盧慧，謝正元

0 引言

據(jù)2020年全球癌癥報告顯示，肝癌是中國第五大常見惡性腫瘤，我國新發(fā)病例數(shù)與死亡病例數(shù)約占全球50%，其中肝細胞癌（HCC）占我國原發(fā)性肝癌的90%[1]。由于肝癌早期診斷不足，絕大多數(shù)患者確診時已到中晚期，超過60%的患者在晚期發(fā)生轉(zhuǎn)移后被確診，導致總體5年生存率<16%[2]。相比之下，肝癌早期的患者生存期有較大改善，早期治療可以顯著逆轉(zhuǎn)疾病的進展并延長生存時間，使5年生存率>70%[3]。據(jù)統(tǒng)計，2020年亞洲地區(qū)中國的肝癌死亡率（17.2/10萬）最高，日本的肝癌死亡率（4.8/10萬）顯著低于全球平均水平[4]，可能得益于日本對肝癌早診早治的重視。日本早在2002年開始由政府資助對40歲以上人群進行HBV和HCV感染篩查，并對HCV和HBV感染者進行定期肝癌篩查，故而肝癌早期診斷率在60%以上[5]。為達成“健康中國2030”規(guī)劃綱要中總體癌癥5年生存率提高15%的目標，我國肝癌早篩早診工作任重道遠。

目前，肝臟超聲（US）和血清甲胎蛋白（AFP）檢測在肝癌的早期篩查中達到普遍應用，但效果并不滿意。肝臟超聲敏感度為51%～87%，特異性為80%～100%，易受觀察者主觀影響，且對病灶大小要求高[6]。AFP作為肝癌的特異性腫瘤標志物，在妊娠狀態(tài)、生殖細胞腫瘤和良性肝病的患者中亦可升高，缺乏足夠的敏感度[7]。隨著液體活檢技術和成像技術的發(fā)展，研究者不斷鉆研以尋求肝癌早期無創(chuàng)診斷的突破點，現(xiàn)就肝癌無創(chuàng)早期診斷的研究進展作一綜述。

1 肝癌的血清標志物

1.1 AFP異質(zhì)體

AFP是臨床上應用最廣泛的肝癌標志物，AFP存在3種糖鏈異質(zhì)體，其中AFP異質(zhì)體（alpha fetoprotein heterogeneity,AFP-L3）主要來源于肝癌細胞，并且AFP-L3與AFP的比值（AFP-L3%）是肝癌早期診斷的高特異性標志物。相關專家共識[8]提出針對低AFP水平人群，AFP-L3可以對肝癌進行預測及早期診斷，并把AFP-L3%≥10%界定為肝癌診斷的陽性截斷值。Zhou等[9]薈萃分析顯示AFP-L3%對診斷早期HCC具有高特異性（92%），但敏感度低（34%），應更加重視AFP-L3%診斷早期HCC的高特異性優(yōu)勢，這是未來AFP-L3%臨床應用發(fā)展的主要方向。該研究基于檢測AFP-L3%的不同方法進行了亞組分析，結(jié)果表明微總量分析系統(tǒng)（μTAS）是提高檢測靈敏度的最佳方法，可能為HCC的診斷提供更有利的結(jié)果。周何琪等[10]研究表明單一標志物難以獲得最優(yōu)的診斷效能，對AFP陰性的肝癌人群聯(lián)合檢測AFP-L3%與血清異常凝血酶原（PIVKA-Ⅱ）具有較理想的敏感度，有效減少肝癌的漏診率，為肝癌的診斷提供了新策略。

1.2 脫-γ-羧基凝血酶原

脫-γ-羧基凝血酶原（des-gamma carboxy prothrombin,DCP），又稱為維生素K缺乏誘導的凝血酶原-Ⅱ（PIVKA-Ⅱ），是一種在肝癌中產(chǎn)生的異常蛋白質(zhì)。肝細胞中的凝血酶原由氨基酸殘基構成，凝血酶原前體經(jīng)過維生素K依賴性γ-谷氨酰羧化酶羧化氨基酸殘基合成凝血酶原。肝癌細胞缺乏羧化酶，不能羧化所有的氨基酸殘基，產(chǎn)生DCP，在肝癌患者中DCP大多異常地升高[11]。有研究[12-13]支持DCP和AFP聯(lián)合在HCC中具有更好的診斷效果，高水平的DCP在預測腫瘤大小、門靜脈栓塞和血管侵犯方面比AFP更有利?；谛詣e、年齡、AFP-L3、AFP、DCP，研究者構建了GALAD評分，多個國家研究發(fā)現(xiàn)GALAD評分在慢性乙型和丙型肝炎以及肝硬化患者中具有識別早期肝癌的優(yōu)異性能，并被指南推薦認可[14-16]。

