王偉東，滕 蔓，鄭鹿平，劉金玲，張文凱，4，李林燕，4，張志會(huì)，樊劍鳴，羅 俊，4

（1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/河南省動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002；2.鄭州大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院，河南 鄭州 450001；3.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 中英禽病國(guó)際研究中心，河南 鄭州 450002；4.河南科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471003）

馬立克病病毒（Marek’s disease virus，MDV）是一類具有細(xì)胞結(jié)合性和嗜淋巴細(xì)胞特性的α皰疹病毒，感染宿主雞可誘發(fā)馬立克病（Marek’s disease，MD），該病以淋巴細(xì)胞增生和內(nèi)臟腫瘤形成為主要特征[1]。自1907 年該病首次報(bào)道[2]后，目前世界范圍內(nèi)均存在MD 的流行，每年給全球家禽養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3]。盡管早期使用疫苗免疫雛雞來(lái)防控MD 取得了較好的成效，但隨著MDV 毒力的增強(qiáng)，部分流行毒株的毒力突破了現(xiàn)有MD 疫苗的免疫保護(hù)，使得MD疫情仍時(shí)有暴發(fā)[4-8]。

MicroRNA（miRNA）是一類小的非編碼RNA 分子，長(zhǎng)度22～24 nt。自從LEE等[9]首次在秀麗隱桿線蟲中發(fā)現(xiàn)lin-4 后，越來(lái)越多的miRNA 在動(dòng)物、植物以及病毒中被發(fā)現(xiàn)[10]。這些小分子RNA 在細(xì)胞的發(fā)育與分化、疾病發(fā)生、腫瘤形成等生物學(xué)過(guò)程發(fā)揮重要的調(diào)控功能[11-12]。目前已鑒定出500 多個(gè)病毒miRNA，其中絕大多數(shù)編碼于各種人類或動(dòng)物皰疹病毒基因組中[13]。作為α 皰疹病毒家族的重要成員，血清1 型MDV（MDV-1）編碼14 個(gè)miRNA 前體基因，可表達(dá)加工生成26 個(gè)成熟體miRNA，在MDV基因組反轉(zhuǎn)重復(fù)序列區(qū)中共形成3 個(gè)基因簇，即Meq 基因簇、Mid 基因簇和LAT 基因簇[14-15]。雖然少數(shù)幾個(gè)病毒miRNA 已被證明參與調(diào)控MDV 的基因表達(dá)、腫瘤發(fā)生或潛伏感染[16-25]，但大部分MDV miRNA的潛在功能和分子調(diào)控機(jī)制仍不清楚。

基于成簇的規(guī)律性間隔短回文重復(fù)序列（Cluster regularly interspaced short palindromic repeat，CRISPR）和CRISPR 相關(guān)蛋白9（Cas9）系統(tǒng)的基因編輯技術(shù)，自2013年首次應(yīng)用于哺乳動(dòng)物真核細(xì)胞基因編輯以來(lái)，因其設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單、成本低、效率高而被廣泛應(yīng)用于多種生物學(xué)研究領(lǐng)域。在病毒學(xué)領(lǐng)域尤其是皰疹病毒的基因功能及疫苗研究中，該技術(shù)也已展現(xiàn)出巨大的技術(shù)優(yōu)勢(shì)[26-28]。隨著CRISPR/Cas9 系統(tǒng)首次應(yīng)用于改造MDV 基因組以來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者通過(guò)該系統(tǒng)成功構(gòu)建了一系列MDV蛋白質(zhì)編碼基因（如meq、pp38、gB）和miRNA 基因編輯缺失毒株[29-34]，為深入研究MDV 的基因功能和致病機(jī)制提供了新的技術(shù)支撐。鑒于此，以MDV國(guó)內(nèi)分離株HN302 為研究對(duì)象，利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)構(gòu)建HN302 的miR-M11 前體基因缺失毒株，探究miR-M11 缺失后對(duì)MDV 體外復(fù)制能力的影響，旨在為MDV 編碼的miRNA 的調(diào)控功能及分子機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

雞胚成纖維細(xì)胞（Chicken embryo fibroblast，CEF）由9～10日齡SPF雞胚制備；MDV 毒株HN302[7]以及pMD18T-gB/meq/OVO質(zhì)粒為河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；pX459 v2.0 基因編輯質(zhì)粒、鼠源抗MDV-pp38 單克隆抗體和兔源抗MDV-Meq 多克隆抗體由英國(guó)Pirbright 研究所Venugopal Nair教授饋贈(zèng)；鼠源抗MDV-gB 單克隆抗體由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)崔治中教授饋贈(zèng)。

