任智晶，楊 震，楊 丹，田曉濱

(1.貴州省人民醫(yī)院臨床檢驗科，貴陽 550002；2.貴州省人民醫(yī)院骨科，貴陽 550002；3.貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院骨科，貴陽 550000)

骨肉瘤是一種來源于間充質(zhì)干細胞的惡性腫瘤，年發(fā)病率為1/100萬～4/100萬，5年生存率為37.5%～77.6%[1-5]，了解骨肉瘤致病過程中的分子機制將有助于促進和發(fā)展更有效的治療策略。最近的研究發(fā)現(xiàn)，能量代謝的重編程被認為是惡性轉(zhuǎn)化的標志[6]。其中，脂質(zhì)代謝失調(diào)在癌癥進展中具有至關(guān)重要的作用，靶向脂質(zhì)代謝已被視為一種新的腫瘤治療策略[7-10]。環(huán)狀RNA(circRNA)是一類非編碼RNA，與腫瘤細胞的增殖、侵襲和遷移能力、細胞周期、凋亡及自噬等密切相關(guān)[11-13]。同時，circRNA也被證實可以參與調(diào)控腫瘤的脂質(zhì)代謝[14-15]。本課題組前期研究證實了hsa_circ_0000073在骨肉瘤細胞系中高表達，并可促進骨肉瘤細胞的增殖、遷移和侵襲[16]。然而hsa_circ_0000073是否可以影響骨肉瘤細胞代謝，國內(nèi)外尚無研究報道。因此，本研究旨在探索hsa_circ_0000073在骨肉瘤組織中的表達及其對骨肉瘤細胞及裸鼠異種移植瘤體中脂質(zhì)代謝的影響，以期為骨肉瘤的診斷和治療提供潛在的靶點，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1骨肉瘤組織標本

收集2020年1月至2022年1月貴州省人民醫(yī)院就診且經(jīng)病理證實的10例骨肉瘤患者的腫瘤組織和癌旁組織。10例患者中男6例，女4例；年齡>18歲2例，<18歲8例；均無高血壓、糖尿病等其他基礎(chǔ)疾病。本研究經(jīng)過貴州省人民醫(yī)院倫理委員會批準[倫預審(2019)030]，所有研究對象簽署知情同意書。

1.1.2動物與細胞

12只BALB/C-nu小鼠購自西普爾-比凱實驗動物科技公司，4周齡，平均體重約15 g，分為兩組，每組6只。骨肉瘤細胞系MG-63和Saos-2購自中國科學院細胞庫。

1.1.3試劑與儀器

引物、shRNA(安徽通用生物有限公司)，MEM培養(yǎng)基、胎牛血清(美國Gibco公司)，McCoy’s 5a培養(yǎng)基(美國Invitrogen公司)，LipofectamineTM3000(美國Thermo公司)，TRIzol試劑(美國Invitrogen公司)，油紅O染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)，尼羅紅熒光染色溶液(上海源葉生物科技有限公司)，Gene Chip miRNA Array 4.0(美國Affymetrix公司)，熒光定量PCR(qRT-PCR)儀(杭州博日科技股份有限公司)，倒置熒光顯微鏡(德國萊卡公司)，自動酶標儀(中安生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1分組

根據(jù)細胞轉(zhuǎn)染hsa_circ_0000073或隨機序列的shRNA，分為circ_0000073干擾組及對照組。

1.2.2qRT-PCR

使用Trizol作為總RNA的抽提試劑。采用酸性酚-氯仿混合液純化RNA，異丙醇沉淀濃縮，乙醇洗滌沉淀。PrimeScript RTase逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Green PCR試劑盒用于qRT-PCR檢測，根據(jù)試劑說明書操作。使用GAPDH的表達水平進行標準化，并按公式2-ΔΔCt計算目的基因相對表達水平。引物序列見表1。

