劉 基，孫振綱，鄧 巖，唐子揚

（1.長江大學(xué)醫(yī)學(xué)部，湖北 荊州 434000；2.長江大學(xué)附屬荊州醫(yī)院，湖北 荊州 434000）

胰腺癌（pancreatic adenocarcinoma，PAAD）是發(fā)生于胰腺組織的惡性腫瘤，早期癥狀隱匿，惡性度高，進展迅速，預(yù)后差，5 年生存率僅為2%～9%[1，2]。PAAD 風(fēng)險因素包括吸煙、慢性胰腺炎家族史、糖尿病、肥胖等[3，4]，在眾多風(fēng)險因素中炎癥過程已成為PAAD 發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵介質(zhì)[5]。炎癥和癌癥之間的功能關(guān)系是當(dāng)前臨床研究的熱點之一，多項研究表明[6-8]，腫瘤微環(huán)境在很大程度是由炎性細(xì)胞協(xié)調(diào)，炎癥是腫瘤過程不可缺少的參與者，可促進其增殖、存活與轉(zhuǎn)移。本研究基于炎癥相關(guān)的PAAD 預(yù)后模型，以期為PAAD 分子機制以及預(yù)后情況提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)收集 從GTEx 數(shù)據(jù)庫（https://xena.ucsc.edu/）中下載167 例正常胰腺樣本的RNA 測序數(shù)據(jù)，從TCGA 數(shù)據(jù)庫（https://portal.gdc.cancer.gov/）中下載4例正常胰腺樣本和178 例PAAD 樣本的RNA 測序數(shù)據(jù)和隨訪信息，以及從GEO（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）數(shù)據(jù)庫GSE57495 和GSE62452 共下載132 例PAAD 樣本的RNA 測序數(shù)據(jù)和隨訪信息，使用制造商提供的注釋文件將探針與基因匹配，如果有多個探針與單個基因匹配，則取RNA 基因測序數(shù)據(jù)的中值，根據(jù)GTEx、TCGA 和GEO 的數(shù)據(jù)訪問政策和發(fā)行的指南（數(shù)據(jù)均為公開數(shù)據(jù)），在Molecular Signatures 數(shù)據(jù)庫（https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/）[9]中下載炎癥反應(yīng)相關(guān)基因。

1.2 炎癥反應(yīng)相關(guān)基因的預(yù)后模型構(gòu)建 腫瘤樣本和正常樣本之間差異表達基因（DGEs）通過R 語言的“l(fā)imma”包以logFC 大于2 和P值小于0.05 進行差異分析和篩選，單變量Cox 分析用于篩選具有預(yù)后價值的炎癥反應(yīng)相關(guān)基因，并通過Benjamini&Hochberg（BH）校正方法調(diào)整P值。Lasso Cox 分析用于構(gòu)建預(yù)后模型，同時縮小過度擬合的風(fēng)險，使用R語言“glmnet”包用于去收縮變量，使得回歸系數(shù)相當(dāng)于零，建立預(yù)后模型。用于預(yù)后分析的表達差異基因的標(biāo)準(zhǔn)化表達矩陣是自變量，在TCGA 中患者的生存期和生存狀態(tài)是因變量，根據(jù)每個炎癥反應(yīng)相關(guān)基因的表達水平及其相應(yīng)的回歸系數(shù)計算患者的風(fēng)險評分。公式如下：分?jǐn)?shù)=sum（每個基因的表達量×對應(yīng)系數(shù)）。根據(jù)風(fēng)險分?jǐn)?shù)的中間Cut-off 值，將患者分為高風(fēng)險組和低風(fēng)險組。采用R 語言“scatterplot”包進行PCA 分析探討不同風(fēng)險組的分布情況，采R 語言“survminer”包進行生存分析，采用“survival”R 包和“timeROC”R 包進行時間依賴性ROC 曲線分析，以評估預(yù)后特征的預(yù)測價值。此外，行單變量和多變量Cox 分析，以探討基因特征的獨立預(yù)后價值。

