劉 爽 姚 粟 李 婷 翟 磊 姚晨之?

1.中國日用化學工業(yè)研究院有限公司，山西太原，030001；

2.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司，北京，100015

釀膿鏈球菌（Streptococcus pyogenes）屬于鏈球菌屬，是乙型溶血性鏈球菌的一種，常存在于水、空氣及人的口腔、鼻腔和咽喉。釀膿鏈球菌為兼性厭氧菌，在培養(yǎng)環(huán)境中添加5%二氧化碳有助于其生長及溶血性。釀膿鏈球菌致病機制較為復雜，能引起人的多種疾病，引起的相對輕微的非侵襲性疾病一般包括咽炎、急性扁桃體炎、急性輸卵管炎[1]、膿包病、猩紅熱；也可能引起侵襲性疾病，如壞死性筋膜炎、菌血癥和鏈球菌中毒休克綜合征；還可以造成嚴重的非化膿性后遺癥，如風濕性心臟病和急性腎小球炎[2-3]。呼吸道飛沫被認為是釀膿鏈球菌的主要傳播途徑，同時，接觸該菌感染引起的潰瘍或者被其污染的材料、器械也可能引起傳播，食源性傳播也有報道[4]。流行病學顯示，釀膿鏈球菌感染的常見環(huán)境為醫(yī)院、幼兒園、收容所等人群密集場所，具有時空聚集性[5]，個人和手衛(wèi)生不良會加劇傳播風險[6]，因此加強個人手部衛(wèi)生和公共環(huán)境消毒來切斷釀膿鏈球菌的傳播是有效的預防措施。

對于釀膿鏈球菌的檢測，目前最常用的是傳統(tǒng)分離技術，但其過程煩瑣、耗時較長，較為依賴肉眼觀察結果，難以應對突發(fā)的公共衛(wèi)生安全事件，也難以滿足相關食品、用品快速流通的需求。本文對釀膿鏈球菌生物學特性及致病機制進行介紹，指出該菌的關鍵毒力因子，并總結了目前常見的釀膿鏈球菌檢測方法，對尋找新的檢測靶點，建立更準確、高效的釀膿鏈球菌快速檢測方法，進一步加強對釀膿鏈球菌感染的預防有重要意義。

1 生物學特性

1.1 形態(tài)特性

釀膿鏈球菌為革蘭氏陽性菌，菌體形態(tài)呈圓形或卵圓形，直徑為0.5～1 μm。通常呈鏈狀排列，不形成芽孢，有莢膜，無鞭毛，不運動。其菌毛具有抗原性，常應用于T血清型鑒定[7-8]。

1.2 培養(yǎng)特性

釀膿鏈球菌為兼性厭氧菌，初代培養(yǎng)需要5% CO2的環(huán)境以促進生長。最適生長溫度為35～37 ℃，生長的pH為7.4～7.6。對營養(yǎng)要求較高，通常需要在普通培養(yǎng)基上補充血清、血液、腹水等。在液體培養(yǎng)基中易成長鏈，于管底呈絮狀或顆粒狀沉淀生長。在血瓊脂平板上形成灰白色、透明或半透明、表面光滑或略粗糙、邊緣整齊的圓形凸起細小菌落，菌落周圍形成透明的溶血環(huán)[9]。有研究表明，釀膿鏈球菌的菌落形態(tài)有明顯的M蛋白分型特異性[10]。此外，高濃度還原糖會抑制溶血[11]。

其液體培養(yǎng)基包括TSB肉湯（tryptic soy broth）、THB肉湯（todd-hewitt broth）和BHI肉湯（brain heart infusion broth）。THB肉湯通常用于釀膿鏈球菌血清學分型的培養(yǎng)。

1.3 生化特性

釀膿鏈球菌具有葡萄糖、乳糖和蘋果酸攝取途徑，優(yōu)先使用葡萄糖作為主要能量來源[12]。不分解尿素，桿菌肽和鏈激酶實驗呈陽性。過氧化氫酶活性為陰性。釀膿鏈球菌對青霉素、氨芐霉素等抗生素敏感。L-吡咯烷酮芳胺酶實驗可將釀膿鏈球菌與無乳鏈球菌區(qū)分開，奧普托欣耐藥實驗呈陽性可分辨其與肺炎鏈球菌。