1.2 主要試劑

M199、Opti-MEM 培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco 公司；10×Annealing Buffer 購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；TransIT-X2?Dynamic Delivery System 購(gòu)自Mirus Bio公 司；TIANamp Genomic DNA Kit 和TIANgel Midi Purification Kit 購(gòu)自TIANGEN 公司；E.Z.N.A?Endofree Plasmid Mini Kit Ⅱ購(gòu)自O(shè)mega Bio-Tek 公司；2×Easy Taq?PCR SuperMix、Trans1-T1 感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京全式金生物公司；T4 連接酶和BbsⅠ-HF酶購(gòu)自NEB 公司；DyLight 488/594 羊抗鼠/兔IgG 購(gòu)自Abbkine 公司；pMD-18T 載 體、PrimeScript?RT Master Mix 購(gòu) 自TaKaRa 公 司；FastStart Universal SYBR Green?Master（ROX）購(gòu) 自Roche 公 司；TaqMan? MicroRNA Reverse Transcription Kit、TaqMan Probe、TaqMan?Universal Master Mix Ⅱ、TaqMan?MicroRNA Assays購(gòu)自Thermo Fisher公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 gRNA 及PCR 引物設(shè)計(jì)與合成 利用Benchling（https://www.benchling.com）在線設(shè)計(jì)軟件，分別設(shè)計(jì)靶向Mid 基因簇miR-M11 莖環(huán)結(jié)構(gòu)及其鄰近序列的gRNA，其中非G開頭的gRNA oligo序列在其5′端加上額外的1 個(gè)G，并在序列5′端添加BbsⅠ的酶切位點(diǎn)（表1），gRNA 靶點(diǎn)見(jiàn)圖1。利用Premier Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）和實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）引物，基因序列見(jiàn)表1，均由生工生物工程（上海）股份有限公司（上海生工）合成。

表1 靶向miR-M11的gRNA及用于鑒定miR-M11缺失株的PCR引物序列Tab.1 gRNA targeting miR-M11 and PCR primer sequences for identification of miR-M11-deleted viruses

圖1 MDV編碼Mid基因簇miRNA的基因座位及gRNA靶點(diǎn)Fig.1 Genomic location encoding MDV miR-M11 in the Mid-cluster and target sites of gRNAs

1.3.2 pX459-gRNA 質(zhì)粒的構(gòu)建 使用BbsⅠ-HF酶切pX459 v2.0 質(zhì)粒并膠回收載體。使用10×Annealing Buffer 將表1 中的gRNA 互補(bǔ)雙鏈進(jìn)行復(fù)性，利用T4 DNA 連接酶將其連接到pX459 v2.0 載體中，轉(zhuǎn)化Trans1-T1 感受態(tài)細(xì)胞，涂布LB 平板，過(guò)夜培養(yǎng)后挑取單菌落。用Step2-F/Step2-R 引物對(duì)進(jìn)行菌液PCR 鑒定后，送上海生工測(cè)序。鑒定連接成功后提取pX459-gRNA質(zhì)粒，測(cè)定濃度后-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 基因編輯效果鑒定 提前準(zhǔn)備好24 孔細(xì)胞板CEF 單 層，依 據(jù)TransIT-X2?Dynamic Delivery System 使用說(shuō)明，將靶向miR-M11 莖環(huán)結(jié)構(gòu)上下游的pX459-gRNA 表達(dá)質(zhì)粒各250 ng 共轉(zhuǎn)染至CEF后，培養(yǎng)24 h。隨后將HN302病毒按1 000 pfu/孔感染轉(zhuǎn)染后的CEF，48 h后取50%細(xì)胞培養(yǎng)物，將其用1×DNA 提取緩沖液（200 μg/mL 蛋白酶K、10 mmol/L Tris-HCl，pH 值8.0、1 mmol/L EDTA、25 mmol/L NaCl）重懸，置于金屬浴中65 ℃30 min、95 ℃5 min后獲得細(xì)胞培養(yǎng)物總DNA。以其為模板，用Mid-F/Mid-R進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，對(duì)目的條帶切膠回收后連接pMD-18T載體，并送上海生工測(cè)序。

