張慶娥,鄭建麗,李 敏,董晶晶,周月云,劉建兵,胡蘇瑋

(1.揚(yáng)州大學(xué)，江蘇揚(yáng)州 225002；2.江蘇省鹽城市婦幼保健院產(chǎn)前診斷中心 224001；3．揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬揚(yáng)州市婦幼保健院醫(yī)學(xué)遺傳中心，江蘇揚(yáng)州 225002)

脊髓性肌萎縮癥(SMA)是一種常染色體隱性遺傳性疾病，其特征是脊髓前角細(xì)胞和腦干運(yùn)動(dòng)性腦神經(jīng)核的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元進(jìn)行性退變。該病的臨床表現(xiàn)主要為進(jìn)行性對稱性肌無力和肌肉萎縮。臨床癥狀在近端比遠(yuǎn)端更嚴(yán)重，下肢比上肢更嚴(yán)重[1]。該病可分為4型：急性嬰兒Ⅰ型、慢性嬰兒Ⅱ型、青少年Ⅲ型和成人Ⅳ型。該病在人群中的發(fā)病率為1/6 000～1/10 000，致病性突變的攜帶頻率為1/60～1/40[2]。SMA在兒童致死性常染色體遺傳病中排名第二，約80%的患兒在4歲前死亡。

據(jù)研究，SMA是由位于5號(hào)染色體上的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活基因1(SMN1)突變引起的。95%～98%為SMN1第7、8外顯子(E7、E8)缺失,包括E7、E8雜合缺失或僅E7純合缺失，SMN1點(diǎn)突變比例為2%～5%[3-4]。因此，針對SMN1基因E7和E8的拷貝數(shù)檢測已成為目前篩查SMA攜帶者的常用方法。鑒于該病致死率極高，致病基因明確，且人群中攜帶者頻率比較高，2008年美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)會(huì)就提倡對所有育齡夫婦提供SMA篩查。若夫妻雙方均為攜帶者，可進(jìn)行產(chǎn)前診斷判斷胎兒是否為SMA患兒。本研究采用熒光定量PCR技術(shù)對鹽城地區(qū)孕婦進(jìn)行SMA攜帶者篩查，對于高危胎兒，結(jié)合多重連接依賴探針擴(kuò)增技術(shù)(MLPA)進(jìn)行產(chǎn)前診斷，可以有效阻止SMA患兒的出生，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2020年10月至2022年2月鹽城市婦幼保健院產(chǎn)前診斷中心就診的33 560例表型正常的孕婦為研究對象。所有孕婦進(jìn)行SMA攜帶者篩查的宣教，其中自愿接受SMA攜帶者篩查4 429例，接受率約13.2%。孕婦年齡18～45歲，平均(27.9±4.7)歲；孕周11～20周，平均(15.5±2.9)周,且否認(rèn)SMA家族史和生育史。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)審查和批準(zhǔn)，且接受攜帶者篩查的孕婦均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1基因組DNA提取

參與篩查的孕婦用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管采集外周靜脈血2 mL,應(yīng)用DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)提取外周血DNA，測定濃度調(diào)整至10～20 ng/μL。參加產(chǎn)前診斷的孕婦采集羊水10mL,應(yīng)用微量DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)提取羊水基因組DNA。

1.2.2熒光定量PCR檢測

本研究應(yīng)用SMN1外顯子缺失檢測試劑盒(上海五色石醫(yī)學(xué)科技有限公司)采用化學(xué)阻斷法阻斷SMN2，對提取到的基因組DNA先進(jìn)行SMN1基因E7/E8擴(kuò)增，再對拷貝數(shù)進(jìn)行分析計(jì)算。按照試劑盒套組說明書操作：取出試劑盒，將試劑盒平衡至室溫，根據(jù)當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所進(jìn)行的反應(yīng)數(shù)(標(biāo)本DNA、1個(gè)空白對照、1個(gè)缺失對照及3個(gè)梯度正常對照)計(jì)算并移取相應(yīng)試劑，按照試劑盒方案配制反應(yīng)體系，按照以下條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增，實(shí)時(shí)收集熒光信號(hào)，記錄并計(jì)算實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.2.3MLPA

應(yīng)用MLPA P460試劑盒(荷蘭MRC公司)來驗(yàn)證SMN1的E7和E8拷貝數(shù)變異的情況。MLPA P460試劑盒中探針包括SMN1和SMN2基因E7和E8。按操作流程DNA經(jīng)過變性、探針雜交、連接反應(yīng)和擴(kuò)增后，得到的擴(kuò)增產(chǎn)物通過ABI3500毛細(xì)管電泳，所得數(shù)據(jù)用Coffalyser V8.0軟件分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 SMA攜帶者篩查結(jié)果

鹽城地區(qū)孕產(chǎn)婦的SMA攜帶頻率為1/61，即61例孕婦中有1例SMA攜帶者。73例攜帶者接受了遺傳咨詢，60例配偶(82.2%)接受了SMA篩查，結(jié)果顯示2對夫婦同時(shí)為SMA攜帶者，見表1。

表1 SMA攜帶者篩查結(jié)果(n)

2.2 產(chǎn)前診斷結(jié)果

2例高風(fēng)險(xiǎn)孕婦運(yùn)用MLPA行產(chǎn)前診斷，最終提示1例胎兒為SMN1基因E7/E8雙拷貝，即正常，孕婦繼續(xù)妊娠；另1例胎兒為SMN1基因E7/E8零拷貝，即SMA患者，孕婦終止妊娠。