1.3 功能富集分析和基因富集分析 采R 語言對差異表達基因行京都基因與基因組分析（KEGG）和基因本體分析（GO）分析，使用R 語言“bioconductor”包行基因名和富集通路名稱的匹配，以差異基因表達譜為變量，以KEGG 和GO 分子特征和通路的表達譜為參考，同時計算logFC 值，P值根據(jù)BH 方法進行調(diào)整。使用“DOSE”“clusterProfiler”“pathview”“enrichplot”包進行KEGG 和GO 富集分析，使用R語言“digest”“GOplot”包進行基因和富集通路聯(lián)系分析，以logFC 值為表示兩者之間的關(guān)系度。

1.4 特征基因驗證 為了測試從TCGA 隊列構(gòu)建的模型穩(wěn)定性和胰腺癌生存狀態(tài)和時間的影響因素，GEO 數(shù)據(jù)庫中GDE57495 和GSE62452 的患者也根據(jù)TCGA 隊列的風(fēng)險系數(shù)取中間Cut-off 值分為高風(fēng)險組或低風(fēng)險組。

1.5 腫瘤微環(huán)境和免疫反應(yīng)分析 將200 個炎癥基因用R 語言“l(fā)imma”包進行數(shù)據(jù)矯正，使用R 語言“estimate”包給每個樣本行腫瘤環(huán)境、免疫環(huán)境、腫瘤純度進行評分，使用“pheatmap”繪制高、低風(fēng)險組在腫瘤免疫微環(huán)境的表達情況，使用R 語言“ggpubr”包分析高、低風(fēng)險組在不同腫瘤免疫微環(huán)境的表達差異。

1.6 生存預(yù)測列線圖的建立與評估 為了準(zhǔn)確預(yù)測1、2、3 年的總生存率（0S），通過整合年齡、性別、風(fēng)險分?jǐn)?shù)構(gòu)建預(yù)后列線圖，Harrell’s 一致性指數(shù)（C 指數(shù)）評估預(yù)測準(zhǔn)確性，C 指數(shù)范圍從0.5（無預(yù)測能力）到1（完美預(yù)測）。校準(zhǔn)圖用于評估列線圖的性能特征。

1.7 數(shù)據(jù)分析 采用Wilcoxon 檢驗比較癌癥組織和正常組織之間的差異表達基因，采用Kaplan-Meier分析比較各組OS 差異。采用單變量和多變量Cox分析篩選OS 的獨立預(yù)測因子。使用estimate 包對各組腫瘤進行基質(zhì)細(xì)胞評分、免疫細(xì)胞評分、綜合評分（基質(zhì)細(xì)胞評分+免疫細(xì)胞評分）、腫瘤純度評分。R軟件（版本4.1.1）和軟件包ggplot2、igrph、pheatmap、ggpubr 和survminer 被用來創(chuàng)建平面圖。雙尾P值小于0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 炎癥相關(guān)差異表達基因的識別 共得到29 個差異表達基因，見圖1A、1B。除HPN 基因在正常組織中表達高于腫瘤組織，其余基因在腫瘤組織表達均高于正常組織（P＜0.05）；單變量COX 分析顯示，17個基因與OS 相關(guān)，MET 基因的風(fēng)險率為1.960（95%CI1.555～2.470，P＜0.001），見圖1C、1D。

圖1 TCGA 和GTEx 數(shù)據(jù)序列中識別炎癥相關(guān)差異表達基因

2.2 炎癥相關(guān)基因預(yù)后模型的構(gòu)建 將差異基因用Lasso Cox 方法進行分析，構(gòu)建預(yù)后模型，根據(jù)最佳λ 值確定了6 個標(biāo)記基因（圖2A、2B），風(fēng)險分?jǐn)?shù)根據(jù)score=0.047×CXCL9 的基因表達量+0.028×LY6E的基因表達量+0.038×HBEGF 的基因表達量+0.524×MET 的基因表達量+0.096×CXCL10 的基因表達量+0.051×RTP4 的基因表達量進行計算，根據(jù)中間Cut-off 值劃分為高、低風(fēng)險組（圖2C）；散點圖顯示，高風(fēng)險組患者比低風(fēng)險的患者預(yù)后差（圖2D）；PCA 分析顯示，患者在高、低風(fēng)險組中可以被分為兩個不同方向（圖2E）；Kaplan-Meier 曲線顯示，高風(fēng)險組總體生存率OS 低于低風(fēng)險組（P＜0.05，圖2F）；ROC 曲線分析顯示，曲線下面積（AUC）等于0.774，表明預(yù)后模型準(zhǔn)確性較高（圖2G）。使用GEO數(shù)據(jù)庫測試在TCGA 數(shù)據(jù)庫中構(gòu)建模型的穩(wěn)定性，從GEO數(shù)據(jù)庫抽取GSE57495、GSE62452 根據(jù)TCGA 數(shù)據(jù)風(fēng)險分?jǐn)?shù)的計算方法和中間值將患者劃分為高風(fēng)險組和低風(fēng)險組，得到的結(jié)果和TCGA 相類似（圖2I），PCA 將患者劃分為兩個方向的分布（圖2H），患者在高風(fēng)險組較低風(fēng)險組提前死亡（圖2J），并且相對低風(fēng)險組生存期更短（圖2K）；此外，6個基因AUC 曲線是0.632（圖2L）。