1.3.4 病毒純化及鑒定 將1.3.3 中轉(zhuǎn)染接毒后的24孔細(xì)胞板內(nèi)剩余50%的CEF重懸，用有限稀釋法接種至6孔細(xì)胞板CEF 單層。培養(yǎng)3～4 d，觀察到明顯的病毒噬斑后，顯微鏡下無(wú)菌操作挑取單克隆病毒噬斑，分別轉(zhuǎn)接至24孔細(xì)胞板CEF單層中。繼續(xù)培養(yǎng)2 d 后，按照1.3.3 中所述方法進(jìn)行PCR 鑒定。選取編輯產(chǎn)物電泳條帶較亮的孔，進(jìn)行下一輪噬斑純化。3 輪病毒噬斑純化后，獲得miR-M11 編輯缺失的毒株HN302ΔM11。將其連續(xù)傳代15 次，取第1—5 代、第10 代、第15 代病毒樣品，提取DNA 后進(jìn)行PCR 擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳分析，鑒定基因缺失毒株的穩(wěn)定性。

1.3.5 間接免疫熒光試驗(yàn)（IFA）從液氮中取出HN302親本毒株和miR-M11缺失毒株HN302ΔM11，分別將其轉(zhuǎn)接至24 孔細(xì)胞板CEF 單層內(nèi)。3 d 后，用預(yù)冷的甲醇∶丙酮（1∶1，250 μL/孔）固定；室溫固定10 min 后，用含0.05%Tween-20 的PBS（PBST）洗滌3 遍，甩干；加入含5%脫脂奶粉的PBST，放于37 ℃溫箱中封閉。封閉30 min 后，用PBST 洗3 遍，甩干；加入稀釋的MDV-pp38 鼠源單克隆抗體（1∶5 000，200 μL/孔），放于37 ℃溫箱中孵育。孵育30 min 后，用PBST 洗3 遍，甩干，加入稀釋的熒光二抗DyLight 488 羊抗鼠IgG（1∶1 000，200 μL/孔），放于37 ℃溫箱中孵育。孵育30 min 后，用PBST 洗3遍，甩干。隨后，再按照以上步驟孵育稀釋的MDV-gB 鼠源單克隆抗體（1∶5 000）和稀釋的熒光二抗DyLight 594 羊抗鼠IgG（1∶1 000）。PBST 洗3遍后，每孔加入200 μL PBST，放于倒置熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

同時(shí)，另取一孔平行接毒的細(xì)胞，按照上述操作步驟孵育MDV-Meq 兔源多克隆抗體（1∶5 000）、熒光二抗DyLight 488羊抗兔IgG（1∶1 000）、MDV-gB鼠源單克隆抗體（1∶5 000）和熒光二抗DyLight 594羊抗鼠IgG（1∶1 000）。最后用PBST 洗3 遍，每孔加入200 μL PBST，放于倒置熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.3.6 qPCR 從液氮中取出HN302 親本毒株和

miR-M11 缺失毒株HN302ΔM11，分別將其轉(zhuǎn)接至6孔細(xì)胞板CEF 單層內(nèi)，3 d 后收取細(xì)胞培養(yǎng)物，用TRIzol 法提取細(xì)胞培養(yǎng)物總RNA。使用PrimeScript?RT Master Mix 制備cDNA，以此cDNA為模板，使用表1 中熒光定量引物進(jìn)行qPCR，檢測(cè)病 毒 蛋 白 編 碼 基 因gB、meq、pp38、RLORF4、RLORF5a和ICP4的相對(duì)表達(dá)水平。以總RNA 為模板，使用TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit和MDV miRNA 反轉(zhuǎn)錄引物制備病毒miRNA 的cDNA，使用購(gòu)自Thermo Fisher 公司的MDV TaqMan探針檢測(cè)miR-M11-5p、miR-M11-3p、miR-M31-3p、miR-M1-5p、miR-M4-5p 和miR-M13-3p 等6 個(gè)病毒miRNA的相對(duì)表達(dá)水平。

