劉森堯 賈豐璘 國(guó) 慶 樊高鋒 周博如 姜廷波

（林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱 150040）

植物在其生命過(guò)程中極易受到低溫和鹽害等非生物脅迫，非生物脅迫極大地影響著植物的分布、生長(zhǎng)發(fā)育狀態(tài)和生產(chǎn)力［1］。例如，土壤鹽漬化會(huì)使種子生命力衰弱，胚芽、胚根等生長(zhǎng)受抑，嚴(yán)重時(shí)甚至停止萌發(fā)。而對(duì)植物地上部位造成的影響是，隨受鹽害時(shí)間的增加植物的株高和莖粗的生長(zhǎng)都受到嚴(yán)重的抑制；隨鹽濃度的提升，植物的株高和莖粗的生長(zhǎng)也開(kāi)始變緩慢。持續(xù)的低溫直接影響了植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，降低了植物自身的光合作用，抑制了根、莖、葉部的代謝活動(dòng)，造成植物的產(chǎn)量大幅度下降［2］。

為適應(yīng)生存環(huán)境，植物必須利用自身的生理生化過(guò)程來(lái)應(yīng)對(duì)非生物脅迫。研究發(fā)現(xiàn)，植物遭受到非生物脅迫時(shí)，會(huì)感知脅迫因素并產(chǎn)生信號(hào)傳遞，做出適應(yīng)性應(yīng)答。在這一過(guò)程中會(huì)有大量的轉(zhuǎn)錄因子參與其中。bHLH轉(zhuǎn)錄因子作為植物中第二大轉(zhuǎn)錄因子家族，被證明參與了植物對(duì)非生物脅迫的應(yīng)答過(guò)程。目前，轉(zhuǎn)基因植物相對(duì)于野生型植物，對(duì)逆境環(huán)境有較大的抵抗能力，生存率較高。這一觀點(diǎn)，已經(jīng)得到大量試驗(yàn)驗(yàn)證。在擬南芥（Arabidopsis thaliana）中，SPATULA基因與低溫抗性響應(yīng)相關(guān)，過(guò)表達(dá)此基因可提高植株在低溫環(huán)境下的存活率［3］。同樣，CE1與FAMA、MUTE和SPCH四者彼此作用，且都與干旱、高溫抗性響應(yīng)相關(guān)，過(guò)表達(dá)植株通過(guò)控制氣孔細(xì)胞的開(kāi)閉和光合作用減少水分的流失［4］，直接參與植物應(yīng)對(duì)脅迫的自身調(diào)節(jié)過(guò)程。bHLH92基因與鹽脅迫響應(yīng)相關(guān)，過(guò)量表達(dá)bHLH92可增強(qiáng)它的耐鹽性［5］。在84k楊（Populus alba×P.glandulosa‘84k’）中，PtrUNE12與鹽脅迫響應(yīng)相關(guān)，在過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株中，PtrUNE12可以通過(guò)調(diào)控楊樹(shù)活性氧代謝來(lái)提高耐鹽能力［6］。在轉(zhuǎn)基因落葉松（Larix olgensis）中，LobHLH34與鹽和干旱抗性響應(yīng)相關(guān)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性和抗旱性得到穩(wěn)定提高［7］。在露地菊（Chrysanthemum×grandiflora）中，Cgb-HLH113基因與鹽脅迫響應(yīng)相關(guān)，過(guò)表達(dá)植株的耐鹽 性 得 到 增 強(qiáng)［8］。在 甜 橙（Citrus sinensis）中，bHLH18基因與低溫抗性響應(yīng)相關(guān)，過(guò)表達(dá)植株可調(diào)控抗氧化酶基因的表達(dá)，從而增強(qiáng)其抗寒能力［9］。在核桃（Juglans regia）中，JrICE1基因同樣與低溫抗性響應(yīng)相關(guān)，在過(guò)表達(dá)植株中，抵抗低溫的能力也得到了提高［10］。這些都為證實(shí)bHLH轉(zhuǎn)錄因子參與植物響應(yīng)非生物脅迫過(guò)程提供了有效依據(jù)，也為進(jìn)一步探索在鹽脅迫或低溫脅迫條件下，PsnbHLH162基因在小黑楊（Populus simonii×P.nigra）體內(nèi)的作用機(jī)理提供了參考。

