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新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸與呼吸危重中心二病區(qū)，烏魯木齊 830011

宏基因組二代測(cè)序（mNGS）是一種可同時(shí)獨(dú)立無(wú)偏移檢測(cè)數(shù)千至上億基因片段的檢測(cè)技術(shù)，其可以同步迅速檢測(cè)各類(lèi)標(biāo)本中的多種病原體，如細(xì)菌、病毒、真菌和寄生蟲(chóng)等，在感染性疾病診斷中的臨床應(yīng)用越來(lái)越多。免疫功能低下患者包括接受長(zhǎng)期或大劑量類(lèi)固醇或其他免疫抑制藥物的患者、實(shí)體器官移植患者、過(guò)去5年需要化療的實(shí)體瘤患者或自診斷和接受治療以來(lái)的任何時(shí)間患有血液系統(tǒng)惡性腫瘤，以及患有原發(fā)性免疫缺陷的患者［1］。在免疫功能低下的肺部感染患者中，細(xì)菌性肺炎最多見(jiàn)，其次是病毒和侵襲性真菌感染，常規(guī)微生物檢測(cè)方法（CMTs）存在周期長(zhǎng)、準(zhǔn)確性有限等缺點(diǎn)，尤其在處理多種病原體混合感染、危重癥患者時(shí)，易出現(xiàn)診斷延遲或疏漏［2］。mNGS作為一種新的檢測(cè)手段，拓寬了病原體檢查的途徑和范圍，提高了檢測(cè)效率，從而幫助患者改善預(yù)后。現(xiàn)就mNGS在免疫功能低下肺部感染患者診斷中的臨床應(yīng)用綜述如下。

1 mNGS在惡性血液病肺部感染患者診斷中的應(yīng)用

自體干細(xì)胞移植是某些血液系統(tǒng)惡性腫瘤的主要治療方法之一，在移植之前要進(jìn)行大劑量的化療，因而會(huì)引發(fā)免疫功能低下，這也是該類(lèi)患者發(fā)生較高治療相關(guān)并發(fā)癥及病死率的原因。肺部感染是自體干細(xì)胞移植中最常見(jiàn)的并發(fā)癥，占所有并發(fā)癥的60%［3］。在干細(xì)胞移植后，mNGS早期可起到鑒別肺部滲出病變是否為肺部感染的作用，晚期可迅速檢測(cè)出感染的病原體，而且mNGS檢測(cè)結(jié)果不受免疫抑制或粒細(xì)胞缺乏的影響［4］。

一項(xiàng)回顧性研究納入了71例造血干細(xì)胞移植后發(fā)熱患者，根據(jù)mNGS和CMTs結(jié)果確診54例肺部感染，比較mNGS與CMTs對(duì)肺部感染的診斷價(jià)值發(fā)現(xiàn)，mNGS總體敏感度高于CMTs，但特異度低于CMTs，考慮其原因可能與標(biāo)本類(lèi)型及mNGS測(cè)序序列數(shù)設(shè)置有關(guān)［4］。在mNGS檢測(cè)結(jié)果中，最多被識(shí)別到的病原體是病毒，其中巨細(xì)胞病毒（CMV）占比最高；其次是混合感染，以細(xì)菌—病毒混合感染最多。感染類(lèi)型在移植的不同時(shí)期各不相同，但不論哪個(gè)時(shí)期，主要致病菌都是CMV， 血液中CMV DNA的熒光定量PCR是首選診斷方法， 但在免疫抑制狀態(tài)的患者中，有50%無(wú)法在血液中檢測(cè)到CMV DNA［5］，而血清抗體在這些免疫功能低下患者中可能是陰性或者不確定有沒(méi)有產(chǎn)生相應(yīng)抗體［6］。與CMTs比較，mNGS對(duì)CMV有更好的診斷效率，彌補(bǔ)了CMTs肺部CMV感染檢出率低的不足。對(duì)于高度懷疑病毒性肺炎且CMTs持續(xù)結(jié)果陰性患者，mNGS技術(shù)能為其診斷提供進(jìn)一步的線索。

有研究發(fā)現(xiàn)，mNGS在血液系統(tǒng)惡性腫瘤患者中有比CMTs更高的肺部感染檢測(cè)敏感性（87.3%vs34.5%）［7］。mNGS檢測(cè)結(jié)果顯示，血液系統(tǒng)惡性腫瘤患者肺部感染最常見(jiàn)的細(xì)菌、病毒和真菌分別為肺炎鏈球菌、CMV和曲霉菌，最常見(jiàn)的混合感染類(lèi)型是細(xì)菌—病毒、真菌—病毒。通過(guò)mNGS檢測(cè)結(jié)果，該研究中90.9%的肺部感染患者及時(shí)進(jìn)行了合適抗菌藥物治療，30 d病死率為7.3%，這提示mNGS技術(shù)對(duì)于提高血液系統(tǒng)惡性腫瘤患者抗菌藥物治療療效以及降低病死率具有積極意義。