1.3.7 病毒增殖曲線繪制 從液氮中取出HN302

親本毒株和miR-M11 缺失毒株HN302ΔM11，轉(zhuǎn)接至6 孔細(xì)胞板CEF 單層內(nèi)，500 pfu/孔。病毒感染后，每間隔24 h收取1個(gè)孔內(nèi)的全部細(xì)胞培養(yǎng)物（約106個(gè)細(xì)胞），至病毒感染后144 h 共收集6 次樣品。用TIANamp Genomic DNA Kit 提取上述樣品DNA，測(cè)定DNA 質(zhì)量濃度后稀釋為50 ng/μL，備用。同時(shí)，將pMD18T-meq、pMD18T-gB和pMD18T-OVO質(zhì)粒10 倍倍比稀釋后（108拷貝/μL～103拷貝/μL），構(gòu)建qPCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線。取上述病毒感染細(xì)胞的DNA樣品，使用表1 中列示的熒光定量引物進(jìn)行qPCR，分別測(cè)定2 個(gè)毒株在不同時(shí)間點(diǎn)gB、meq和OVO的基因拷貝數(shù)，并繪制病毒體外增殖曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 pX459-gRNA質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

根據(jù)MDV-1編碼的Mid基因簇miRNA基因座位及序列（圖1），針對(duì)miR-M11 前體基因設(shè)計(jì)2 條gRNA，通過(guò)破壞miR-M11的莖環(huán)結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)miRNA基因敲除的目的。將gRNA上下游互補(bǔ)雙鏈gR1F/gR1R和gR2F/gR2R分別復(fù)性后與pX459 v2.0載體連接并進(jìn)行測(cè)序。序列比對(duì)分析的結(jié)果表明（圖2），成功構(gòu)建了2 個(gè)靶向miR-M11 的gRNA/Cas9 表達(dá)質(zhì)粒：pX459-gR1和pX459-gR2。

圖2 pX459-gRNA重組質(zhì)粒gRNA連接區(qū)域測(cè)序結(jié)果Fig.2 Sequencing results of the gRNA junction region of pX459-gRNA recombinant plasmids

2.2 基因編輯效率分析

通過(guò)pX459-gRNA 轉(zhuǎn)染細(xì)胞+病毒感染的方式，將2 個(gè)gRNA 表達(dá)質(zhì)粒各250 ng 共轉(zhuǎn)染至24 孔細(xì)胞板CEF 單層內(nèi)，24 h 后感染HN302，病毒感染48 h 后檢測(cè)基因編輯效果。結(jié)果顯示，感染病毒的陰性對(duì)照僅擴(kuò)增出1 135 bp 的大條帶，而轉(zhuǎn)染了pX459-gR1/gR2 質(zhì)粒組合并感染HN302 的CEF 中除了擴(kuò)增出1 135 bp 的大條帶之外，還均擴(kuò)增出841 bp 大小的與預(yù)期相符的基因編輯小條帶（圖3A）。膠回收目的小條帶，測(cè)序結(jié)果顯示，該基因片段確為miR-M11 被編輯剪切后的剩余序列，表明gR1 和gR2 有效編輯了病毒基因組。其中g(shù)R1 的切割位點(diǎn)為PAM 序列上游4 bp 處，而gR2 切割位點(diǎn)位于PAM 序列上游3 bp 處，與預(yù)期完全相符（圖3B、圖3C）。

圖3 miR-M11基因編輯及缺失毒株HN302ΔM11的PCR鑒定及測(cè)序分析Fig.3 PCR identification and sequencing analysis of the miR-M11 gene editing and the mutant HN302ΔM11

2.3 病毒純化及傳代穩(wěn)定性分析

將1.3.3中剩余的50%病毒感染細(xì)胞，以不同劑量梯度轉(zhuǎn)接至6孔細(xì)胞板內(nèi)，3～4 d后置于倒置顯微鏡下操作，挑取96 個(gè)單克隆病毒噬斑至24 孔細(xì)胞板不同孔CEF 中，培養(yǎng)48 h 后再次消化取樣進(jìn)行PCR 鑒定，選取編輯條帶較亮的陽(yáng)性孔，如上所述進(jìn)行第2 輪和第3 輪的病毒單噬斑純化，各隨機(jī)挑取48 個(gè)和24 個(gè)單噬斑，最終獲得1 株純化的miRM11 基因編輯缺失毒株，命名為HN302ΔM11（克隆號(hào)C58-8-4）。再次測(cè)序鑒定的結(jié)果與之前相一致（圖3B、3C）。將HN302ΔM11 連續(xù)傳代15 次，然后分別取樣進(jìn)行基因編輯穩(wěn)定性分析，PCR 擴(kuò)增鑒定的結(jié)果顯示，第1—5、10、15 代樣品中均只擴(kuò)增出841 bp大小的基因編輯小條帶（圖3D），表明基因缺失毒株HN302ΔM11的穩(wěn)定性良好。