小黑楊是具有較強(qiáng)的抗旱、抗寒、抗鹽堿能力的本土樹(shù)種，它生長(zhǎng)速度快、易遺傳轉(zhuǎn)化的特性，使其成為研究木本植物非生物脅迫的模式植物［11］。但在鹽堿地中，小黑楊的生長(zhǎng)和產(chǎn)量受到抑制，不能夠獲取較大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。因此需要獲取優(yōu)良的抗逆樹(shù)種，使小黑楊能夠在鹽堿地中正常生長(zhǎng)，同時(shí)改善土壤環(huán)境，獲取更高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和生態(tài)價(jià)值收益。本試驗(yàn)通過(guò)獲取小黑楊Psnb-HLH162基因，對(duì)其在鹽、低溫脅迫下的基因應(yīng)答模式進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以期為揭示基因在小黑楊應(yīng)答非生物脅迫的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供理論依據(jù)，為培養(yǎng)優(yōu)良的抗逆新品種提供支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 植物材料

長(zhǎng)勢(shì)良好的2 個(gè)月小黑楊組培苗、3 個(gè)月本氏煙草（Nicotiana benthamiana）土培苗，均來(lái)自于林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 菌株和載體

植物過(guò)表達(dá)載體pBI121-GFP，酵母表達(dá)載體pGBKT7，酵母陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒pGBKT7-53，酵母菌株Y2HGold，農(nóng)桿菌株（Agrobacterium tumefaciens）GV3101 均為林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。大腸桿菌（Escherichia coli）TOP10 感受態(tài)細(xì)胞、pMD19-T載體購(gòu)自TaKaRa公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 楊樹(shù)PsnbHLH162基因的克隆

從Phytozome（https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）下載了毛果楊（P.trichocarpa）的基因組序列，從中獲得了毛果楊轉(zhuǎn)錄因子基因（Potri.015G074500）的ORF 序列，以此分別設(shè)計(jì)長(zhǎng)度 為22 bp 的PsnbHLH162 F1和23 bp 的Psnb-HLH162 R12 條引物。選取長(zhǎng)勢(shì)優(yōu)良的小黑楊組培苗，采集新鮮的50 mg 葉片，通過(guò)CTAB 法直接獲取小黑楊的RNA，以其為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以小黑楊cDNA為模板，預(yù)變性94 ℃，4 min；變性94 ℃，30 s，退火54 ℃，30 s；延伸72 ℃，45 s，33輪循環(huán)；再延伸72 ℃，10 min的PCR反應(yīng)程序擴(kuò)增片段長(zhǎng)度537 bp的PsnbHLH162基因（見(jiàn)表1）。

表1 本研究所用的引物Table 1 Primer sequences used in this study

1.2.2 楊樹(shù)PsnbHLH162基因的生物信息學(xué)分析

克隆出長(zhǎng)度537 bp 的PsnbHLH162基因，通過(guò)瓊脂凝膠電泳，回收膠中目的DNA，進(jìn)行測(cè)序。找到NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）將測(cè)序后正確序列與毛果楊（Potri.015G07450 0）的ORF區(qū)進(jìn)行序列比對(duì)。之后進(jìn)行生物信息學(xué)分析，ExPASy（https：//web.expasy.org/protparam/）直接分析PsnbHLH162 蛋白的理化性質(zhì)。在TMpred中對(duì)PsnbHLH162 蛋白進(jìn)行跨膜域分析；使用EXPLASy Proteomics tools 中SOPMA 軟件分析Psnb-HLH162 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)；采用SWISS-MODEL 對(duì)PsnbHLH162蛋白進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。

采用NCBI-ORF Finder（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）和ProtParam 軟 件 對(duì)Psnb-HLH162基因進(jìn)行序列分析；找到同源性高的，再利用Bioedit 對(duì)PsnbHLH162 蛋白進(jìn)行多序列比對(duì)；最后用MEGA 7軟件對(duì)與此蛋白同源性較高的植物構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。

