趙學(xué)志，丁云花，張俊倩，唐小燕，宋曙輝

（1. 北京市農(nóng)林科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工與食品營養(yǎng)研究所，北京 100097；2. 果蔬農(nóng)產(chǎn)品保鮮與加工北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100097；3. 北京市農(nóng)林科學(xué)院 蔬菜研究所，北京 100097）

馬齒莧為一年生草本植物，世界各地均有分布。其抗病性強(qiáng)，對土壤和環(huán)境要求不高，易于生長，產(chǎn)量高。馬齒莧為藥食兩用植物資源。在歐洲地中海沿岸，作為日常食用蔬菜，同時具有利尿、退熱、殺菌、抗痙攣、殺蟲作用及抗膽堿酯酶活性[1-2]。我國將馬齒莧作為傳統(tǒng)中藥也有很長的歷史。在“本草綱目”中記載馬齒莧具有抗炎消腫等功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，馬齒莧還具有降血糖、調(diào)節(jié)血脂、抗炎、抗氧化等功能[3-6]。馬齒莧營養(yǎng)豐富，富含ω-3 脂肪酸，特別是α -亞麻酸含量，是植物資源中含量較高之一[7]，其ω-6/ω-3 小于2，有利于人體對脂肪酸的平衡和利用，起到預(yù)防心血管疾病發(fā)生的作用[8]。另外，含有抗壞血酸、類胡蘿卜素、鐵等礦質(zhì)元素，且含有黃酮、酚酸、多糖、生物堿、馬齒莧酰胺等功能性成分[9-11]。近幾年，栽培型馬齒莧作為一種新型蔬菜逐漸走進(jìn)餐桌。栽培型馬齒莧株型大、直立、產(chǎn)量高[12]，同樣富含多種營養(yǎng)功能性成分[13]。以往的研究多以野生型馬齒莧為主[14]。針對栽培型馬齒莧的功能成分及抗氧化功能進(jìn)行試驗(yàn)，為栽培型馬齒莧的開發(fā)積累理論和試驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

栽培型馬齒莧，蔬菜中心實(shí)驗(yàn)農(nóng)場種植。分別在苗期G1、G2、營養(yǎng)生長期G3、現(xiàn)蕾期G4 和成熟期G5、G6 取樣。

1.2 試劑

辣根過氧化物酶（HRP）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-pierylhydrazy；DPPH）、肌紅蛋白（Myoglobin）、ABTS （2,2'-Azinobis（3-ethyl benzothiazoline 6-sulphonate）、黃嘌呤（Xanthine）、黃嘌呤氧化酶（XOD），Sigma 公司提供；萘乙二胺（NED）、對氨基苯磺酸、過氧化氫、L -酪氨酸、氫氧化鈉、雙氧水、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、無水乙醇，均為國產(chǎn)分析純。

1.3 儀器

KQ-600DE 型超聲波振蕩儀，昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；20A 型高效液相色譜儀，日本島津產(chǎn)品；HITACHI U-3410 型紫外分光光度計(jì)；LD5-2B 型離心機(jī)，北京京立離心機(jī)有限公司。

1.4 樣品制備

取新鮮馬齒莧，去掉老葉、黃葉，清洗后切分，真空冷凍干燥后粉碎并過60 目篩。按相應(yīng)的方法稱取冷凍干燥馬齒莧粉進(jìn)行分析?？寡趸囼?yàn)，稱取馬齒莧冷凍干燥粉5.0 g，按1∶20 加入70%乙醇作為提取劑，超聲波提取30 min，以轉(zhuǎn)速3 500 r/min離心20 min 后取上清液，樣品質(zhì)量濃度以每毫升溶液中干物質(zhì)含量表示。

1.5 試驗(yàn)方法

1.5.1 功能成分檢測

葉綠素測定參照NY/T 3082—2017；類胡蘿卜素測定參照文獻(xiàn)[15]；總黃酮測定采用硝酸鋁比色；總酚測定采用Folin 酚比色法[16]；多糖測定參照功能食品中多糖的檢測方法[17]。

1.5.2 抗氧化活性[18]

（1） DPPH·試驗(yàn)。稱取DPPH，用無水乙醇配成濃度為2×10-4mol/L 的溶液，冷藏于冰箱中。

DPPH·試驗(yàn)加樣表見表1。

表1 DPPH·試驗(yàn)加樣表

用力搖勻，將Ai所表示的樣品在室溫下靜置30 min 后，加入1 cm 比色皿中進(jìn)行吸光度的測定，測出A0、Ai、Aj的吸光度，按下列公式進(jìn)行清除率的計(jì)算。