1.3 磷脂酰肌醇聚糖-3

磷脂酰肌醇聚糖-3（glypican-3,GPC-3）是一種細胞表面硫酸肝素蛋白多糖。相關研究在HCC細胞和組織中發(fā)現(xiàn)高度表達的GPC-3，通過調(diào)控Wnt信號轉(zhuǎn)導通路來控制HCC細胞增殖，從而影響腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移[17]。一項薈萃分析[18]評估了GPC-3在HCC和肝硬化病例之間鑒別診斷的準確性，結(jié)果顯示血清GPC-3在HCC和肝硬化中的診斷效能雖然不如AFP，但GPC-3和AFP二者聯(lián)合有著比單一GPC-3或AFP更好的診斷效能，建議GPC-3與其他標志物聯(lián)合檢測?；贕PC-3在HCC細胞的膜表達，GPC-3可被用作治療干預的靶標。迄今為止，開發(fā)了各種針對GPC-3的免疫治療方案，包括使用人源化抗GPC3細胞毒抗體、免疫毒素療法和基因療法，因此GPC-3具有廣闊的臨床應用前景[19]。

1.4 α-L-巖藻糖苷酶

α-L-巖藻糖苷酶（α-L-fucosidase,AFU）是一種溶酶體酶，自Deugnier等首次報告AFU在肝癌患者血清中升高，AFU作為早期診斷肝癌的指標被人們逐漸認識[20]。Liu等[21]首次對乙肝表面抗原和丙肝抗體陰性的肝癌患者（NBNC-HCC）的血清生物標志物進行大規(guī)?；仡櫺苑治觯u估了5種血清生物標志物（AFP、AFU、GPC-3、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶同工酶Ⅱ和肝細胞生長因子）在HCC診斷中的潛力，結(jié)果顯示AFP/AFU組合具有較好的診斷效能，可用于從健康對照中識別NBNC-HCC，并且從高?；颊咧屑霸缱R別肝炎相關HCC。

1.5 微小核糖核酸

微小核糖核酸（miRNA）是一類單鏈非編碼小RNA，可調(diào)控特定的靶基因表達水平，參與機體新陳代謝、凋亡、腫瘤發(fā)生等過程。一項橫斷面研究[22]證實miRNA 21-5p和miRNA 155-5p在肝癌中表現(xiàn)為上調(diào)，是肝癌的致癌因子，miRNA 29c-3p則表現(xiàn)為下調(diào)，具有抑癌作用，表明miRNAs參與腫瘤發(fā)生發(fā)展并發(fā)揮抑癌基因或癌基因的作用。Wang等[23]發(fā)現(xiàn)HCC中miR-122、miR-148a和miR-1246的血清外泌體水平顯著高于肝硬化和正常者，與慢性肝炎患者差異不大，因此仍需要進一步研究區(qū)分肝癌和慢性肝炎的標志物。近年大多數(shù)研究不再集中在單個miRNAs上，一些新興組合模型成為研究的熱點，包括用于HCC診斷的多種miRNAs組合或者與其他傳統(tǒng)腫瘤標志物結(jié)合的診斷模型。呂金明等[24]分析比較了腫瘤標志物AFP、癌胚抗原（CEA）及血清miR-122水平在乙肝、肝硬化、早期肝癌患者中的變化。與AFP、CEA單獨檢測相比，血清miR-122聯(lián)合AFP、CEA檢測對早期肝癌的診斷效能明顯提高，說明miR-122可作為早期肝癌的診斷指標。Zhou等建立了由7種miRNA（miR-122、miR-192、miR-21、miR-223、miR-26a、miR-27a和miR-801）組成的血清標志物組合，在早期肝癌檢測上敏感度較AFP提高30%，并且利用這7種miRNA開發(fā)了國際首個miRNA肝癌檢測試劑盒，目前在臨床上已開展應用并被肝癌診療指南所認可推薦[25-26]。