1.2.3 構(gòu)建植物表達(dá)載體PBI121-PsnbHLH162-GFP和亞細(xì)胞定位

通過(guò)同源重組構(gòu)建植物表達(dá)載體，設(shè)計(jì)長(zhǎng)度為27 bp 的PsnbHLH162 F2和PsnbHLH162 R22 條引物，以回收后的PsnbHLH162基因?yàn)槟０?，通過(guò)PCR 反應(yīng)大量獲取PsnbHLH162基因，然后用1%瓊脂糖凝膠電泳并在紫外燈下檢測(cè)，回收膠中目的DNA。用SalⅠ酶將PBI121-GFP 質(zhì)粒酶切線性化后，再次通過(guò)瓊脂凝膠電泳，回收膠中目的DNA。之后把1 μL PBI121-GFP 酶切產(chǎn)物、4 μLPsnbHLH162基因回收產(chǎn)物和5 μL Infusion 酶，置于50 ℃金屬浴內(nèi)連接30 min，然后冰浴5 min，最后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入TOP10 感受態(tài)大腸桿菌。從PBI121-GFP 載體上設(shè)計(jì)2 條通用引物pBI121F 和pBI121R，通過(guò)PCR 擴(kuò)增檢測(cè)單克隆菌落，將正確的菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，次日提取PBI121-PsnbHLH162-GFP 質(zhì) 粒。最 后 再 將PBI121-PsnbHLH162-GFP 轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌感受態(tài)（GV3101），通過(guò)PCR 反應(yīng)檢測(cè)單克隆菌落，條帶正確的菌落擴(kuò)大培養(yǎng)。

通過(guò)煙草注射法［12］將陽(yáng)性對(duì)照含PBI121-GFP質(zhì)粒和融合表達(dá)蛋白PBI121-PsnbHLH162-GFP 的農(nóng)桿菌分別侵染進(jìn)入煙草表皮，黑暗場(chǎng)所下培養(yǎng)48 h，并在激光共聚焦顯微鏡下觀測(cè)蛋白在煙草細(xì)胞中的定位。

1.2.4 PsnbHLH162蛋白轉(zhuǎn)錄激活活性分析

根據(jù)PsnbHLH162基因的ORF 區(qū)設(shè)計(jì)引物，引入NdeⅠ和NcoⅠ酶切位點(diǎn)，引物設(shè)計(jì)為Psnb-HLH162 BDF和PsnbHLH162 BDR，以PsnbHLH 162基因?yàn)槟０暹M(jìn)行PCR 擴(kuò)增反應(yīng)，之后通過(guò)瓊脂凝膠電泳，回收膠中目的DNA。將pGBKT7 載體和膠回收產(chǎn)物雙酶切，并使用T4 連接酶構(gòu)建載體，最后轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌中，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。1 d后，將白色單菌落使用pGBKT7載體通用引物BD F和BD R進(jìn)行檢測(cè)并送測(cè)序，獲得pGBKT7-Psnb-HLH162重組質(zhì)粒。

內(nèi)含pGBKT7空載質(zhì)粒的酵母為陰性對(duì)照，內(nèi)含pGBKT7-53 的酵母菌株為陽(yáng)性對(duì)照。分別將pGBKT7-PsnbHLH162重 組 質(zhì) 粒、pGBKT7 空 載 質(zhì)粒、pGBKT7-53 轉(zhuǎn)入Y2HGold 酵母細(xì)胞中，通過(guò)PCR 進(jìn)行檢測(cè)后用接種環(huán)分別蘸取3 種酵母菌液在SD-Trp、SD/-Trp/-His/X-α-Gal 缺陷培養(yǎng)基上點(diǎn)點(diǎn)，30 ℃倒置培養(yǎng)3 d 左右，觀察菌落生長(zhǎng)狀態(tài)與能否變藍(lán)來(lái)檢驗(yàn)PsnbHLH162 蛋白是否具有轉(zhuǎn)錄激活活性。

1.2.5 鹽脅迫和低溫脅迫下PsnbHLH162基因表達(dá)的qRT-RCR

為探究PsnbHLH162基因在鹽脅迫和4 ℃低溫脅迫下基因在各組織的相對(duì)表達(dá)量，挑選組織培養(yǎng)1 個(gè)月且健康的小黑楊，在霍氏營(yíng)養(yǎng)液中水培30 d，分成2 個(gè)大組，分別用鹽、低溫進(jìn)行脅迫，其中NaCl 脅迫配置150 mmol·L-1NaCl 溶液，按時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行澆灌處理；低溫脅迫在氣候模擬箱內(nèi)，設(shè)置溫度為4 ℃，進(jìn)行處理。在上述處理0、3、6、12、24、48 h 后，對(duì)葉、莖、根的組織進(jìn)行取樣。苗木培育條件為14 h/10 h 光暗循環(huán)，24 ℃，相對(duì)濕度60%，所有脅迫處理包含5 個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)都內(nèi)含有3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