2.4 病毒miRNA和蛋白質(zhì)編碼基因的表達(dá)分析

為分析Mid 基因簇miR-M11 的缺失是否影響其他 miRNA以及病毒蛋白編碼基因的表達(dá)，用HN302 和HN302ΔM11 分別感染CEF，3 d 后收取細(xì)胞培養(yǎng)物，提取總RNA 后反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用TaqMan 探針?lè)z測(cè)Mid 基因簇中miR-M11-5p、miR-M11-3p、miR-M31-3p、miR-M1-5p、miR-M4-5p 和miR-M13-3p 的相對(duì)表達(dá)水平。使用SYBR Green 法檢測(cè)gB、meq、pp38、RLORF4、RLORF5a和ICP4的相對(duì)表達(dá)水平。以miR-M13-3p 為內(nèi)參分析的結(jié)果顯示，親本株HN302 的miRNA 均可正常表達(dá)，而HN302ΔM11 的miR-M11-5p 和miR-M11-3p 均未檢測(cè)到表達(dá)，其余miRNA 均可表達(dá)（圖4）。以ICP4為內(nèi)參基因分析的qPCR 結(jié)果顯示，HN302ΔM11 和親本株的gB、meq、pp38、RLORF4和RLORF5a均正常表達(dá)（圖 5）。

圖4 HN302和HN302ΔM11感染CEF中部分病毒miRNA的相對(duì)表達(dá)水平Fig.4 Relative expression levels of MDV miRNAs in HN302 or HN302ΔM11-infected CEFs

圖5 HN302和HN302ΔM11感染CEF中部分病毒蛋白編碼基因的相對(duì)表達(dá)水平Fig.5 Relative expression levels of MDV protein-coding genes in HN302 or HN302ΔM11-infected CEFs

2.5 miR-M11基因缺失毒株的IFA鑒定結(jié)果

為分析miR-M11 的缺失是否影響MDV 噬斑形成及病毒蛋白的表達(dá)，用特異性抗MDV gB、pp38和Meq 蛋白的單克隆抗體或多克隆抗體分別孵育HN302 和HN302ΔM11 感染的CEF 細(xì)胞，進(jìn)行IFA染色。結(jié)果顯示，在熒光顯微鏡下，HN302 和HN302ΔM11 的綠色熒光染色的pp38 蛋白或Meq 蛋白均與紅色熒光染色的gB 蛋白所指示的病毒噬斑形成良好的共定位（圖6）。以上結(jié)果表明，miRM11的編輯缺失不影響MDV 的噬斑形成及gB、Meq和pp38蛋白的正常表達(dá)。

圖6 HN302和HN302ΔM11感染CEF中的gB、Meq和pp38蛋白表達(dá)的IFA分析Fig.6 IFA analysis of the gB，Meq and pp38 protein expressions in HN302 or HN302ΔM11-infected CEFs

2.6 miR-M11基因缺失毒株體外增殖曲線繪制結(jié)果

為測(cè)定miR-M11 的缺失是否影響MDV 的增殖，將HN302 和HN302ΔM11 分別感染6 孔細(xì)胞板CEF 單層，并在感染后24～144 h 內(nèi)每間隔24 h 收集1份樣品，提取總DNA 后檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)MDV 基因gB、meq以及宿主OVO基因的拷貝數(shù)，計(jì)算等量細(xì)胞內(nèi)病毒基因拷貝數(shù)并繪制病毒體外增殖曲線。結(jié)果顯示，與親本毒株HN302 相比，HN302ΔM11 的增殖速度更快，在等量接種感染CEF 后96 h 和120 h，基因缺失毒株的病毒增殖量均顯著高于親本毒株（圖7）。表明miR-M11 的編輯缺失顯著增強(qiáng)了MDV的體外復(fù)制能力。

圖7 HN302和HN302ΔM11在CEF中的增殖曲線Fig.7 Growth kinetics of HN302 and HN302ΔM11 viruses in CEFs