3 討 論

SMA是一種致死性神經(jīng)系統(tǒng)性疾病，主要表現(xiàn)為對稱性肌無力和肌萎縮，患者最終將死于呼吸衰竭和嚴(yán)重的肺部感染。治療SMA的藥物目前只有諾西那生鈉、索伐瑞韋和利司撲蘭3種。雖然這些藥物的上市給SMA患者帶來了希望，但價(jià)格非常昂貴，普通家庭無法承受。因此，通過攜帶者篩查和產(chǎn)前診斷技術(shù)來避免SMA患兒的出生，是一種經(jīng)濟(jì)有效的預(yù)防該病的方法。

2007年，美國部分州即開始對新生兒和產(chǎn)前遺傳咨詢的婦女提供SMA篩查。2017年，美國婦產(chǎn)科學(xué)會(huì)便倡導(dǎo)對所有計(jì)劃妊娠或者已經(jīng)妊娠者進(jìn)行SMA篩查[5-6]。在中東，以色列于2008年引入SMA篩查，于2013年擴(kuò)大到全部人口[7-8]。2005—2009年，我國臺(tái)灣地區(qū)有超過10萬例孕婦進(jìn)行了SMA攜帶者篩查[9]。本研究對33 560例孕婦進(jìn)行SMA篩查的宣教，其中4 429例孕婦自愿接受SMA篩查，接受率約13.2%。而張菁菁等[10]報(bào)道南京地區(qū)16 549例孕婦有34.9%進(jìn)行了篩查。分析鹽城地區(qū)人群接受程度較低的原因主要與人們對于SMA不了解和經(jīng)濟(jì)條件相關(guān)。因此，需要加強(qiáng)對孕婦進(jìn)行SMA篩查知識(shí)的宣教，借助政府機(jī)構(gòu)的相關(guān)政策的支持，將會(huì)提高接受SMA篩查的人群比例。

研究表明，SMA的攜帶頻率為1/60～1/40。本研究通過對鹽城地區(qū)4 429例孕婦進(jìn)行SMA攜帶者篩查,共發(fā)現(xiàn)73例為SMA攜帶者，攜帶者頻率為1/61。據(jù)報(bào)道，以色列和澳大利亞的攜帶率分別為1/60和1/50[8,11]，我國上海地區(qū)的攜帶者頻率為1/52[12]，云南地區(qū)的攜帶者頻率為1/49[13]，本研究與前述報(bào)道較一致。此外，雖然SMN1基因E7/E8的缺失突變占SMN1的95%～98%，但當(dāng)檢測陰性時(shí)，只能排除SMN1基因E7和E8的缺失突變，不能排除SMN1基因其他區(qū)域的點(diǎn)突變，以及一條5號(hào)染色體上有2個(gè)SMN1基因、另一條5號(hào)染色體上的SMN1基因E7和(或)E8缺失[14]。故本地區(qū)SMA的攜帶率應(yīng)略高于1/61，該項(xiàng)研究為本地區(qū)進(jìn)行此項(xiàng)篩查提供了數(shù)據(jù)支撐，便于臨床醫(yī)生對孕婦進(jìn)行宣教和遺傳咨詢。

SMA屬于單基因遺傳病，具有親代向子代傳遞的特性，對于既往有過SMA患兒生育史的婦女或SMA基因攜帶者夫婦，其妊娠的胎兒患SMA的風(fēng)險(xiǎn)為25%，應(yīng)進(jìn)行SMA的產(chǎn)前診斷。目前，SMA的產(chǎn)前診斷方法主要對絨毛、羊水或臍血等標(biāo)本運(yùn)用限制性片段長度PCR、MLPA、熒光定量PCR、變性高效液相色譜和測序等分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行檢測。張柳娟等[15]于2016年通過MLPA診斷出3例胎兒均為SMN1 E7和E8雜合缺失。徐晨陽等[16]于2017年對14個(gè)SMA家系進(jìn)行MLPA檢測，發(fā)現(xiàn)正常胎兒6例，攜帶者7例，SMA患者3例。本研究73例孕婦攜帶者中60例配偶接受SMA篩查，2對夫婦同時(shí)為SMA攜帶者，并對2例高風(fēng)險(xiǎn)孕婦采集羊水通過MLPA行產(chǎn)前診斷，最終提示1例胎兒為SMN1基因E7/E8雙拷貝(正常)，另1例胎兒為SMN1基因E7/E8零拷貝(SMA患兒)。此外，因?yàn)镾MN2基因?yàn)镾MN1調(diào)節(jié)基因，其拷貝數(shù)與SMA的病情嚴(yán)重程度呈反比，所以在檢測羊水時(shí)都檢測了SMN2基因作為參考。本研究中1例胎兒為SMA患者，SMN2基因的E7/E8均為3拷貝，但預(yù)測其出生后的臨床表型介于Ⅱ型和Ⅲ型之間，仍然非常嚴(yán)重。該夫婦經(jīng)遺傳咨詢后選擇終止妊娠。

綜上所述，鑒于SMA疾病的嚴(yán)重程度、人群的高攜帶頻率和治療費(fèi)用昂貴的現(xiàn)狀，針對育齡人群的攜帶者篩查顯得尤為重要。在臨床工作和科普活動(dòng)中需要加大對育齡人群的宣教，進(jìn)行規(guī)范化的遺傳咨詢及必要的生育指導(dǎo)，從而避免SMA患兒的出生，為社會(huì)和家庭減輕負(fù)擔(dān)，從而提高出生人口質(zhì)量。