1.4 釀膿鏈球菌致病機制

釀膿鏈球菌主要定植于咽喉和皮膚的黏膜，導致各種形式的非侵入性或侵入性的感染及并發(fā)癥。這些感染涉及呼吸道、皮膚和軟組織以及血液，嚴重時甚至危及生命[13]。因此，了解釀膿鏈球菌的致病機制以及對其引起的疾病的監(jiān)督非常重要，有利于為這些疾病的控制和預防奠定基礎。流行病學調查結果顯示不同菌株之間不僅存在通用的致病機制，還會因為具有不同遺傳背景而具有獨特的致病機制。本文對釀膿鏈球菌的通用致病機制進行概述。

1.4.1 釀膿鏈球菌的黏附定植

人類皮膚是一種不適宜細菌定植的環(huán)境，包括角質層的物理屏障、酸性表面pH值以及天然防御因子（如抗菌肽、蛋白酶、溶菌酶、細胞因子和趨化因子）的積極合成，這些因子共同用于募集免疫細胞和啟動適應性免疫反應[14]。為了成功地在皮膚或咽喉中定植或建立感染，釀膿鏈球菌會依賴某些特異性的黏附因子，使得在定植過程中與組織上正常的常在菌群競爭時處于有利地位。在皮膚的黏附定植過程中，皮膚存在的傷口使釀膿鏈球菌更容易克服第一道屏障，同時釀膿鏈球菌也可以分泌某些毒力因子對咽喉上皮細胞或者皮膚上皮細胞造成直接損傷。研究表明，廣譜半胱氨酸蛋白酶（SpeB）基因廣泛存在于釀膿鏈球菌中，該酶可以降解宿主表面蛋白，破壞組織屏障，方便釀膿鏈球菌入侵宿主并建立感染。此外，有研究認為釀膿鏈球菌在不同的環(huán)境下會表達不同的黏附素以促進其進入皮膚深層組織，如介導了釀膿鏈球菌對上皮細胞黏附能力60%的脂磷壁酸（lipoteichoic acid，LTA）。

目前對釀膿鏈球菌黏附過程的代表性理論是兩步法模型，即第一步是通過LTA介導細菌克服和宿主之間的靜電斥力，這一黏附過程作用相對較弱，是可逆性黏附。第二步通過菌毛、M蛋白或血清混濁因子形成較為穩(wěn)定的、非可逆的黏附。

1.4.2 入侵上皮細胞

釀膿鏈球菌具有一定的入侵上皮細胞的能力，主要依賴于M蛋白和纖連蛋白結合蛋白的表達。纖連蛋白是一種多結構域糖蛋白，由約250 kDa單體的二聚體組成，存在于人體體液、細胞表面和各種組織的細胞外基質[15]，釀膿鏈球菌通過纖連蛋白結合蛋白與纖連蛋白結合，并利用纖連蛋白與宿主整合素之間的親和力，此處纖連蛋白的作用類似于釀膿鏈球菌黏附到宿主細胞的橋梁，進而激活包括磷酸肌醇3-激酶和整合素連接激酶等在內的信號通路，從而導致細胞骨架肌動蛋白的重排及形態(tài)變化，并通過幾種不同的機制誘導細菌內化到宿主細胞中[16-17]。有研究從無法根治鏈球菌咽炎的患者扁桃體中發(fā)現(xiàn)侵入細胞內的釀膿鏈球菌，證明了釀膿鏈球菌入侵上皮細胞的現(xiàn)象[18]。

1.4.3 免疫逃逸

進入機體之后的釀膿鏈球菌還要克服各種不利的體內環(huán)境，主要包括宿主的固有免疫應答以及感染過程遇到的各種細胞。釀膿鏈球菌主要依賴自身多種毒力因子逃避宿主攻擊以便于在新的體內環(huán)境存活，這些毒力因子主要包括M蛋白、DNA酶sda 1以及莢膜多糖。