表1 qRT-PCR所使用引物序列

1.2.3細胞培養(yǎng)和穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株構(gòu)建

MG-63和Saos-2骨肉瘤細胞在含5% CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)基中添加10%胎牛血清。使用LipofectamineTM3000將sh-NC(隨機序列的sh-RNA，對照)及sh-hsa_circ_0000073轉(zhuǎn)染細胞，shRNAs序列見表2。48 h后加入500～800 μg/mL G418進行篩選。4周后，加入200～300 μg/mL G418維持培養(yǎng)。由于載體中帶有綠色熒光蛋白，成功轉(zhuǎn)染目的基因的細胞在熒光顯微鏡中會呈現(xiàn)綠色熒光。取對數(shù)生長期的各組細胞熒光顯微鏡下觀察，待大部分細胞在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)綠色熒光后，通過qRT-PCR檢測確認轉(zhuǎn)染效率。

表2 shRNA序列

1.2.4基因表達譜分析和生物信息學分析

為了揭示hsa_circ_0000073在骨肉瘤中的作用及其機制，本研究使用了表達譜芯片對干擾hsa_circ_0000073后的差異基因進行篩選，并將篩選結(jié)果通過生物信息學方法進行富集分析。具體方法如下：細胞轉(zhuǎn)染sh-NC或sh-hsa_circ_0000073，使用Trizol試劑提取細胞總RNA。使用GeneChip WT Pico Reagent Kit檢測基因表達譜，以FC>1.5為條件篩選差異表達基因。使用GO分析對差異基因進行富集分析，設(shè)置條件為：p.adj<0.05和q value<0.2。R語言(3.6.3版本)的“clusterProfiler”包用于數(shù)據(jù)分析，“ggplot2”包用于數(shù)據(jù)可視化。

1.2.5油紅染色

為了探索hsa_circ_0000073對骨肉瘤細胞脂質(zhì)代謝的影響，本研究進行了油紅實驗檢測細胞內(nèi)脂質(zhì)情況。細胞計數(shù)后加入12孔板，適宜條件下生長48 h，各組細胞用4%多聚甲醛固定1 h，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次后，加入3 mg/mL油紅染液于室溫下染色30 min，倒置顯微鏡下觀察結(jié)果并拍照，異丙醇提取細胞內(nèi)脂質(zhì)，酶標儀檢測吸光度值。

1.2.6尼羅紅熒光染色

由于不同實驗方法的靈敏度及特異度不同，為了進一步驗證hsa_circ_0000073對骨肉瘤細胞脂質(zhì)代謝的影響，本研究還使用了尼羅紅熒光染色實驗對油紅染色的實驗結(jié)果進行驗證。各組細胞計數(shù)后適宜條件下培養(yǎng)，脂肪固定液固定24 h，1 mg/mL尼羅紅染色用PBS 1∶500稀釋成工作液，滴加到細胞爬片上，37 ℃下染色30 min，PBS洗滌后，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果，并測定熒光強度。

1.2.7裸鼠異種移植實驗

為了驗證hsa_circ_0000073對在體生長的骨肉瘤細胞脂質(zhì)代謝的影響，本研究使用了BALB/C-nu小鼠側(cè)腋注射2×107個穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的MG-63細胞。適宜條件下飼養(yǎng)5周后，處死小鼠，將瘤體冰凍切片后進行油紅和尼羅紅染色。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結(jié) 果

2.1 hsa_circ_0000073在骨肉瘤組織和癌旁組織的表達情況

hsa_circ_0000073在骨肉瘤組織中的表達水平高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖1。

aP<0.05。圖1 hsa_circ_0000073在骨肉瘤組織和癌旁組織的表達情況

2.2 細胞培養(yǎng)和穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株構(gòu)建情況

通過G418篩選后，對數(shù)生長期的大部分細胞在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)綠色熒光。與對照組比較，circ_0000073干擾組hsa_circ_0000073表達水平降低(P<0.05)，提示sh-NC和sh-hsa_circ_0000073的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株建立成功，可以用于后續(xù)實驗，見圖2～3。