研究顯示，肺部感染是血液病中性粒細(xì)胞減少伴發(fā)熱患者死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素［8］。ZHANG等［9］在抗生素治療失敗后伴有發(fā)熱性中性粒細(xì)胞減少癥的惡性血液病患者中檢測(cè)出192例重癥肺炎患者，使用mNGS技術(shù)聯(lián)合CMTs進(jìn)行病原體檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)mNGS和CMTs的病原體總檢出率分別為80%和25%，其中細(xì)菌檢出率分別為48%及9%、病毒檢出率分別為42%及12%、真菌檢出率分別為22%及4%。mNGS和CMTs檢測(cè)出的常見(jiàn)細(xì)菌、病毒和真菌種類(lèi)是一致的，分別是葡萄球菌、CMV及曲霉菌；二者在混合感染中的檢測(cè)敏感度分別為80%和4%。該研究中，臨床醫(yī)生根據(jù)mNGS檢測(cè)結(jié)果對(duì)45%的患者調(diào)整了抗生素治療方案，并且有52%的患者癥狀得到有效緩解。

2 mNGS在實(shí)體器官移植肺部感染患者診斷中的應(yīng)用

急性器官移植后排斥反應(yīng)隨著免疫抑制劑的應(yīng)用顯著下降，但實(shí)體器官移植患者機(jī)會(huì)性感染的發(fā)生率及病死率仍然較高，其中以肺部感染最為多見(jiàn)。孟現(xiàn)林等［10］報(bào)道了35例在ICU治療的器官移植后感染肺炎患者，通過(guò)mNGS技術(shù)檢測(cè)出20例病毒性感染，而CMTs僅檢測(cè)出2例，提示mNGS在檢測(cè)敏感度上有明顯優(yōu)勢(shì)；mNGS對(duì)細(xì)菌的敏感度為93%，陰性預(yù)測(cè)值（NPV）為91%，其中銅綠假單胞菌、鮑曼不動(dòng)桿菌及肺炎克雷伯菌的檢出率較高。該研究中mNGS聯(lián)合CMTs后確診混合感染患者為23例，僅通過(guò)mNGS技術(shù)診斷出21例患者為混合感染。對(duì)于真菌，mNGS沒(méi)有體現(xiàn)出明顯優(yōu)勢(shì)，比如，CMTs在檢測(cè)白色念珠菌及熱帶念珠菌方面顯示出一定優(yōu)勢(shì)，而mNGS對(duì)曲霉菌的檢出率更高，這可能與mNGS技術(shù)核酸提取時(shí)破壁困難引起的低序列有關(guān)。因此，mNGS可以作為ICU住院的器官移植患者病毒及細(xì)菌感染的常規(guī)診斷方法，但在真菌鑒定中，mNGS和CMTs均有各自?xún)?yōu)勢(shì)， 目前大部分學(xué)者也認(rèn)為mNGS在檢測(cè)細(xì)菌方面其性能優(yōu)于CMTs，但在真菌檢測(cè)方面遜于 CMTs［10］。

對(duì)于肺移植后早期感染患者，mNGS診斷肺部感染的檢出率顯著高于CMTs（97.14%vs68.57%），并且mNGS具有更高的NPV（83.33%），有助于排除感染，從而協(xié)助臨床方案的選擇。在51份肺泡灌洗液（BALF）標(biāo)本中，mNGS鑒定出148種病原體，體現(xiàn)了其檢測(cè)范圍廣泛的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。其中，細(xì)菌有94種（68%），最常見(jiàn)的細(xì)菌是葡萄球菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌；鑒定出的真菌和病毒在綜合評(píng)估后被認(rèn)為是定植菌。所以，臨床醫(yī)生需結(jié)合mNGS、CMTs、流行病學(xué)史和臨床特征后綜合判斷致病病原體。在臨床中，器官移植后早期很難區(qū)分感染與急性排斥反應(yīng)。研究顯示，器官移植早期mNGS檢測(cè)陰性結(jié)果對(duì)肺部感染鑒別診斷有輔助作用。尤其對(duì)于嗜肺軍團(tuán)菌、膿腫分枝桿菌等非典型病原體，mNGS檢測(cè)具有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。根據(jù)mNGS和CMTs結(jié)果可以對(duì)62%的患者調(diào)整抗生素治療方案，從而使患者病情明顯好轉(zhuǎn)［11］。除了上述BALF的標(biāo)本以外，血標(biāo)本可以成為另一種替代選擇，尤其是在病因不明的無(wú)法選擇支氣管鏡檢查的肺部感染中［12］。