當細菌侵入宿主后，宿主中性粒細胞會分泌一種由DNA、組蛋白、顆粒蛋白酶和抗菌肽組成的中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)（neutrophil extracellular trap，NET），用以清除感染的細菌。某些釀膿鏈球菌中含有sda1基因，其編碼DNA酶并分泌到細菌外部降解NET框架，從而使釀膿鏈球菌逃避NET的清除殺傷作用。此外，釀膿鏈球菌表面的M蛋白也可以通過抑制吞噬細胞的吞噬作用幫助其免疫逃逸。還有一些強毒力的釀膿鏈球菌表面具有莢膜包裹，莢膜主要由透明質酸多糖組成，與宿主結締組織中的多糖類似，因此可能利用該機制逃避宿主免疫作用。

1.4.4 細胞損傷與炎癥反應

進入機體后，釀膿鏈球菌通過各種胞外產物和毒素使宿主產生細胞損傷和炎癥反應。釀膿鏈球菌可以分泌兩種鏈球菌溶血素，分別是鏈球菌溶血素O（streptolysin o，SLO）和鏈球菌溶血素S（streptolysin s，SLS）。SLO是一種依賴膽固醇的溶細胞素，它通過誘導中性粒細胞和巨噬細胞凋亡來保護細菌免受吞噬性殺傷[19-20]。SLS是一種由9個連續(xù)基因編碼修飾的多肽性細胞溶素，除了溶解紅細胞以外還可以損害多種細胞，如淋巴細胞、腫瘤細胞、角質細胞和白細胞等，在釀膿鏈球菌致病過程中發(fā)揮重要作用[21]。

鏈球菌致熱性外毒素家族由speA、speB、speC、speJ、speH和speK基因編碼，屬于超抗原。它們能夠刺激定植生物體的T淋巴細胞和B淋巴細胞的活性，導致強烈的免疫反應，進而使炎癥因子過度釋放，引起猩紅熱等[22]。speB基因廣泛存在于釀膿鏈球菌中，與侵襲性和非侵襲性感染都有關系。而在釀膿鏈球菌菌株中檢測到speA或speJ基因可能與侵襲性感染的潛在發(fā)展有關，Kittang等[23]證明了這些基因與感染侵襲性之間的關系，分離出攜帶這些基因的釀膿鏈球菌菌株的患者分別發(fā)生了以下感染：壞死性筋膜炎、中毒休克綜合征、肺炎、腦膜炎和腹膜炎。

2 釀膿鏈球菌的檢測方法

2.1 傳統(tǒng)檢測方法

目前我國食品中釀膿鏈球菌的傳統(tǒng)檢測方法為GB 4789.11―2014《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 β型溶血性鏈球菌檢驗》，標準中使用前增菌、平板分離、革蘭氏染色鏡檢的方法，并增加了觸酶試驗以及生化鑒定。吳福平等[24]利用胰蛋白胨大豆肉湯TSB增菌液、哥倫比亞CNA血平板厭氧培養(yǎng)釀膿鏈球菌，發(fā)現(xiàn)增菌、分離效果優(yōu)于葡萄糖肉浸液肉湯和普通血瓊脂平板，且使用生化鑒定能有效簡化實驗操作，縮短檢測周期。譙林等[25]采用在血平板中加入10%結晶紫的方法培養(yǎng)釀膿鏈球菌咽拭子，陽性率從2%～8.33%提高至30.7%～40.1%。

2.2 免疫學檢測方法

2.2.1 酶聯(lián)免疫吸附技術（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）

ELISA是以免疫酶技術為基礎發(fā)展起來的一種新的免疫測定技術[26]，其基本原理是先將抗原或抗體與固相載體結合，當加入酶標抗體或抗原時，會經過反應形成酶標免疫復合物，用洗滌液將未反應的游離酶標抗原抗體洗掉，再加入酶底物進行顯色反應，便于進行定性定量分析。王萬相等[27]建立了ELISA法診斷釀膿鏈球菌，其檢測結果與傳統(tǒng)培養(yǎng)法一致且用時更短。近年來，ELISA技術的不斷改進以及全自動酶標儀的發(fā)明，使其靈敏度和特異度都有了顯著提高[28]。