圖2 熒光顯微鏡觀察結(jié)果

aP<0.05。圖3 sh-hsa_circ_0000073相對表達水平

2.3 干擾hsa_circ_0000073后的基因表達譜分析

干擾hsa_circ_0000073后，MG-63細胞和Saos-2細胞中分別有1 838和1 255個下調(diào)基因。通過韋恩分析，共篩選出398個共同下調(diào)的差異基因。GO分析結(jié)果顯示這398個差異基因主要富集于有絲分裂核分裂、紡錘體、染色體、著絲粒區(qū)。KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)“代謝通路”是兩種細胞干擾hsa_circ_0000073后富集到的主要通路，見圖4～5。

圖4 差異基因的 GO富集分析

圖5 KEGG通路分析

2.4 hsa_circ_0000073可影響骨肉瘤細胞脂質(zhì)代謝

與對照組比較，circ_0000073干擾組骨肉瘤細胞內(nèi)脂質(zhì)減少，吸光度降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖6～7。與對照組比較，circ_0000073干擾組骨肉瘤細胞內(nèi)尼羅紅熒光強度減弱，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖8～9。

A：兩組油紅染色圖片；B：兩組脂質(zhì)相對水平比較；a：P<0.05。圖6 MG-63骨肉瘤細胞油紅實驗結(jié)果

A：兩組油紅染色圖片；B：兩組脂質(zhì)相對水平比較；a：P<0.05。圖7 Saos-2骨肉瘤細胞油紅實驗結(jié)果

A：兩組尼羅紅染色圖片；B：兩組尼羅紅熒光相對強度比較；a：P<0.05。圖8 MG-63骨肉瘤細胞尼羅紅實驗結(jié)果

A：兩組尼羅紅染色圖片；B：兩組尼羅紅熒光相對強度比較；a：P<0.05。圖9 Saos-2骨肉瘤細胞尼羅紅實驗結(jié)果

2.5 hsa_circ_0000073可影響裸鼠異種移植瘤中骨肉瘤細胞脂質(zhì)代謝

裸鼠移植瘤體組織的油紅和尼羅紅染色結(jié)果顯示，與對照組比較，circ_0000073干擾組脂質(zhì)減少，熒光強度減弱，提示干擾hsa_circ_0000073可以降低在體骨肉瘤細胞的脂質(zhì)代謝，見圖10～11。

圖10 裸鼠異種移植油紅實驗結(jié)果

圖11 裸鼠異種移植尼羅紅實驗結(jié)果

3 討 論

最近的研究發(fā)現(xiàn)，能量代謝重編程是由基因組不穩(wěn)定性引起的腫瘤標志[6]。脂質(zhì)作為重要的信號分子、維持結(jié)構(gòu)完整性和儲存能量的細胞成分，經(jīng)常在癌癥狀態(tài)下重新編程[17]。例如，腫瘤細胞中脂質(zhì)代謝酶的表達及活性改變，內(nèi)源性脂肪酸合成激活，脂肪動員異常等，均可導致脂質(zhì)代謝失調(diào)，幫助腫瘤細胞以脂質(zhì)為原料維持其快速增殖和轉(zhuǎn)移行為，或促進異常的癌細胞-基質(zhì)細胞通信，觸發(fā)致癌信號以促進生長，從而導致疾病進展[7-9]。在骨肉瘤中，有研究者以高通量的方式研究了轉(zhuǎn)移性(143B)和非轉(zhuǎn)移性(HOS)骨肉瘤細胞與正常胎兒成骨細胞(FOB)的總體脂質(zhì)代謝差異，發(fā)現(xiàn)許多脂質(zhì)種類在骨肉瘤的轉(zhuǎn)移中存在較大差異[17]。而另一項研究報道，抑制脂肪酸合酶(FASN)可通過下調(diào)HER2/PI3K/AKT信號通路活性影響骨肉瘤細胞轉(zhuǎn)移[18]。因此，靶向脂質(zhì)代謝等代謝途徑可能將有助于發(fā)展現(xiàn)有的骨肉瘤治療策略。

