姚啟悅，趙永亮，李飛寰，任軍華，趙春杰，安星亮，王歡

(河南工業(yè)大學 生物工程學院，鄭州 450001)

油莎豆(Cyperusesculentus)又稱虎堅果、油莎草，是莎草科莎草屬的一年生草本油料作物，原產(chǎn)于非洲北部[1]，現(xiàn)廣泛分布于非洲、歐洲、亞洲、北美洲和南美洲的熱帶、亞熱帶、溫帶地區(qū)[2]。油莎豆莖葉是優(yōu)質(zhì)牧草和編織原料，塊莖生長于地下，形似花生，可直接食用，且含油量豐富，平均可達到20%～30%，其中不飽和脂肪酸占70%以上[3]，單位產(chǎn)量遠高于其他油料作物，有“油料之王”的美稱，油莎豆生命力強、根系發(fā)達、繁殖快、生物量大、抗逆性廣，能夠適應多種類型土壤，大規(guī)模利用邊際化土壤種植可起到防止水土流失、改善生態(tài)環(huán)境的作用[4]，目前在我國十幾個省廣泛種植，種植面積在25萬畝左右，一般畝產(chǎn)量為500～600 kg，主要分布在東北、西北、黃淮、長江流域等沙性土壤地區(qū)[5]。油莎豆基本成分中水分、蛋白質(zhì)、脂肪、糖、淀粉平均含量分別為7.00%、8.00%、26.50%、23.32%、23.21%，檢出有機酸、甾類化合物、萜類化合物等功能性成分[6]；研究表明油莎豆具有降血脂[7-8]、降血糖[9-10]、抗氧化[11-12]、保肝[13-14]、護胃[15]等生理功能。油莎豆作為新型油料作物，對未來減少大豆進口，提高食用油自給率，幫助改善環(huán)境與產(chǎn)業(yè)脫貧具有極大的發(fā)展前景與競爭力[16]。

納豆(natto)是大豆等豆類經(jīng)納豆枯草芽孢桿菌發(fā)酵得到的具有特殊風味和黏性多糖的發(fā)酵豆制品[17]，1980年日本學者須見洋行發(fā)現(xiàn)納豆能夠溶解人工血栓，隨后該團隊從納豆中提取出具有溶栓功能的激酶，并命名為納豆激酶(nattokinase,NK)[18]。NK是由275個氨基酸組成的單鏈多肽酶，是一種絲氨酸蛋白酶，分子量約為27 kDa，等電點在8.6左右[19]。NK在體內(nèi)外均表現(xiàn)出良好的溶栓效果[20]，現(xiàn)階段能夠溶解血栓的藥物及物質(zhì)非常多，常見的有尿激酶、鏈激酶等，相比于其他溶栓藥物，NK具有成本低、生物安全性好、副作用小、易被人體吸收、半衰期長等優(yōu)點[21]。NK除了能夠溶解血栓外，還具有預防骨質(zhì)疏松[22]、降血壓[23]、降血脂[24]、減脂助消化[25]、免疫調(diào)節(jié)[26]等功能。隨著人口老齡化的加劇，以心腦血管疾病為主的老年群體常見疾病備受關注，鮮食納豆受銷售環(huán)境和本身風味的影響推廣受限[27]，NK類保健食品和溶栓藥品的開發(fā)對老年群體的健康具有重大意義。

本研究以油莎豆粕為原料，以納豆枯草芽孢桿菌為發(fā)酵劑，以納豆激酶酶活為指標，通過優(yōu)化發(fā)酵條件，獲取更高的單位酶活，增強油莎豆粕的產(chǎn)業(yè)價值，為油莎豆資源的高效利用拓展了新途徑。

1 材料與方法

1.1 菌種

納豆枯草芽孢桿菌N500：河南工業(yè)大學分子生物實驗室保藏。

1.2 原材料

油莎豆粕：購自河北省定州市。

1.3 試劑

尿激酶標準品(50 mg,50 000 U/g)：上海源葉生物科技有限公司；牛纖維蛋白原(1 g/瓶)、凝血酶(1 000 U)、瓊脂：北京索萊寶科技有限公司；胰蛋白胨、酵母提取物：北京奧博星生物技術有限責任公司；NaCl、NaOH、HCl(均為分析純)：天津科密歐化學試劑有限公司。