3 結(jié)論與討論

作為一種致瘤性α 皰疹病毒，MDV 在研究病毒致病和腫瘤形成機(jī)制中扮演重要角色。過(guò)去幾十年里，為研究MDV 編碼的基因功能，利用細(xì)菌人工染色體（Bacterial artificial chromosome，BAC）技術(shù)，已構(gòu)建了多種不同毒株的感染性BAC 克隆[35-37]。隨后利用Rec E/T 同源重組技術(shù)，可在BAC 克隆的基礎(chǔ)上進(jìn)一步對(duì)目的基因進(jìn)行敲除或敲入。近年來(lái)，利用該技術(shù)對(duì)MDV 編碼的miRNA 功能進(jìn)行研究也陸續(xù)報(bào)道[16，18-19]。但是，皰疹病毒基因組很大，BAC克隆的構(gòu)建過(guò)程比較耗時(shí)費(fèi)力，操作步驟煩瑣且Rec E/T 同源重組的效率較低。為方便突變體的篩選，往往還會(huì)在病毒基因組中插入外源的抗性篩選基因，如果作為疫苗候選毒株還需要進(jìn)一步將其從基因組中剔除。此外，在研究miRNA 功能時(shí)，因剔除抗性篩選基因后殘余的重組序列元件如FRT 的大小與miRNA 相似，也會(huì)對(duì)miRNA 重組毒株的篩選和鑒定造成很大的困難。

CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)的出現(xiàn)解決了BAC克隆和Rec E/T 同源重組技術(shù)的一些難題，因其構(gòu)建過(guò)程簡(jiǎn)單，可直接靶向病毒基因組且編輯效率非常高，不會(huì)將外源片段殘留至病毒基因組內(nèi)，很快在病毒學(xué)領(lǐng)域的基因功能研究及疫苗研發(fā)中得到了廣泛的應(yīng)用[26-28]。本研究利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)，采用雙重敲除策略，構(gòu)建2 個(gè)gRNA 靶向MDV 國(guó)內(nèi)分離株HN302 編碼的miR-M11 基因，構(gòu)建了1 株穩(wěn)定的miR-M11 基因編輯缺失毒株HN302ΔM11。病毒體外增殖曲線測(cè)定的結(jié)果顯示，HN302ΔM11 在感染CEF 后96 h 和120 h 的病毒基因組拷貝數(shù)均顯著高于其親本毒株HN302，這與此前報(bào)道的GXΔmiR-M11 和RB-1BΔmiR-M11 基因缺失毒株的相關(guān)研究結(jié)果一致[19，33]。上述研究進(jìn)一步證實(shí)，miR-M11 不僅不是病毒復(fù)制的必需基因，將其編輯缺失反而可以顯著增強(qiáng)MDV 的體外復(fù)制能力。但是miR-M11編碼的miRNA是直接調(diào)控MDV的病毒基因從而影響病毒增殖，還是通過(guò)靶向宿主基因及相關(guān)信號(hào)通路來(lái)調(diào)控細(xì)胞的增殖和/或凋亡以調(diào)節(jié)病毒復(fù)制，仍需要進(jìn)一步深入研究。

在MDV-1 編碼的3 個(gè)miRNA 基因簇中，研究較多的是Meq 基因簇的miRNA。其中miR-M4-5p已被證實(shí)是宿主癌基因miR-155 的病毒同功分子，可能作為MDV 促癌因子參與腫瘤的形成；敲除Meq基因簇的其他miRNA（miR-M2、miR-M3、miR-M5、miR-M9和miR-M12）后，腫瘤的發(fā)生率也都顯著降低，表明Meq 基因簇的miRNA 在MD 腫瘤形成過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[16-18]。Mid 基因簇和LAT 基因簇的miRNA 研究較少，其中Mid 基因簇miR-M31-3p的缺失也可顯著降低病毒的致病性和致瘤率，顯示出與miR-M4-5p 相似的調(diào)控功能[19]。前人研究表明，敲除GX0101 的miR-M4-5p 后，miR-M11 的表達(dá)水平明顯增加[18]。而本研究中發(fā)現(xiàn)miR-M11 被編輯缺失后，miR-M4-5p 和miR-M31-3p 的表達(dá)水平則顯著提高（P＜0.05），這表明miR-M11 與另外2個(gè)miRNA 的表達(dá)水平在MD 發(fā)病或腫瘤發(fā)生過(guò)程似乎保持著相互的制約和平衡，miR-M11 很可能作為抑瘤基因參與調(diào)控MD 腫瘤的形成?？傊?，本研究利用CRISPR/Cas9 基因編緝技術(shù)對(duì)HN302 的miR-M11 進(jìn)行編輯和缺失，構(gòu)建1 株穩(wěn)定的miRM11 缺失毒株，為后續(xù)研究MDV 編碼miRNA 的調(diào)控功能及分子機(jī)制奠定了重要基礎(chǔ)。