circRNA是一種共價閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的非編碼RNA。由于缺乏3′端多聚腺苷酸化尾及5′端帽結(jié)構(gòu)，circRNA可以避免外切核酸酶降解，半衰期較長，具有臨床應(yīng)用的潛能[19]。越來越多的circRNA被發(fā)現(xiàn)參與腫瘤的脂質(zhì)代謝。例如，在HepG2細胞培養(yǎng)物和肝組織中，circRNA_0046367表達被發(fā)現(xiàn)與甘油三酯水平呈負相關(guān)[20]。另一則研究報道發(fā)現(xiàn)，circRNA_0057558的表達與前列腺癌患者的甘油三酯水平呈正相關(guān)，可能通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)水平以促進前列腺癌進展[21]。在機制上，circGFRA1被證實可通過ceRNA機制促進GFRA1的表達，從而誘導三陰性乳腺癌細胞中脂質(zhì)改變[22]。而肺腺癌中高表達的circFARSA也被發(fā)現(xiàn)可能通過miR-330-5p和miR-326與FASN相互作用影響腫瘤進展[14]。

本課題組前期研究分析了來自基因表達匯編(GEO)數(shù)據(jù)庫GSE96964 circRNA芯片數(shù)據(jù)，從中篩選出了hsa_circ_0000073作為目標分子，并證實了其在骨肉瘤細胞系中高表達[16]。該芯片數(shù)據(jù)是2017年LIU等[23]為了將人骨肉瘤細胞系與人成骨細胞hFOB1.19(對照)中的circRNA表達進行比較分析所獲得的circRNA表達譜。自從該數(shù)據(jù)上傳GEO數(shù)據(jù)庫以來，已被多名研究者下載使用，并從中篩選出了多個對骨肉瘤進程具有重要作用的circRNA，為骨肉瘤的診斷和治療研究提供了幫助[24-25]。

本文在前期研究的基礎(chǔ)上收集了10例骨肉瘤患者及其癌旁組織標本，通過qRT-PCR分析，發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0000073在腫瘤組織中的表達高于癌旁組織，該結(jié)果與LI等[26]報道一致。為進一步研究hsa_circ_0000073在骨肉瘤中的作用，本研究使用了Affymetrix基因芯片分析干擾hsa_circ_0000073后的基因表達譜改變?？紤]到生物信息學方法對于處理和分析大量信息至關(guān)重要，本研究首先將基因芯片獲得的差異基因進行了GO分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種細胞的差異基因主要富集于有絲分裂核分裂、紡錘體、染色體、著絲粒區(qū)。KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)“代謝通路”是兩種細胞干擾hsa_circ_0000073后富集到的主要通路。提示hsa_circ_0000073的功能可能與細胞的生長和分化有關(guān)，尤其與細胞代謝關(guān)系密切。隨后，通過骨肉瘤細胞和裸鼠異種移植瘤雙重模型，證實了hsa_circ_0000073對骨肉瘤細胞脂質(zhì)代謝的影響，提示hsa_circ_0000073可能通過影響骨肉瘤細胞脂質(zhì)代謝促進骨肉瘤進展。

綜上所述，hsa_circ_0000073在腫瘤組織中的表達高于癌旁組織。通過基因芯片、生物信息學分析，表明hsa_circ_0000073的功能可能與細胞的生長和分化有關(guān)，尤其與細胞代謝關(guān)系密切。隨后的體內(nèi)外實驗進一步證實了干擾hsa_circ_0000073可以影響骨肉瘤細胞的脂質(zhì)代謝，該發(fā)現(xiàn)為骨肉瘤的診斷和治療提供了新的思路，豐富了骨肉瘤發(fā)病機制的理論依據(jù)。然而，盡管有初步的證據(jù)表明hsa_circ_0000073在調(diào)節(jié)骨肉瘤脂質(zhì)代謝中具有重要作用，但未來仍需納入更多的臨床相關(guān)性研究，同時還需要深入探討hsa_circ_0000073影響骨肉瘤脂質(zhì)代謝的分子機制，以期為相應(yīng)分子的轉(zhuǎn)化應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。