1.6 循環(huán)腫瘤DNA

循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）是一種源于腫瘤細胞（原發(fā)腫瘤及轉(zhuǎn)移腫瘤）釋放到循環(huán)中的循環(huán)無細胞DNA（cfDNA）。早在腫瘤能被影像學檢測到或引起臨床癥狀之前，腫瘤細胞就會將帶有遺傳物質(zhì)的ctDNA釋放循環(huán)中去，因此ctDNA有望成為癌癥檢測的生物標志物[27]。血漿中ctDNA的變化包括量變及質(zhì)化，前者是指總ctDNA濃度，后者是指DNA畸變，如單核苷酸變異、拷貝數(shù)異常和甲基化變化[28]。腫瘤患者cfDNA水平和ctDNA拷貝數(shù)的增加是由循環(huán)中凋亡和壞死腫瘤細胞數(shù)量的增加所致。Yan等[29]研究發(fā)現(xiàn)血漿cfDNA水平不僅在HCC患者中升高，在伴有嚴重炎性反應的肝纖維化患者中也升高，但HCC患者血漿cfDNA水平與肝纖維化患者相比明顯升高。多項研究[30-31]表明肝癌患者血清或血漿中的cfDNA濃度比慢性肝炎患者高3～4倍，是健康對照組的近20倍。甲基化在腫瘤進展中扮演著重要角色，是常見的表觀遺傳變化。一項薈萃分析[32]系統(tǒng)評估了肝癌中DNA甲基化的作用，在針對HCC患者血清和健康者血清的病例對照研究中，發(fā)現(xiàn)六個HCC相關基因（RASSF1A、p16、CDH1、RUNX3、GSTP1和WIF1）高甲基化與患HCC風險顯著相關，推測異常甲基化DNA可能成為預測肝癌發(fā)生的標志物。Xu等[33]通過分析比較HCC組織和正常血液中的ctDNA，并構建了一個HCC特異性甲基化標志物組診斷預測模型，該模型顯示出優(yōu)于AFP的診斷性能，并顯示ctDNA甲基化標志物與腫瘤負擔、治療反應和分期高度相關。ctDNA特異性基因改變在一定程度上也反映了腫瘤的生物學特性，在血漿DNA中檢測到的熱點突變幾乎總是與相應腫瘤中檢測到的相同突變相關。一項研究[34]通過應用高通量測序平臺從ctDNA中檢測HCC中的腫瘤相關突變，使用二代測序技術（NGS）研究TERT啟動子、CTNNB1和TP53中的熱點突變，在主要乙型肝炎病毒陽性隊列中的8/41（約20%）血漿樣本中檢測到腫瘤相關突變，表明ctDNA中的遺傳信息反映了原發(fā)腫瘤的狀況，為ctDNA在肝癌診斷預測中的作用提供了相關證據(jù)支持。但循環(huán)ctDNA在血液中表達水平低，且僅占總cfDNA的一小部分（<0.01%），使得在HCC篩查中建立ctDNA相關的早期診斷檢測仍具有挑戰(zhàn)性，克服早期肝癌中cfDNA中ctDNA含量低所帶來的挑戰(zhàn)至關重要[35]。

1.7 骨橋蛋白

骨橋蛋白（osteopontin,OPN）是一種新型的血清生物標志物，是近些年來研究的熱點。OPN是一種糖蛋白，由成骨細胞T細胞、巨噬細胞分泌，在多種腫瘤中高表達，參與了腫瘤細胞增殖、存活、血管生成、侵襲和轉(zhuǎn)移[36]。一項納入80例丙型肝炎病毒（HCV）相關HCC患者的研究[37]發(fā)現(xiàn)HCC組血清OPN水平顯著高于正常組，是一種潛在的腫瘤標志物，有望在慢性HCV感染導致的肝硬化患者中監(jiān)測OPN表達水平，以便在早期階段監(jiān)測HCC的發(fā)生，從而改善這些患者的預后和生存率。一項薈萃分析[38]證實OPN在診斷HCC方面的敏感度高于AFP，AFP聯(lián)合OPN可經(jīng)進一步提高早期HCC診斷的敏感度。張洪川等[39]研究證實肝癌組織中的骨橋蛋白陽性表達率顯著高于正常組織與不典型增生組織，可見骨橋蛋白可預測肝癌的發(fā)生。