1.4 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：酵母提取物0.5%，胰蛋白胨1%，氯化鈉1%，瓊脂2%，121 ℃滅菌20 min。

種子培養(yǎng)基：酵母提取物0.5%，胰蛋白胨1%，氯化鈉1%，調(diào)pH為7.0，121 ℃滅菌20 min。從4 ℃斜面保藏菌種中挑取1環(huán)接入10 mL種子培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)12 h后轉(zhuǎn)接至50 mL種子培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)12 h。

發(fā)酵培養(yǎng)基：油莎豆粕9.65 g，加水20.35 mL，50 ℃水浴浸泡2 h，115 ℃滅菌30 min。發(fā)酵前，移取5%的種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)48 h。

1.5 主要儀器與設備

LDZX-50KBS型立式壓力滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；THZ-312型臺式恒溫振蕩器、DK-8D型電熱恒溫水槽、SHP-150型生化培養(yǎng)箱 上海精宏實驗設備有限公司；Spark多功能酶標儀 帝肯(上海)貿(mào)易有限公司；SW-CJ-2F型雙人雙面凈化工作臺 蘇州凈化設備有限公司；FE22 pH計 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。

2 試驗方法

2.1 納豆枯草芽孢桿菌生長曲線的繪制

將活化的種子液按2%的接種量接種于液體LB培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)，每隔2 h取樣，以無菌液體LB培養(yǎng)基作空白對照，測定A600 nm值，以時間為橫坐標、A600 nm為縱坐標繪制生長曲線。

2.2 納豆激酶酶活的測定

采用瓊脂糖-纖維蛋白平板法[28-29]并稍作改進 測定酶活。配制濃度梯度分別為100，80，60，40，20，10 U/mL的尿激酶標準溶液，各取10 μL尿激酶溶液于打孔后的纖維蛋白平板上，設置3個平行，在37 ℃生化培養(yǎng)箱中恒溫孵育18 h,用游標卡尺測量透明溶解圈的兩條垂直直徑，取其平均值計算其面積S=πd2/4，并繪制標準曲線。

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2.3 粗酶液的制備

豆粕培養(yǎng)基發(fā)酵結束后置于4 ℃冰箱中后熟12 h，按料液比(干納豆∶生理鹽水)為1∶5(g/mL)加入生理鹽水快速振蕩30 min，3 000 r/min離心10 min，取上清液即為粗酶液，取10 μL粗酶液于打孔后的纖維蛋白平板上，設置3個平行，在37 ℃生化培養(yǎng)箱中恒溫孵育18 h，用游標卡尺測量透明溶解圈的兩條垂直直徑，取其平均值計算面積，根據(jù)尿激酶標準曲線方程計算出粗酶液酶活。

2.4 單因素試驗

2.4.1 油莎豆粕含水量對納豆激酶活性的影響

油莎豆粕含水量影響發(fā)酵過程中菌體的生長和營養(yǎng)基質(zhì)的溶解與傳遞，將其粗顆粒按照干重加入一定比例的蒸餾水,使其含水量分別為55%、60%、65%、70%、75%、80%，50 ℃水浴加熱浸泡2 h，115 ℃高溫高壓滅菌30 min，接種量為5%，37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，后熟時間12 h，設置3個平行，考察豆粕含水量對產(chǎn)酶的影響。

2.4.2 納豆菌接種量對納豆激酶活性的影響

接種量影響納豆菌的發(fā)酵速度。豆粕含水量為70%，50 ℃水浴加熱浸泡2 h，115 ℃高溫高壓滅菌30 min，分別接入2%、5%、8%、11%、14%、17%的種子液，37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，后熟12 h，設置3個平行，考察接種量對產(chǎn)酶的影響。