分別采集葉、莖、根組織后，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA 后進(jìn)行qRT-RCR（熒光定量PCR）。根據(jù)定量引物設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)長(zhǎng)度為21 bp 的Psnb-HLH162F3和22 bpPsnbHLH162R3 2條引物，進(jìn)行qRT-RCR，以內(nèi)參基因ACT為對(duì)照，程序設(shè)定為95.0 ℃ 30 s，95.0 ℃ 5 s，60.0 ℃，34 s，95.0 ℃ 15 s，60.0 ℃ 1 min，95.0 ℃ 15 s，置于定量PCR儀（ABI7500）中。最后用2-ΔΔCt法計(jì)算出PsnbHLH162基因相對(duì)表達(dá)量。

1.2.6 PsnbHLH162基因啟動(dòng)子的克隆和分析

用小黑楊基因組DNA 作為模板，根據(jù)Phytozome 中獲取的毛果楊同源基因Potri.015G07450-0.1編碼區(qū)上游大約2 000 bp 的序列設(shè)計(jì)引物QDbHLH162 F與QDbHLH162 R并進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，瓊脂凝膠電泳檢測(cè)后將大小正確的DNA 片段回收，之后與pMD19-T載體連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌后送生物公司進(jìn)行測(cè)序。

將PsnbHLH162基因啟動(dòng)子序列導(dǎo)入Plant-CARE數(shù)據(jù)庫(kù)中，分析順式作用元件。

2 結(jié)果

2.1 PsnbHLH162基因的克隆與生物信息學(xué)分析

通過(guò)克隆小黑楊cDNA 獲取長(zhǎng)度為537 bp 的PsnbHLH162基因，通過(guò)NCBI 程序進(jìn)行序列比對(duì)，觀察到與毛果楊轉(zhuǎn)錄因子基因（Potri.015G074500）的ORF序列同源比對(duì)率達(dá)99.07%。

對(duì)PsnbHLH162基因生物信息學(xué)分析可知，PsnbHLH162 蛋白含186 個(gè)氨基酸，其氨基酸分子質(zhì)量為20 354.68，分子式為C891H1477N255O267S10，理論等電點(diǎn)（pI）為9.51，是穩(wěn)定的親水性蛋白（見(jiàn)圖1：A，C），不穩(wěn)定指數(shù)（Ⅱ）是36.96（Ⅱ數(shù)值＞40 為不穩(wěn)定，Ⅱ數(shù)值＜40 為穩(wěn)定），總平均親水性（GRAVY）是-0.275（當(dāng)GRAVY＞0 為疏水性蛋白，GRAVY＜0 為親水性蛋白），脂肪系數(shù)（AI）是91.85。TMHMM Serverv.2.0 分析PsnbHLH162 蛋白是不含跨膜區(qū)域的非跨膜蛋白（見(jiàn)圖1B）。蛋白序列二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明：該蛋白有51.69%的α螺旋含96 個(gè)氨基酸、11.24%延伸鏈含21 個(gè)氨基酸、1.69%的β轉(zhuǎn)角含3 個(gè)氨基酸和35.39%的不規(guī)則螺旋含66個(gè)氨基酸（見(jiàn)圖2A）。三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果如圖所示（見(jiàn)圖2B）。

圖1 PsnbHLH162 蛋白信號(hào)肽、跨膜結(jié)構(gòu)域及親疏水性的預(yù)測(cè)A.PsnbHLH162 蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)；B.PsnbHLH162 蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和分析；C.PsnbHLH162蛋白氨基酸親疏水性區(qū)域分布Fig.1 PsnbHLH162 protein signal domain，trans-membrane domain and prophecy A.Prediction of protein signal peptide of PsnbHLH162；B.Prediction and analysis of transsmembrane structure of PsnbHLH162 protein；C.Distribution map of the amino acid hydrophobicity region of Psnb-HLH162 protein