（2） ABTS-肌紅蛋白- H2O2系統(tǒng)。將磷酸鹽緩沖液、馬齒莧提取液、ABTS、 肌紅蛋白按順序加入1 mL 比色皿中，每個濃度做5 個平行樣，再帶1 份試劑空白，然后于分光光度計(jì)前，在5 個平行樣中分別加入過氧化氫，空白中不加過氧化氫，迅速混勻后，放入樣品池中，置于30 ℃恒溫條件下，于波長734 nm 處測定吸光度。

（3） Xan-XOD 試驗(yàn)系統(tǒng)。在總體積1 mL 的溶液中含有：100 mmol/L 磷酸緩沖液pH 值7.4，1 mmol/L鹽酸羥胺（HONH2.HCl），500 mol/L 黃嘌呤，0.04 U/mL黃嘌呤氧化酶。將磷酸緩沖液、羥基氯化銨、黃嘌呤，不同濃度的馬齒莧提取液以及XOD 依次加到1 mL 具塞塑料離心管內(nèi)，蓋緊蓋后，放到37 ℃水浴振蕩，培養(yǎng)30 min。水浴期間，準(zhǔn)備好相應(yīng)的微量比色皿，并分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的對氨基苯磺酸溶液0.3 mL，水浴結(jié)束后，迅速加入反應(yīng)液0.3 mL和0.02%的NED 0.3 mL。在紫外-可見分光光度計(jì)上，于波長540 nm 處分別測定吸收度。

（4） 酪氨酸-二酪氨酸（Tyr/di-Tyr） 系統(tǒng)。在玻璃試管內(nèi)依次加入磷酸鹽緩沖液、酪氨酸，不同濃度馬齒莧提取液，過氧化氫和HRP，37 ℃水浴振蕩60 min 后，取出，立即用1mol/L HCl 溶液終止反應(yīng)，于HPLC 測定酪氨酸和二酪氨酸含量。

反應(yīng)原理見圖1。

圖1 反應(yīng)原理

HPLC 條件：1 色譜柱：Diamond 250 mm×4.6 mm；2 流動相：A 液：50 mmol/L 磷酸鹽緩沖液pH 值2.4；B 液：甲醇100%；梯度洗脫程序：B 液濃度由1 min 時的0 線性漸變到6 min 的30%，再漸變到10 min 的0，保持8 min；檢測波長285 nm；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量20 μL。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

每組試驗(yàn)進(jìn)行3 次重復(fù)，結(jié)果以X±SD 表示。采用SPSS 19.0 進(jìn)行相關(guān)性分析、方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬齒莧不同采收期功能成分的變化

不同生長期馬齒莧功能成分含量見表2，馬齒莧不同生長期功能成分的變化見圖2。

表2 不同生長期馬齒莧功能成分含量 / mg·g-1 DW

圖2 馬齒莧不同生長期功能成分的變化

植物中的功能成分主要為次生代謝產(chǎn)物，其合成的多少受基因型及外界環(huán)境影響較大。幼嫩組織生長旺盛，多酚合成代謝大于分解代謝，且旺盛生長的器官中生長素的含量較高，貯存器官中酚類化合物調(diào)運(yùn)迅速[19]。多數(shù)研究表明植物幼嫩組織中多數(shù)酚類物質(zhì)的含量顯著高于成熟組織[20-21]。由圖2 可知，馬齒莧的多酚和黃酮含量都表現(xiàn)為苗期至營養(yǎng)生長期最高。

由表2 和圖2 可以看出，除多糖外，其他幾種功能成分均表現(xiàn)為苗期和營養(yǎng)生長期含量高，之后逐漸下降。不同功能成分在生長不同時期呈現(xiàn)出較大差異?？傸S酮含量最大相差5.2 倍，多酚相差3.3倍，類胡蘿卜素相差4.6 倍，葉綠素相差4.5 倍，多糖相差2.0 倍。