2.2.2 免疫層析技術

免疫層析技術最早出現(xiàn)于20世紀80年代，1990年Beggs[29]首次報道了使用斑點層析技術檢測孕婦尿液中的人絨毛膜促性腺激素，用于判定孕情。目前免疫層析技術主要分為膠體金免疫層析技術和熒光微球免疫層析技術，常見的免疫層析試紙包括4個部分：樣本墊、結合墊、層析膜和吸水墊。當樣品滴加到試紙條上時，會利用毛細作用在纖維膜上泳動，隨后與結合墊上的特定配體結合，繼續(xù)泳動直至與纖維膜上的著色標記物或酶反應，顯示出顏色變化，便于肉眼觀察結果。傳統(tǒng)的膠體金免疫層析技術僅能對樣品進行定性或半定量分析，相比而言，熒光微球技術便于進行定量檢測，且熒光微球具有結構穩(wěn)定、可重復利用等優(yōu)點。李泓馨等[30]對比了膠體金法和傳統(tǒng)培養(yǎng)方法檢測釀膿鏈球菌，膠體金法的敏感度為90.5%，特異度為94.8%，證實該方法可用于兒童鏈球菌感染性疾病的快速診斷，但也有文獻報道[31]該方法對成人釀膿鏈球菌咽炎的檢測靈敏度和特異度高于兒童，在用于兒童的病情檢測時應加以輔助手段。Vanesa等[32]采用Monte BIO Strep A?免疫層析試劑盒對兒童醫(yī)院的患兒樣本進行檢測，得到的試劑盒敏感度為97.1%，特異度為97.8%，但是在唾液鏈球菌分離的血液培養(yǎng)樣本中獲得了假陽性結果，說明盡管免疫層析技術具有高特異度、敏感度，但仍需后續(xù)培養(yǎng)和鑒定來確認鑒定結果。

2.3 分子生物學檢測方法

2.3.1 普通PCR方法

聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）是一種對特定DNA片段在體外進行快速擴增的方法，近年來，PCR作為一種快速檢測病原的分子生物學方法得到了廣泛的應用。目前，該技術主要運用于釀膿鏈球菌的spy1528、speB以及DNase B基因[33-35]。也有文獻報道以莢膜多糖Cps2J基因為靶點進行序列擴增[36]。楊學明等[37]針對已公布的13株釀膿鏈球菌設計了7對引物，其中spyM引物具有高度特異性，檢測限可達10 cfu/g樣品。杜海燕等[38]針對鏈球菌延伸因子EF-Tu基因設計合成了一對通用引物用于鏈球菌的檢測，其PCR擴增產物與釀膿鏈球菌有高度同源性。Ramalingam[39]在化膿性鏈球菌的種特異性標記開發(fā)過程中，發(fā)現(xiàn)了一條419 bp的單形條帶MB，通過對試驗菌株進行鑒定，證實了MB的存在，且MB與釀膿鏈球菌具有高度特異性，相似性達到98%，在同一屬的其他物種中不存在。此外，有研究[40]報道鏈球菌的tuf基因（編碼延伸因子Tu）可作為開發(fā)針對鏈球菌檢測的內部探針，tuf序列數(shù)據(jù)與基于16S rRNA基因數(shù)據(jù)確定的系統(tǒng)發(fā)育基本一致，有望為鏈球菌感染的快速準確診斷提供分子診斷工具。

基于常規(guī)PCR技術建立和發(fā)展的多重PCR是一種新型PCR技術，在一對反應體系中加入多對引物，同時擴增出多個核酸片段。與普通PCR相比，多重PCR不僅特異性強、靈敏度高，而且更加經濟便捷。Anna等[41]開發(fā)了一種方法，可以同時檢測四個低容量多重PCR反應中的20種釀膿鏈球菌毒力因子（spd3、sdc、sdaB、sdaD、speB、spyCEP、scpA、mac、sic、speL、K、M、C、I、a、H、G、J、smeZ和ssa），且反應體系只有5 μl，試劑成本明顯較低。