2.4.3 發(fā)酵溫度對納豆激酶活性的影響

每種菌都有其最適的生長溫度，其生長和發(fā)酵過程中的溫度影響酶促反應速率。豆粕含水量為70%，50 ℃水浴加熱浸泡2 h，115 ℃高溫高壓滅菌30 min，接種量為5%，發(fā)酵溫度分別為28，31，34，37，40，43 ℃，發(fā)酵時間為48 h，后熟12 h，設置3個平行，考察溫度對產(chǎn)酶的影響。

2.4.4 發(fā)酵周期對納豆激酶活性的影響

發(fā)酵時間影響納豆菌的生長周期和產(chǎn)酶代謝。豆粕含水量為70%，50 ℃水浴加熱浸泡2 h，115 ℃高溫高壓滅菌30 min，接種量5%，發(fā)酵溫度37 ℃，發(fā)酵時間分別為36，48，60，72，84，96 h，后熟12 h，設置3個平行，考察發(fā)酵周期對產(chǎn)酶的影響。

2.5 正交試驗

根據(jù)單因素試驗結果，選擇含水量、接種量、發(fā)酵溫度和發(fā)酵周期4個因素進行四因素三水平正交試驗，進一步優(yōu)化油莎豆粕發(fā)酵工藝。

2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

使用IBM SPSS Statistics 20分析軟件分析數(shù)據(jù)的顯著性，以P<0.05為顯著性檢驗標準，數(shù)據(jù)使用Origin 2018軟件繪圖。

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3 結果與分析

3.1 納豆枯草芽孢桿菌生長曲線

采用比濁法測定納豆菌的生長曲線，結果見圖1中a。納豆枯草芽孢桿菌的生長基本符合微生物生長周期的4個階段：0～2 h生長緩慢，處于調(diào)整期；2～8 h納豆菌生長迅速，處于對數(shù)期；8～14 h為穩(wěn)定期；14 h以后為緩慢衰亡期，應接種8 h處于對數(shù)生長期的納豆菌。

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3.2 尿激酶標準曲線

采用瓊脂糖-纖維蛋白平板法。以纖溶圈面積為橫坐標、標準尿激酶活力的對數(shù)值為縱坐標，繪制標準曲線，得到曲線方程y=0.006 8x+0.286，R2=0.998；二者呈線性相關，因此可通過將粗酶液在瓊脂糖-纖維蛋白平板上的溶解圈面積代入回歸方程而求得對應的尿激酶酶活。尿激酶標準曲線見圖1中b。

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3.3 單因素試驗

不同單因素對納豆激酶活性的影響見圖2。

當接種量為5%、發(fā)酵溫度為37 ℃、發(fā)酵時間為48 h時，考察含水量對納豆激酶酶活的影響，結果見圖2中a。油莎豆粕含水量對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響較大，當油莎豆粕含水量為70%時，發(fā)酵后納豆激酶活性最高。含水量過少時，納豆菌難以生長，產(chǎn)酶降低；豆粕含水量過高時，表面會形成一層白膜，影響發(fā)酵基質(zhì)空氣交換，納豆菌供氧不足，生長緩慢，導致酶產(chǎn)量降低。因此，試驗最佳豆粕含水量選取70%。

當含水量為70%、發(fā)酵溫度為37 ℃、發(fā)酵時間為48 h時，考察接種量對納豆激酶酶活的影響，結果見圖2中b。隨著菌液接種量的增大，納豆激酶活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，接種量過小時，菌體在豆粕培養(yǎng)基中無法充分生長，需要較長時間繁殖積累，無法發(fā)酵完全，從而延長發(fā)酵周期；接種量過大時，菌體繁殖旺盛，加速發(fā)酵培養(yǎng)基營養(yǎng)基質(zhì)的消耗及有害代謝產(chǎn)物的積累，導致其次級代謝被抑制，產(chǎn)酶量降低。接種量為5%時，菌體生長速率適中，既能實現(xiàn)菌體的大量積累，次級代謝也可正常進行，酶活最高。因此，試驗最佳菌液接種量選取5%。