2.2 馬齒莧不同生長期抗氧化活性變化

馬齒莧不同生長期4 種抗氧化方法的IC50值見表3。

表3 馬齒莧不同生長期4 種抗氧化方法的IC50 值 / mg·mL-1

試驗(yàn)中所采用的4 種抗氧化方法，分別從不同的機(jī)理來表明抗氧化能力。DPPH 自由基清除評價方法是目前最常用的抗氧化方法，簡便且易于大量篩選抗氧化活性，可作為初步篩選的方法。ABTS 方法與DPPH 自由基清除方法相似，但靈敏度更高。另外2 種抗氧化方法，模擬了體內(nèi)自由基產(chǎn)生途徑和清除機(jī)理，酪氨酸方法模擬體內(nèi)大分子蛋白質(zhì)受損的過程，Xan-XOD 方法模擬缺血再灌注后產(chǎn)生的自由基，有一定的生物學(xué)意義。4 種抗氧化方法都顯示了馬齒莧在營養(yǎng)生長期抗氧化活性較高。苗期的抗氧化活性最高，尤以播種后22 d，此時苗齡20 d，4 片真葉，為馬齒莧苗生長旺盛期。結(jié)果顯示，馬齒莧在不同生長時期的抗氧化性能有很大差異。Xan-XOD 法相差10 倍，DPPH 相差5.5 倍，ABTS 法相差4.2 倍，酪氨酸/二酪氨酸法相差3.5 倍。

2.3 馬齒莧功能成分含量與抗氧化活性的相關(guān)性

馬齒莧功能成分含量與抗氧化能力的相關(guān)性（R） 分析見表4。

表4 馬齒莧功能成分含量與抗氧化能力的相關(guān)性（R） 分析

由表4 可以看出，馬齒莧中幾種功能成分都與抗氧化活性呈正相關(guān)，即與IC50值呈負(fù)相關(guān)，但未達(dá)到顯著性差異（p＞0.05）。植物中的多酚類化合物是公認(rèn)的具有很強(qiáng)抗氧化活性的次生代謝產(chǎn)物，可清除體內(nèi)過剩的自由基，防止DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等生物大分子氧化損失，從而預(yù)防癌癥、糖尿病等疾病的發(fā)生[22-23]。多羥基酚酸能夠清除幾乎所有類似自由基的氧化劑分子。試驗(yàn)中可以看出，多酚和黃酮對抗氧化活性貢獻(xiàn)較為明顯，其含量與抗氧化性呈正相關(guān)。葉綠素的貢獻(xiàn)最小。類胡蘿卜素居中。多酚含量與黃酮，多酚與類胡蘿卜素，類胡蘿卜素與葉綠素含量呈極顯著正相關(guān)（p＜0.01），黃酮與類胡蘿卜素、黃酮與葉綠素、多酚與葉綠素呈顯著正相關(guān)（p＜0.05）。4 種抗氧化方法之間，Xan-XOD 法和DPPH 和ABTS 呈 極 顯 著 正 相 關(guān)（p＜0.01），Xan-XOD 法和酪氨酸法呈顯著正相關(guān)（p＜0.05）。酪氨酸法和DPPH 和ABTS 呈極顯著正相關(guān)（p＜0.01），DPPH 和ABTS 法呈顯著正相關(guān)（p＜0.05）。

3 結(jié)論

針對栽培型馬齒莧的幾種功能成分進(jìn)行分析，并采用4 種抗氧化方法進(jìn)行抗氧化活性評價。結(jié)果表明，馬齒莧各功能成分及抗氧化活性在不同生長期呈現(xiàn)動態(tài)變化。

試驗(yàn)結(jié)果中，功能性成分與抗氧化活性呈現(xiàn)一定的正相關(guān)性。除多糖外的幾種功能成分都表現(xiàn)為苗期含量高，抗氧化試驗(yàn)結(jié)果也同時顯示出抗氧化活性在苗期最高。在相關(guān)性分析中可以看出，4 種抗氧化方法之間為顯著及極顯著正相關(guān)。

試驗(yàn)中多糖的含量與抗氧化性能為負(fù)相關(guān)（結(jié)果未列出），多糖提取的步驟之一為醇沉，試驗(yàn)采用的是70%乙醇為提取劑，此種情況下，多糖沉淀無法提取出來，因而結(jié)果不能真正表明多糖的抗氧化性能。這也從反面證實(shí)了抗氧化性能與功能成分之間的相關(guān)性。其他幾種功能成分在醇相條件下可以提出，因而可以反映與抗氧化性能的關(guān)系。

試驗(yàn)結(jié)果表明，馬齒莧營養(yǎng)生長期相較于苗期產(chǎn)量高，功能性成分相對較高，抗氧化性能好，在兼顧功能成分及商品性時，馬齒莧的最佳采摘期為營養(yǎng)生長期，這也是馬齒莧的最佳食用時期，適口性最好。待進(jìn)入現(xiàn)蕾生長期，盡管可以食用，但口感外觀等商品性能下降。栽培過程中可以采取適當(dāng)措施推遲現(xiàn)蕾開花，達(dá)到積累功能成分的目的。試驗(yàn)結(jié)果可以為栽培型馬齒莧的開發(fā)利用提供一定的參考。