2.3.2 實時熒光定量PCR

熒光定量PCR技術基本原理是在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號監(jiān)測PCR過程，擺脫了凝膠電泳和紫外成像等步驟，因此該技術不僅具有PCR技術的高特異度和高靈敏度，還具有光譜技術的高精確定量等優(yōu)點[42]。王遠洋等[43]采用TaqMan探針法，針對釀膿鏈球菌Dnase B基因設計引物探針，對肉類中釀膿鏈球菌的最低檢出限為23 pg/μl。

2.3.3 恒溫核酸擴增技術

傳統(tǒng)的PCR技術由于熱循環(huán)的需要，必須依賴電源和PCR儀，從而限制了這一技術脫離實驗室應用，為了克服這一缺點，恒溫擴增技術逐漸發(fā)展起來。蔡妙森等[44]基于重組酶聚合酶等溫擴增技術（recombinase polymerase amplification，RPA）原理，選擇釀膿鏈球菌致熱外毒素B基因（speB基因）和無乳鏈球菌表面免疫蛋白基因（SIP基因）分別設計RPA引物和探針，該兩重RPA檢測體系結果準確、檢測時間短、操作簡單，具有較強的應用價值。

環(huán)介導等溫擴增技術（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是近年來新興的一種快速檢測技術，具有靈敏度高、特異性強、耗時短和操作簡便等優(yōu)點。周勇等[45]將實時熒光技術與LAMP結合，建立了針對spy1258基因設計的熒光 LAMP反應體系，與傳統(tǒng)國標法檢測結果一致，但大幅縮減了檢測時間。并且該體系最低檢測濃度為 100 pg/μl，菌檢測限低至9.8 cfu/ml，相比尹歡等[46]針對scpA基因設計的檢出限為16.7 cfu/ml的LAMP體系，具有更高的靈敏度。

2.3.4 基因芯片技術與生物傳感器

基因芯片又稱為DNA微陣列，近年來作為一種高通量快速檢測新技術逐漸興起，其基本原理是以核酸序列雜交進行序列測定。由于基因芯片技術將大量探針固定在支持物上，所以可以同時檢測和分析大量樣品序列，彌補了傳統(tǒng)核酸技術操作復雜、檢測效率低的缺陷。生物傳感器是一類以生物活性單元（如酶、抗體、核酸、細胞等）作為生物敏感單元，對目標測物具有高度選擇性的特殊傳感器，具有高度自動化、微型化與集成化的特點。Swati等[47]通過將單鏈DNA探針固定在金納米枝修飾的復合電極上，開發(fā)了阻抗式mga基因特異性DNA傳感器，用于快速檢測風濕性心臟病患者咽拭子樣本中的釀膿鏈球菌。經驗證，該傳感器對釀膿鏈球菌具有高度特異性，僅在30 min內就能檢測到6 μl樣本中低至0.01 ng的單鏈DNA。Natalia等[48]研究了一種新型阻抗式傳感器，通過碳二亞胺化學將商用抗體修飾到金盤電極表面，檢測限為9.3 cfu/ml，檢測時間約為3 min。

2.4 全基因組測序（whole-genome sequencing，WGS）

在過去數(shù)十年，WGS方法的快速進步正在改變臨床實驗室將基因組學應用于生物學監(jiān)測的方式，從而協(xié)助對傳染病病原體的臨床和公共衛(wèi)生事件的處理。WGS能更好地研究菌株間的親緣關系，用于傳統(tǒng)流行病學具有局限性的不尋常的傳播環(huán)境下公共衛(wèi)生事件分析。通常認為釀膿鏈球菌引起的侵襲性疾病是由于接觸了侵入性釀膿鏈球菌感染的人群或者感染但無癥狀的醫(yī)護人員，而有研究[49]通過WGS確認2例通過相互無癥狀接觸獲得的侵入性釀膿鏈球菌患者的非典型點源傳播情況，不僅能通過患者分離出的菌株間單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）來判斷傳播途徑，而且可以通過比較毒力因子基因或者進一步測定轉錄組來判斷菌株致病性。Tagini等[50]對侵襲性釀膿鏈球菌感染患者分離的11株釀膿鏈球菌進行全基因組測序，在較短時間內區(qū)分密切相關的菌株，以及查明毒力因子，包括其調節(jié)機制以及抗生素耐藥性，為臨床治療提供參考。

