求,對(duì)樣品進(jìn)行0.5 J,1.0 J,1.5 J 等3 個(gè)濃度水平的加標(biāo)回收試驗(yàn),結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 回收試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Results of test for recovery

結(jié)果顯示:24 種元素雜質(zhì)的加標(biāo)回收率為84.9%～111%,滿(mǎn)足USP〈232〉和ICH Q3D 對(duì)回收率的限定要求(70.0%～150%)。

本工作用EDTA 絡(luò)合元素雜質(zhì)后,再用氨水對(duì)酸性原料藥進(jìn)行溶解,并采用ICP-MS測(cè)定酸性原料藥中24種元素雜質(zhì)的含量。相較于傳統(tǒng)微波消解方式,本方法樣品處理時(shí)間短,而且樣品可完全溶解,降低了操作難度和儀器硬件配置的成本,提高了分析效率,可實(shí)現(xiàn)樣品的高通量分析。