圖2 PsnbHLH162蛋白二級(jí)（A）和三級(jí)結(jié)構(gòu)（B）預(yù)測(cè)Fig.2 PsnbHLH162 protein secondary（A）and tertiary structure（B）measurement

系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)和同源序列比對(duì)同時(shí)顯示小黑楊PsnbHLH162 蛋白在第17 到69 個(gè)氨基酸之間內(nèi)含1個(gè)HLH保守結(jié)構(gòu)域（見(jiàn)圖3），由52個(gè)氨基酸組成此結(jié)構(gòu)。將小黑楊PsnbHLH162 氨基酸序列與相同基因的10 個(gè)其他植物的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明與毛果楊（XP_002318646.1）、毛白楊（XP_034918711.1）高度同源。同源比對(duì)率分別為98.31%、95.51%（見(jiàn)圖4）。根據(jù)以上的比對(duì)結(jié)果，對(duì)這11個(gè)物種的bHLH162蛋白構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)說(shuō)明了小黑楊與毛果楊、毛白楊之間遺傳距離近，親緣關(guān)系近；而與擬南芥、煙草、玉米（Zea mays）等遺傳距離較遠(yuǎn)，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)（見(jiàn)圖5）。

圖3 PsnbHLH162蛋白保守結(jié)構(gòu)域Fig.3 PsnbHLH162 protein conserved domain

圖4 PsnbHLH162同源序列比對(duì)Fig.4 Homologous sequence alignment of PsnbHLH162

圖5 PsnbHLH162系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.5 Phylogenetic Tree of PsnbHLH162

2.2 小黑楊PsnbHLH162蛋白的亞細(xì)胞定位

在激光共聚焦顯微鏡內(nèi)觀察到的綠色熒光蛋白如圖6 顯示：陽(yáng)性對(duì)照PBI121-GFP 質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞核、細(xì)胞膜上全部表達(dá)，呈現(xiàn)出綠色熒光。PBI121-PsnbHLH162-GFP 質(zhì)粒僅在細(xì)胞核內(nèi)發(fā)出綠色熒光，直接證明PsnbHLH162蛋白是在煙草細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)。

2.3 PsnbHLH162蛋白轉(zhuǎn)錄激活活性分析

為驗(yàn)證小黑楊PsnbHLH162 蛋白是否具有轉(zhuǎn)錄激活活性，將含有pGBKT7 空載質(zhì)粒，pGBKT7-PsnbHLH162質(zhì)粒，陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒pGBKT7-53 的Y2HGold 酵母菌株分別在SD/-Trp 和SD/-Trp/-His/X-α-Gal 2種固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)菌株，3 d后取出觀察平板內(nèi)酵母菌的生長(zhǎng)狀態(tài)。由圖7 可知，3 種酵母菌都可在SD/-Trp 固體培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)，但在SD/-Trp/-His/X-α-Gal 二缺固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的是pGBKT7-53 質(zhì)粒的酵母菌，并且酵母呈現(xiàn)出藍(lán)色，其余2 種都無(wú)法生長(zhǎng)。有效地證明了Psnb-HLH162蛋白無(wú)轉(zhuǎn)錄激活活性。

圖7 PsnbHLH162的轉(zhuǎn)錄激活活性檢測(cè)Fig.7 Detection of transcriptional activation of PsnbHLH162

2.4 小黑楊轉(zhuǎn)錄因子PsnbHLH162基因的時(shí)空表達(dá)

利用qRT-PCR 技術(shù)對(duì)PsnbHLH162基因在鹽、低溫2 種脅迫條件下的時(shí)空表達(dá)模式進(jìn)行分析。以0 h 時(shí)該基因表達(dá)量為參照，分析2 種脅迫條件下各組織在5個(gè)時(shí)間點(diǎn)該基因的相對(duì)表達(dá)量。