2.5 基于蛋白質的檢測方法（基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜）

基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（matrixassisted laser desorption ionizer time-of- flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）是一種于20世紀80年代末問世的新技術，其基本原理是依據(jù)菌體蛋白質的質譜圖，與現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫比對，從而獲得鑒定結果。MALDI-TOF-MS具有操作簡便、鑒定迅速的優(yōu)點，被廣泛應用于臨床微生物鑒定[51]。Hercules等[52]使用釀膿鏈球菌ATCC 700294作為實驗菌株，改變鑒定過程中使用的前處理方法、基質以及菌液濃度和培養(yǎng)基類型，得到的MALDI-TOF-MS圖譜在一組重復樣本內和一段時間內都是可重復的，表明該方法具有靈敏、特異和可靠的分析釀膿鏈球菌的潛力。Wang等[53]評估了MALDI Biotyper 2.0用于釀膿鏈球菌的快速檢測和聚類分析，對照生化鑒定的結果，MALDI-TOF-MS的準確率為93.85%，聚類分析中，其匹配率為67.69%。這說明，MALDI-TOFMS具有替代傳統(tǒng)分離鑒定方法的潛力，但在分類方面還需要數(shù)據(jù)庫的擴大以及MALDI-TOF-MS技術的進展來提高準確性。

3 釀膿鏈球菌感染的預防和治療

釀膿鏈球菌在自然界中分布較廣，人群攜帶率高，主要通過呼吸道飛沫傳播。由于還未有有效的鏈球菌疫苗開發(fā)上市，目前對于釀膿鏈球菌的預防和治療主要靠給予抗生素藥物，對青霉素普遍敏感，對于青霉素過敏的患者，可使用紅霉素或新的大環(huán)內酯類抗生素。

近年來，釀膿鏈球菌通過環(huán)境表面進行傳播的方式引起了廣泛關注，有研究[54]表明在干燥的環(huán)境下釀膿鏈球菌存活率有所提高，環(huán)境表面可能成為其傳播載體，并在感染和再感染中發(fā)揮作用。手部是生活中接觸物品較多的部位，做好手部衛(wèi)生有利于阻斷病菌傳播途徑，有研究[55]表明經聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽（PHMB）處理的非無菌醫(yī)用手套對接觸表面的釀膿性鏈球菌有較好的抑制效果，可應用于醫(yī)院等特殊場所。對于日常手部清潔，洗手液是較好選擇，目前市面上宣稱對釀膿鏈球菌有抑制作用的洗手液較少，開發(fā)對釀膿鏈球菌有良好殺菌效果的綠色環(huán)保型抗抑菌洗手液具有較好的實用價值和廣闊的市場前景。此外，洗手液在生產和使用過程中，也可能受釀膿鏈球菌污染而成為傳播載體，因此建立適用于日化行業(yè)的釀膿鏈球菌快速檢測技術對于洗手液的質量控制具有重要意義。

4 結語

釀膿鏈球菌廣泛存在于自然界中，能分泌多種毒力因子，致病機制較為復雜，是人類健康的一大威脅。近年來，釀膿鏈球菌的檢測技術已從傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法發(fā)展到免疫學方法檢測及核酸分子方法檢測，毫無疑問，高通量、高特異性的檢測方法是未來的發(fā)展趨勢。高效的檢測方法不僅有利于菌株感染的快速鑒定和及時提供治療方案，還有利于相關食品、日化產品的快速、安全流通。本文通過研究釀膿鏈球菌生物學特性及檢測方法，為尋找新的釀膿鏈球菌檢測靶點、開發(fā)用于預防釀膿鏈球菌感染的日化產品提供理論基礎和思路。