1.8 醛酮還原酶家族1成員B10

醛酮還原酶家族1成員B10（aldo-keto reductase family 1 member B10,AKR1B10）通過催化脂肪族和芳香族醛的還原，調(diào)節(jié)細胞增殖和分化中的重要信號分子，在HCC發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮調(diào)控作用，但早期HCC患者中AKR1B10的表達模式尚不清楚[40]。最近一項多中心研究[41]驗證了AKR1B10作為檢測HCC的標志物，與健康對照組相比，HCC患者血清樣本中的AKR1B10水平高出18倍以上（（1567.3±292.6）pg/mlvs.（85.7±10.9）pg/ml），并確定了267.9 pg/ml為血清AKR1B10的最佳診斷截止值。血清AKR1B10的曲線下面積（AUC）0.896、敏感度72.7%和特異性95.7%比AFP（AUC 0.816、敏感度65.1%和特異性88.9%）具有更好的診斷參數(shù)，在檢測AFP陰性HCC方面具有優(yōu)勢。將AKR1B10和AFP二者聯(lián)合起來用于診斷HCC，結(jié)果顯示HCC診斷的敏感度和陰性預測值較單獨使用AFP顯著提高。AKR1B10表達也與病毒性肝炎發(fā)展為HCC風險相關，在一項針對獲得持續(xù)病毒學應答（SVR）的慢性丙型肝炎（CHC）患者的研究中，AKR1B10高表達是HCC發(fā)展的獨立危險因素，HCC發(fā)展的5年累積發(fā)生率在AKR1B10高表達組與AKR1B10低表達組分別為13.7%和0.5%。因此，AKR1B10不僅是一種癌癥生物標志物，而且還是一種新的預測標志物，用于評估實現(xiàn)SVR的CHC患者發(fā)生HCC的風險[42]。

2 肝癌的影像學診斷

與其他大多數(shù)惡性腫瘤不同，HCC可以通過無創(chuàng)性檢查診斷，并且可以僅根據(jù)影像學開始治療，無需通過活檢證實[43]。在當前大多數(shù)臨床實踐指南中，增強計算機斷層掃描（CT）和磁共振成像（MRI）已取代活檢作為診斷具有特征性成像特征HCC的首選方法[44]。除了使用細胞外造影劑的動態(tài)CT和MRI外，現(xiàn)在更新的指南還包括使用肝膽造影劑的磁共振成像作為一線診斷篩查，超聲造影（CEUS）作為二線診斷篩查[45]。

2.1 肝膽造影劑MRI

肝膽造影劑由兩種基于釓的造影劑（GBCA）組成，分別為釓塞酸二鈉（Gd-EOB-DTPA）和釓基二甘胺，包含傳統(tǒng)GBCA和肝膽造影劑的雙重性質(zhì)[45]。Gd-EOB-DTPA具有親脂性EBO基團，可被肝臟細胞特異性吸收，具有50%的吸收率，注射后10～40分鐘呈現(xiàn)肝膽特異性成像。正常肝細胞呈現(xiàn)明顯強化，而癌前病變或惡性肝細胞腫瘤的功能減弱或缺失，因此在該期中呈低增強，出現(xiàn)早于肝癌發(fā)生的血流動力學變化，有助于肝臟局灶性病變的發(fā)現(xiàn)同時判斷病灶良惡性，特別是在直徑<1.0 cm的微小病灶診斷中顯示出優(yōu)勢[46]。Gd-EOB-DTPA可提高直徑≤1.0 cm肝癌的檢出率，對高度異型增生結(jié)節(jié)等癌前病變也有鑒別力[47]。2022年原發(fā)性肝癌診療指南[26]推薦了釓塞酸二鈉增強磁共振（EOB-MRI）作為肝癌診斷的影像學檢查方法。