3 mNGS在先天性免疫缺陷肺部感染患者診斷中的應(yīng)用

先天性免疫缺陷（IEI）是由單基因突變引發(fā)的一種遺傳性疾病，肺部感染是IEI患者反復(fù)住院和最終死亡的主要原因［13］。在一項(xiàng)前瞻性研究中發(fā)現(xiàn)，IEI患者急性感染住院率為85%，雖然在早期會(huì)預(yù)防性使用抗感染治療，但仍有40%的患者病情無(wú)法得到控制，而且有藥物相關(guān)毒性反應(yīng)和抗病毒耐藥性的風(fēng)險(xiǎn)發(fā)生［14］。因此，及時(shí)有效識(shí)別并進(jìn)行抗感染治療對(duì)于降低感染相關(guān)病死率具有重要意義。

CMV是常見(jiàn)的機(jī)會(huì)性病原體，幾乎所有IEI患者都會(huì)感染CMV，CMV感染是IEI患者進(jìn)行移植前后感染發(fā)病率及病死率的獨(dú)立危險(xiǎn)因素［15］。TANG等［14］研究了15例IEI疑似肺部感染患者，發(fā)現(xiàn)CMTs和mNGS檢測(cè)結(jié)果一致率為73.3%，而細(xì)菌培養(yǎng)法與mNGS的一致性?xún)H為33.3%，可能因?yàn)榛颊咴缙诮邮芙?jīng)驗(yàn)性抗菌藥物治療降低了細(xì)菌培養(yǎng)法的檢出率。mNGS與臨床診斷的陽(yáng)性一致性顯著高于CMT和培養(yǎng)法（分別為93.75%、68.75%和31.25%）。先天性免疫缺陷患者更易感染機(jī)會(huì)性病原體和非典型病原體，而這些病原體很難通過(guò)傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)法、PCR、血清抗體等CMTs鑒定出來(lái)。mNGS能夠迅速、精準(zhǔn)、全面的識(shí)別病原體，對(duì)抗生素治療方案的選擇及調(diào)整有很大幫助，也對(duì)排除感染和減少抗菌藥物濫用具有重要價(jià)值。

4 mNGS在艾滋病肺部感染患者診斷中的應(yīng)用

機(jī)會(huì)性感染是艾滋病患者的主要死因之一，在艾滋病患者中，肺部感染發(fā)生率為70%。XU等［16］使用mNGS檢測(cè)了46例艾滋病患者疑似機(jī)會(huì)性感染的病原體，結(jié)合mNGS、CMTs和臨床表現(xiàn)后確診33例為機(jī)會(huì)性感染，通過(guò)mNGS技術(shù)檢測(cè)出JC病毒和惠普萊毛蕨等特殊病原體，但CMTs未能鑒定出這些特殊病毒和非典型病原體。mNGS對(duì)真菌、非結(jié)核分枝桿菌和病毒的檢測(cè)敏感度分別為90.91%、100%及100%，相應(yīng)特異度也較高（分別為74.29%、86.67%及91.11%），而對(duì)于真菌檢測(cè)敏感度較其他研究［17］明顯增高，這可能是由于該研究的樣本量較小造成的。mNGS及CMTs兩種診斷方法對(duì)其他病原體（細(xì)菌、結(jié)核分枝桿菌、病毒等）檢出率沒(méi)有顯著差異；混合感染患者的CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯低于單一感染患者，提示CD4+T淋巴細(xì)胞減低患者更容易發(fā)生混合感染，所以mNGS可能對(duì)CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)低的患者更有診斷價(jià)值。在鑒別非感染性病因中，mNGS檢測(cè)結(jié)果能夠起到提示性作用，如1例艾滋病患者淋巴結(jié)活檢確診為卡波氏肉瘤，mNGS在淋巴結(jié)組織中也檢出皰疹病毒8型，對(duì)最終確診有較好的提示意義［16］。

多項(xiàng)關(guān)于艾滋病患者中罕見(jiàn)病原體感染的病例報(bào)告，如利什曼原蟲(chóng)、巴爾通體、剛地弓形蟲(chóng)等，均是通過(guò)mNGS鑒定確診的［17］。因此，在臨床上對(duì)于多次CMTs結(jié)果陰性且多次經(jīng)驗(yàn)性抗感染治療無(wú)效患者推薦使用mNGS檢測(cè)方法，對(duì)早期鑒定病原體后及時(shí)調(diào)整治療方案，進(jìn)一步改善臨床預(yù)后及降低病死率有幫助。mNGS有望成為艾滋病患者一線診斷方法，但檢測(cè)到的病原體可能不是真正的致病病原體，可能是污染或定植菌，因此最好的診斷策略是mNGS和CMTs結(jié)合綜合評(píng)估。

綜上所述，肺部感染是各類(lèi)免疫功能低下患者發(fā)病率與病死率的較高重要原因之一，及時(shí)準(zhǔn)確的病原學(xué)診斷對(duì)這些患者極其重要。mNGS在檢測(cè)免疫抑制患者感染性病原體中具有巨大的診斷潛力，在未來(lái)可能成為補(bǔ)充常規(guī)診斷方法的寶貴工具，尤其在CMTs不能及時(shí)明確病原體種類(lèi)時(shí)。