圖2 6 個預(yù)后基因在GEO 和TCGA 預(yù)后模型的分析

2.3 胰腺癌的預(yù)后因素 單因素Cox 分析顯示，風(fēng)險評分和OS 相關(guān)（HR=3.19，95%CI=2.077～4.911，P＜0.001）；在糾正其它混合因素后，多因素Cox 分析顯示，風(fēng)險評分也和OS 相關(guān)（HR=3.302，95%CI=2.074～5.260，P＜0.001）；ROC 曲線分析顯示，風(fēng)險分?jǐn)?shù)具有良好預(yù)后預(yù)測準(zhǔn)確度，且PAAD 具有良好的預(yù)后價值，見圖3。

圖3 胰腺癌的預(yù)后因素

2.4 生物功能和通路富集分析 通過GO 富集分析顯示，29 個差異表達基因在PAAD 患者的生物進程（BP）主要在細(xì)胞趨化作用、細(xì)胞對脂多糖的反應(yīng)、細(xì)胞對細(xì)菌起源分子的反應(yīng)、細(xì)胞對生物刺激的反應(yīng)、骨髓白細(xì)胞游走等5 個進程占主導(dǎo)作用，癌癥細(xì)胞主要有膜錨定構(gòu)件、分泌顆粒膜、膜筏、膜微區(qū)等主要細(xì)胞組分（CC），分子功能（MF）主要是受體配體活動、信號受體激活物活性、細(xì)胞因子活性、G 蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合等分子功能參與活動（圖4A）。通過KEGG 富集分析顯示，29 個差異表達基因主要參與細(xì)胞因子受體相互作用、病毒蛋白與細(xì)胞因子及細(xì)胞因子受體的相互作用生物功能及腫瘤壞死因子信號通路、趨化因子信號通路、Toll 樣受體信號通路（圖4B）；同時，建立這些通路和基因之間的聯(lián)系（圖4C～圖4F）。

圖4 生物功能和富集通路分析

圖4 生物功能和富集通路分析（續(xù)）

2.5 免疫活性和腫瘤微環(huán)境分析 低風(fēng)險組免疫通路較高風(fēng)險組更加活躍（圖5A），另低風(fēng)險組免疫評分、腫瘤評分和免疫及腫瘤微環(huán)境綜合評分高于高風(fēng)險組，相反腫瘤純度呈現(xiàn)相反趨勢，腫瘤純度從低風(fēng)險到高風(fēng)險組呈上升趨勢（Kruskal-Wallis test，P＜0.01，圖5B～圖5E）。

圖5 免疫活性和腫瘤微環(huán)境

圖5 免疫活性和腫瘤微環(huán)境（續(xù)）

2.6 建立列線圖對總生存率進行預(yù)測 在TCGA 數(shù)據(jù)中，基于年齡、性別、風(fēng)險分?jǐn)?shù)預(yù)后因素建立關(guān)于PAAD 患者總生存率的列線圖（圖6A），校準(zhǔn)圖進一步證實列線圖能夠較好的預(yù)測患者2、3 年的總體生存率，是一個較好的預(yù)測模型（圖6B、圖6C）。