結(jié)果顯示，在NaCl溶液處理后，試驗(yàn)組與對(duì)照組比對(duì)，發(fā)現(xiàn)PsnbHLH162基因的相對(duì)于0 h 的相對(duì)表達(dá)量存在差異，在葉、根組織中先升高后降低，總體呈現(xiàn)出上調(diào)趨勢(shì)。在葉中表達(dá)量0～24 h上升，24～48 h 下降，其中脅迫處理24 h 后到達(dá)頂峰，表達(dá)量為0 h的7.510倍。在根中表達(dá)量0～12 h上升，12～48 h 下降，在脅迫處理12 h 后到達(dá)頂峰，表達(dá)量為0 h 的51.405 倍?；蛟谇o組織中的表達(dá)量0～6 h 先升高，6～24 h 降低，24～48 h 再升高，呈現(xiàn)出上調(diào)趨勢(shì)，在處理48 h 后到達(dá)頂峰，表達(dá)量為0 h 的8.707 倍。與葉莖兩組織相比，基因在根中上升趨勢(shì)最為顯著，證實(shí)此基因主要在根中應(yīng)答（見(jiàn)圖8）。

圖8 小黑楊PsnbHLH162基因鹽脅迫處理下不同時(shí)間在葉、莖、根的相對(duì)表達(dá)量變化*代表與0 h數(shù)據(jù)具有顯著性差異，P＜0.05；下同F(xiàn)ig.8 Changes in the relative expression of PsnHLH162in leaves，stems and roots under salt stress at different times* represents a significant difference from the 0h data，P＜0.05；the same as below

在氣候模擬箱中4 ℃處理后結(jié)果表明：相對(duì)于0 h 的表達(dá)量，PsnbHLH162基因在葉、莖兩組織中的相對(duì)表達(dá)量先上升后下降，總體呈現(xiàn)出上調(diào)趨勢(shì)。在葉中表達(dá)量0～24 h 上升，24～48 h 下降，在脅迫處理24 h 后到達(dá)頂峰，表達(dá)量為0 h 的6.592倍。在莖組織中表達(dá)量0～12 h上升，12～24 h下降，在處理12 h 后到達(dá)頂峰，表達(dá)量為0 h 的736.548 倍。在根中表達(dá)量0～3 h 上升，3～6 h 下降，6～48 h 再次上升，表達(dá)量在處理24 h 后到達(dá)頂峰，為0 h 的16.861 倍。與葉相比，該基因在莖和根中表達(dá)差異顯著，但最高的還是在莖組織中（圖9）。

圖9 小黑楊 PsnbHLH162基因4 ℃低溫處理下不同時(shí)間葉、莖、根的相對(duì)表達(dá)量變化Fig.9 Changes in the relative expression of PsnHLH 162in leaves，stems and roots under 4 ℃ at different times

以上結(jié)果證實(shí)：PsnbHLH162基因?qū)Ω啕}、低溫脅迫具有明顯的適應(yīng)性應(yīng)答反應(yīng)。此基因表達(dá)量水平具有組織特異性，具體表現(xiàn)為NaCl脅迫下，基因在根組織中表達(dá)量最高，而在低溫條件下，反而莖組織中表達(dá)量最高。

2.5 PsnbHLH162基因啟動(dòng)子的克隆和分析

使用PlantCARE 對(duì)PsnbHLH162基因的啟動(dòng)子序列中的順式作用元件進(jìn)行分析。結(jié)果表明該啟動(dòng)子內(nèi)含許多核心啟動(dòng)子元件和激素應(yīng)答元件（見(jiàn)表2），包括脫落酸應(yīng)答元件ABRE、生長(zhǎng)素應(yīng)答元件TGA-element。此外，還發(fā)現(xiàn)了許多光應(yīng)答元件（GTGGC-motif、chs-CMA2a、TCT-motif）和一些參與晝夜節(jié)律控制、參與鹽、低溫、干旱誘導(dǎo)反應(yīng)的元件，表明PsnbHLH162基因有可能在小黑楊的生長(zhǎng)發(fā)育和感受晝夜變化的生理過(guò)程也發(fā)揮重要作用。

表2 PsnbHLH162基因啟動(dòng)子上的順式作用元件分析Table2 Analysis of the cis-acting elements on the promoter of PsnbHLH162

3 討論與結(jié)論

本研究從小黑楊中擴(kuò)增出長(zhǎng)度為537 bp的Psnb-HLH162轉(zhuǎn)錄因子，該基因蛋白共編碼186 個(gè)氨基酸。通過(guò)對(duì)PsnbHLH162的氨基酸序列進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)得知N端具有高度保守的HLH結(jié)構(gòu)域，蛋白是非跨膜蛋白。其二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明是含11.24%延伸鏈、1.69%的β轉(zhuǎn)角、35.39%的不規(guī)則螺旋、51.69%的α螺旋。亞細(xì)胞定位結(jié)果證明PsnbHLH162 蛋白的亞細(xì)胞定位情況，結(jié)果表明該蛋白為核定位蛋白，基因是在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)。