當含水量為70%、接種量為5%、發(fā)酵時間為48 h時，考察發(fā)酵溫度對納豆激酶酶活的影響，結果見圖2中c。隨著發(fā)酵溫度的升高，納豆激酶的活性顯現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，發(fā)酵溫度為40 ℃時，納豆激酶活性最高；當溫度高于40 ℃時，酶活逐漸減弱。微生物都有其最適的生長溫度，一定范圍內(nèi)，溫度升高能提高菌體的生長速率、酶促反應速率及蛋白合成速率；溫度過高時，生長及產(chǎn)酶能力均會下降，導致酶活降低。因此，試驗最佳發(fā)酵溫度選取40 ℃。

當含水量為70%、接種量為5%、發(fā)酵溫度為37 ℃時，考察發(fā)酵周期對納豆激酶酶活的影響，結果見圖2中d。隨著發(fā)酵時間的延長，納豆激酶活性呈現(xiàn)先升高后緩慢降低的趨勢，在發(fā)酵36～72 h過程中，納豆激酶活性呈升高趨勢；發(fā)酵時間為72 h時，酶活性最高；發(fā)酵時間超過72 h后，油莎豆粕培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)不足以支撐納豆菌的正常代謝，同時次級代謝副產(chǎn)物逐漸增加，影響了納豆激酶分泌，從而導致納豆激酶酶活緩慢降低。因此，試驗最佳發(fā)酵周期選取72 h。

3.4 正交試驗

在單因素試驗結果的基礎上，選取A含水量、B接種量、C發(fā)酵溫度和D發(fā)酵周期4個因素為變量，進行L9(34)正交試驗,試驗因素水平表見表1，正交試驗結果見表2。

表1 正交試驗因素和水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test

表2 正交試驗結果與分析Table 2 Orthogonal test results and analysis

由表2可知，各因素對納豆激酶活性的影響程度大小為A>C>B>D，最佳納豆激酶酶活的試驗方案為A3B2C1D3,即油莎豆粕含水量是影響產(chǎn)酶的主要因素，其次是發(fā)酵溫度，接種量和發(fā)酵周期對產(chǎn)酶的影響較小。

由表3可知，油莎豆粕含水量和發(fā)酵溫度對納豆激酶酶活的影響極顯著(P<0.01)，接種量和發(fā)酵周期對納豆激酶酶活的影響不顯著。綜合T檢驗和方差分析可知，正交試驗優(yōu)化后確定的最適發(fā)酵條件是豆粕含水量75%、接種量5%、發(fā)酵溫度37 ℃、發(fā)酵周期84 h，所得納豆激酶酶活為10 382.90 U/g。

表3 各因素對油莎豆粕培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)納豆激酶活性的方差分析Table 3 Variance analysis of various factors on the activity of nattokinase produced from Cyperus esculentus meals media fermentation

4 結論與討論

通過單因素和正交試驗優(yōu)化后，得出油莎豆粕發(fā)酵產(chǎn)納豆激酶的最佳工藝條件是豆粕含水量75%、接種量5%、發(fā)酵溫度37 ℃、發(fā)酵周期84 h。在此優(yōu)化條件下，所得納豆激酶平均酶活為10 382.90 U/g，氨臭味較輕。

劉野等[30]利用單因素試驗和響應面分析，以黃豆為原料對納豆發(fā)酵條件進行優(yōu)化，得到納豆激酶活性為2 493.33 U/g。張紅運等[31]通過單因素試驗和正交試驗，以豆渣為原料優(yōu)化固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)納豆激酶工藝，得到酶活為1 734 U/g。郭玩湘等[32]利用單因素試驗和正交試驗，優(yōu)化以豆粕與麩皮為原料的納豆激酶固態(tài)發(fā)酵工藝，最高酶活達到6 642 U/g。本試驗優(yōu)化得到的納豆激酶活性最高達到10 382.90 U/g，明顯高于以大豆及其豆粕為原料發(fā)酵得到的納豆激酶酶活，單位酶活力提高了56.32%，為油莎豆粕的利用和納豆激酶的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供了參考途徑。