2.2 超聲造影

與常規(guī)超聲檢查相比，超聲造影（CEUS）可實現(xiàn)對組織的微血管灌注情況動態(tài)、實時連續(xù)的觀察，能夠更好地發(fā)現(xiàn)病變并且對病變良惡性質(zhì)的判定有一定價值，具有無創(chuàng)、無輻射、易重復、安全性高的特點。一項前瞻性多中心研究[48]發(fā)現(xiàn)，對于10～20 mm HCC的診斷，CEUS顯示出比CT（76.8%）和MRI（83.2%）更高的特異性，為92.9%。基于肝臟影像報告和數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)（LIRADS），相關學者建立了CEUSLI-RADS，有助于肝臟腫瘤的分級診斷，特別是能對肝硬化背景下的肝內(nèi)結(jié)節(jié)動態(tài)監(jiān)測其發(fā)生發(fā)展趨勢[49]。一項回顧性研究顯示CEUS LI-RADS對肝內(nèi)結(jié)節(jié)具有出色的診斷性能，可以準確區(qū)分惡性腫瘤和良性結(jié)節(jié)，其中LR-5級對HCC診斷的敏感度、特異度分別為86%、96%，以此實現(xiàn)無需進行病理確認即可對HCC進行可靠的影像診斷[50]。

3 腸道微生物與肝癌

腸道微生物群通過腸-肝軸使腸道和肝臟建立緊密聯(lián)系，腸道微生物可通過腸道菌群失調(diào)、腸道滲漏、細菌代謝產(chǎn)物促進慢性肝病逐漸向肝纖維化、肝硬化、肝癌進展[51]。腸道微生物群失調(diào)會導致腸道通透性增加，腸道屏障被破壞，出現(xiàn)腸道滲漏，最終導致微生物易位和增加肝臟對微生物群衍生產(chǎn)物和代謝物的暴露。腸道微生物釋放的毒素，如脂多糖（LPS）可被Toll樣受體4（TLR4）特異性識別并釋放炎性介質(zhì)（IL-1、IL-6 和腫瘤壞死因子），通過免疫調(diào)控從而促進肝癌發(fā)生[52]。目前，通過二代測序技術（如16S rDNA基因測序、鳥槍法宏基因組學）或代謝組學分析技術，對健康人群和HCC患者的糞便樣本進行分析，發(fā)現(xiàn)某些腸道微生物及其相關代謝產(chǎn)物可能具有診斷HCC的潛力[53]。Ponziani等[54]探索發(fā)現(xiàn)合并HCC的非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）相關肝硬化患者腸道菌群中缺乏保護性細菌，腸道炎性反應加重，作為腸道炎性反應標志物的糞便蓋衛(wèi)蛋白升高證實了這一點，認為腸道微生物群譜和全身炎性反應顯著相關，可形成促使肝癌發(fā)生的局部微環(huán)境。NAFLD是全球肝癌的第三大病因，針對這類肝癌高危人群，是否能通過腸道微生物早期識別肝癌的發(fā)生并阻止或延緩疾病的進展仍需要進一步探索。Ren等[55]研究發(fā)現(xiàn)，早期HCC糞便微生物多樣性增加，產(chǎn)生LPS的細菌豐度增加,表明HCC患者中各種有害細菌或古生菌過度生長。同時該研究首次對HCC患者的腸道微生物組進行了表征分析，從中篩選出30種最佳微生物標志物，構建了HCC診斷模型，并驗證了腸道微生物作為早期HCC非侵入性標志物的潛力。腸道菌群譜受各種因素影響，不同地區(qū)、不同病因、不同營養(yǎng)攝入水平使得腸道微生物譜變化各有差異，這些差異限制了腸道微生物模型的廣泛應用，仍需針對不同人群進行驗證性實驗。

4 總結(jié)與展望

一直以來，肝癌的早期診斷是肝癌診療中的一大挑戰(zhàn)，早期預測肝癌的發(fā)生給疾病的預后和結(jié)局帶來明顯的改善。目前肝癌早期無創(chuàng)診斷在生物標志物、成像技術、微生物組等方面的研究取得的成效顯著，但未發(fā)現(xiàn)獨立的肝癌篩查工具，建議使用多種生物標志物組合與成像技術、微生物組相結(jié)合，建立一個標準化、規(guī)范化的早癌篩查體系。同時現(xiàn)有的研究多是單中心小樣本研究，受地區(qū)、人群、腫瘤異質(zhì)性等各種因素所限制，研究成果尚未能在臨床推廣，未來仍需開展多中心大規(guī)模的前瞻性研究來獲得更有力的證據(jù)。如今隨著健康體檢的推行，肝癌普查的模式也有所改變，傳統(tǒng)普遍采用AFP結(jié)合B型超聲的篩查方式效率低下，目前指南提出根據(jù)對人群患肝癌風險進行評估，精準化分層制定肝癌篩查與監(jiān)測方案[56]，對提高肝癌早期診斷率意義重大。