在酵母細(xì)胞中對(duì)PsnbHLH162 蛋白的轉(zhuǎn)錄激活活性進(jìn)行驗(yàn)證，該蛋白在酵母細(xì)胞中無(wú)轉(zhuǎn)錄激活活性。與SPL基因［13］（為bHLH 轉(zhuǎn)錄因子）相同，其在細(xì)胞中也無(wú)轉(zhuǎn)錄激活活性?，F(xiàn)已證明SPL基因被上游基因轉(zhuǎn)錄激活，之后開(kāi)始進(jìn)行轉(zhuǎn)錄翻譯。相反，PagUNE12［14］具有轉(zhuǎn)錄激活活性，能夠自我激活轉(zhuǎn)錄，不需要與其他基因相互作用再進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。PagUNE12與PsnbHLH162不同。因此推測(cè)PsnbHLH162可能是與其他基因相互作用，使其發(fā)生轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而進(jìn)行調(diào)控植物生理過(guò)程。

目前，bHLH 轉(zhuǎn)錄因子參與植物對(duì)逆境響應(yīng)相關(guān)研究也越來(lái)越多地被報(bào)道，如在水稻（Oryza sativa）中OsbHLH1［15］參與了抗低溫脅迫應(yīng)答，在擬南芥（Arabidopsis thaliana）中，AtbHLH122［16］的過(guò)表達(dá)可增加耐鹽性、滲透調(diào)節(jié)能力和脯氨酸濃度，在黃瓜（Cucumis sativus）中，CsbHLH041［17］賦予了黃瓜幼苗耐鹽性。但bHLH 轉(zhuǎn)錄因子在楊樹(shù)內(nèi)研究相對(duì)較少，鹽和低溫脅迫下的研究報(bào)道更少。在本研究中，對(duì)生長(zhǎng)狀態(tài)相同的小黑楊進(jìn)行5個(gè)時(shí)間點(diǎn)的鹽脅迫處理和4 ℃低溫脅迫處理，通過(guò)RT-qPCR結(jié)果表明，在鹽脅迫處理后，PsnbHLH162基因相比于0 h 在葉、莖、根3 個(gè)組織中表達(dá)量顯著上調(diào)，葉在處理24 h 后到達(dá)頂峰，表達(dá)量為7.510 倍；莖在處理48 h 后到達(dá)頂峰，表達(dá)量為8.707 倍；根在處理12 h后到達(dá)頂峰，表達(dá)量為51.405倍。經(jīng)4 ℃低溫脅迫后結(jié)果表明：PsnbHLH 162基因相比于0 h 在葉、莖、根3 個(gè)組織中的表達(dá)存在差異，總體呈現(xiàn)出上調(diào)趨勢(shì)，葉在處理24 h 后到達(dá)頂峰，為對(duì)照組6.592 倍；莖在處理12 h 后到達(dá)頂峰，為對(duì)照組736.548 倍；根在處理24 h 后到達(dá)頂峰，為對(duì)照組16.861 倍。以上結(jié)果證明PsnbHLH162基因參與了小黑楊對(duì)鹽和低溫的應(yīng)答過(guò)程，隸屬于逆境脅迫調(diào)控因子。

通 過(guò)PsnbHLH162與PsnNAC030［18］基 因 的 應(yīng)答模式進(jìn)行對(duì)比，小黑楊在高鹽、低溫4 ℃脅迫下，相比于0 h，PsnbHLH162基因在各部位的表達(dá)量也在增長(zhǎng)。但是在4 ℃低溫脅迫下，PsnbHLH162莖部的相對(duì)表達(dá)量超高，多達(dá)736.548 倍，但Psn-NAC030也有245.687 倍表達(dá)量，它們具有相似的結(jié)果；而鹽脅迫下PsnbHLH162在莖部相對(duì)表達(dá)量有8.707 倍，PsnNAC030有7.43 倍，兩者都響應(yīng)鹽脅迫，這暗示了在2 種非生物脅迫下PsnbHLH162與PsnNAC030在小黑楊體內(nèi)響應(yīng)調(diào)控機(jī)制一樣。同時(shí)也說(shuō)明在低溫條件下，莖組織中PsnbHLH162的響應(yīng)調(diào)控機(jī)制可能與在葉、根部有明顯不同。但還需要在獲取轉(zhuǎn)基因過(guò)表達(dá)株系后，進(jìn)一步探索是否為不同的應(yīng)答調(diào)控方式。在根部中，相比于0 h 兩種脅迫后基因表達(dá)量皆高，分別達(dá)到51.405倍、16.861倍，這也證實(shí)在脅迫后，根部也是其主要的應(yīng)答部位，不僅僅只在莖組織中主要應(yīng)答。