圖6 列線圖的構(gòu)建

3 討論

隨著精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)和公共衛(wèi)生的發(fā)展，PAAD 得到了較好的治療以及控制，然而因為實用標(biāo)記物較少，現(xiàn)在仍然無法有效的進行早期診斷以及PAAD 患者治療評估。CA199 作為PAAD 中的一種診斷性腫瘤標(biāo)志物的作用已被證實，由于受到宿主炎癥反應(yīng)和梗阻性黃疸的干擾，從良性疾病中準(zhǔn)確診斷PAAD 的個體能力較低[10，11]。然而，作為PAAD 預(yù)后因子的炎癥反應(yīng)相關(guān)基因標(biāo)記物極少報導(dǎo)。既往研究表明[12-14]，鐵死亡相關(guān)基因、免疫相關(guān)基因、m6A相關(guān)基因顯著影響PAAD 預(yù)后。本研究中構(gòu)建的炎癥反應(yīng)相關(guān)基因與上述基因相比具有更多優(yōu)勢，如本研究結(jié)合了GTEx 數(shù)據(jù)庫中更多的正常樣本，使得差異基因更加具有差異性，同時探索了免疫活性和腫瘤微環(huán)境在高、低風(fēng)險組的表達狀態(tài)，并且構(gòu)建列線圖對2、3 年P(guān)AAD 總體生存率進行預(yù)測。

本研究建立的預(yù)后模型由6 個炎癥反應(yīng)相關(guān)差異表達基因組成（CXCL9、LY6E、HBEGF、MET、CXCL10、RTP4），這些基因在PAAD 中均上調(diào)。CXCL9、CXCL10 屬于趨化因子，與腫瘤微環(huán)境中免疫環(huán)境變化有關(guān)，其中CXCL9 可以通過STAT3 信號通路影響CD8+T 細(xì)胞，CXCL9 表達量的提升會抑制CD8+T 細(xì)胞的抗腫瘤細(xì)胞因子的增殖、活化、分泌[15-17]，而CXCL10 可以通過其受體CCR7 和CXCR3 促進PAAD 細(xì)胞的遷移[18]，HBEGF 可以誘導(dǎo)EGFR 核轉(zhuǎn)位和組蛋白H4 甲基化，進而介導(dǎo)EGFR 的代謝激活，而EGFR 配體的轉(zhuǎn)錄上調(diào)引起EGFR 信號的傳導(dǎo)，導(dǎo)致谷氨酰胺饑餓，從而促進體外胰腺腺泡細(xì)胞DNA 損傷的消退。在刺激YES 相關(guān)蛋白（YAP）的活性時，則影響PAAD 的生存預(yù)后[19-21]。RTP4 由Ⅰ型IFN（IFN-Ⅰ）誘導(dǎo)，并與TANK 結(jié)合激酶（TBK1）復(fù)合物結(jié)合，通過干擾TBK1 和IFN 調(diào)節(jié)因子3 的表達和磷酸化來負(fù)調(diào)節(jié)TBK1 信號傳導(dǎo)[22]。本研究中通過對PAAD 預(yù)后模型的構(gòu)建，進一步驗證此6 個PAAD 相關(guān)炎癥基因可以作為PAAD 預(yù)測分子。

已有研究表明[23]，Toll 樣受體（TLR）在炎癥和免疫反應(yīng)中起關(guān)鍵作用，其主要參與病原體相關(guān)分子模式（PAMP）和危險相關(guān)分子模式（DAMP）。本研究在免疫微環(huán)境分析中，高風(fēng)險組患者的免疫細(xì)胞浸潤、抗腫瘤免疫活動及兩者綜合活動均較多，表明高風(fēng)險組患者的免疫功能整體受損，免疫活動的增加可以解釋低風(fēng)險組患者具有良好的臨床結(jié)果，然而高風(fēng)險組的腫瘤純度高于低風(fēng)險組，這表明不良預(yù)后與腫瘤微環(huán)境無關(guān)。同時，有研究表明先天免疫系統(tǒng)由已經(jīng)存在于體內(nèi)的免疫細(xì)胞組成，這些細(xì)胞可以立即被招募到感染部位。天然免疫細(xì)胞包括粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞（NK）和樹突狀細(xì)胞（DC）。中性粒細(xì)胞通常會觸發(fā)對炎癥的快速反應(yīng)并分泌細(xì)胞因子，而成熟后，巨噬細(xì)胞可以分化為M1 和M2 極化細(xì)胞，進而抑制炎癥反應(yīng)和促進腫瘤的生長[24]，這同本研究中低風(fēng)險人群在免疫浸潤活動是一致的。

綜上所述，炎癥反應(yīng)相關(guān)基因的預(yù)后特征是預(yù)測PAAD 患者預(yù)后的良好工具，但仍需要進一步的研究證實。