對(duì)PsnbHLH162基因啟動(dòng)子進(jìn)行預(yù)測(cè)分析后發(fā)現(xiàn)，具有13 個(gè)MYB 和3 個(gè)MYC 特異結(jié)合位點(diǎn)，而在擬南芥中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)bHLH 和MYB 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子AtMYC2和AtMYB2分別與MYC 和MYB 識(shí)別位點(diǎn)特異性相互作用，在體外激活擬南芥原生質(zhì)體中MYC 和MYB 識(shí)別位點(diǎn)驅(qū)動(dòng)的β-葡萄糖醛酸酶報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄［19］。這從側(cè)面證明了PsnbHLH162基因本身不具有轉(zhuǎn)錄激活能力，需要其他基因與PsnbHLH162啟動(dòng)子相互作用，來(lái)激活PsnbHLH162基因進(jìn)而調(diào)控植物生理過(guò)程。在擬南芥中，過(guò)表達(dá)OsMYB3R-2，轉(zhuǎn)基因植株對(duì)寒冷、干旱和鹽脅迫的耐受性明顯增加，轉(zhuǎn)基因種子萌發(fā)對(duì)脫落酸（ABA）或NaCl的耐受性也高于野生型［20］。擬南芥過(guò)表達(dá)AtMYB44的非生物脅迫的耐受性明顯提高［21-22］。過(guò)表達(dá)StMYB1R-1在馬鈴薯（Solanum tuberosum）中通過(guò)增強(qiáng)AtHB-7、RD28、ALDH22al和ERD1等干旱調(diào)控基因的表達(dá)，減少植物的水分流失，提高了抗旱性［23］。這些轉(zhuǎn)基因植株都證實(shí)了MYB家族多數(shù)基因都參與植物非生物脅迫的應(yīng)答過(guò)程，之后可通過(guò)酵母單雜交試驗(yàn)來(lái)尋找Psnb-HLH162上游的MYB 和bHLH 家族的調(diào)控基因，揭示它們彼此之間的作用關(guān)系，是否為組合控制［24］。啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)還發(fā)現(xiàn)了大量的光響應(yīng)元件和1 個(gè)circadian 元件，推測(cè)基因與植物生長(zhǎng)發(fā)育和感知晝夜節(jié)律變化有關(guān)聯(lián)［25］。已知植物激素脫落酸介導(dǎo)各種生理過(guò)程，包括對(duì)干旱、低溫和鹽脅迫的反應(yīng)。在啟動(dòng)子區(qū)域中發(fā)現(xiàn)3 個(gè)ABRE 序列和2 個(gè)MBS 序列，這證實(shí)PsnbHLH162參與鹽和低溫脅迫響應(yīng)，同樣參與干旱脅迫的應(yīng)答過(guò)程，之后可獲取轉(zhuǎn)基因苗木后做進(jìn)一步干旱脅迫驗(yàn)證。

以上研究說(shuō)明PsnbHLH162基因在應(yīng)對(duì)鹽、低溫脅迫過(guò)程中起到重要作用，參與整個(gè)植物個(gè)體的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。但整個(gè)應(yīng)答的過(guò)程是復(fù)雜的，需要進(jìn)一步的探索轉(zhuǎn)錄因子協(xié)調(diào)不同應(yīng)答信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的作用機(jī)理。為未來(lái)揭示PsnbHLH162基因在鹽、低溫脅迫響應(yīng)過(guò)程中的所扮演的角色提供參考，也為培育出小黑楊耐鹽、耐低溫新品種奠定基礎(chǔ)。