徐永艷 李 昆 焦 蓉 汪 瓊 王占娣 石冰杰 徐 榮

（1. 西南林業(yè)大學，云南 昆明 650233；2. 中國林科院資源昆蟲所 云南 昆明 650224；3. 玉溪師范學院，云南 玉溪 653100）

滇重樓（Paris polyphyllavar.yunnanensis）為延齡草科（Trilliaceae）重樓屬多年生草本植物，是我國西南地區(qū)重要的林下中藥資源。其根莖具有止血散瘀、清熱解毒、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等功效[1-2]。是云南省傳統(tǒng)道地藥材，歷來為我國眾多著名中成藥如云南白藥等的主要原料[3]。滇重樓在云南分布廣，且地理種源較多[4]，具有豐富的遺傳多樣性。但是近年來，滇重樓野生資源持續(xù)掠奪式采挖，加之滇重樓根莖生長周期漫長、生長速度緩慢，生產(chǎn)上亟待篩選出優(yōu)良種源加以保護利用。皂苷是重樓藥材主要有效藥用成份[5-6]，重樓皂苷含量及藥材質(zhì)地受栽培環(huán)境、土壤、氣候等因素影響[7-8]，不同地理種源的滇重樓品質(zhì)不同，皂苷含量差別較大，這也是滇重樓作為云南傳統(tǒng)道地藥材最為重要的特點之一。目前對滇重樓報道研究主要集中在化學成分提取分離、藥理活性、栽培技術、分子生物學、內(nèi)生菌等方面，鮮有資源質(zhì)量評價的研究，系統(tǒng)對云南主分布區(qū)滇重樓野生種質(zhì)資源收集與評價未見報道。丹參（Salvia miltiorrhiza）、黃芪（Astragalus membranaceus）、人 參（Panax ginseng）、山 茱 萸（Cornus officinalis）等莖類藥用植物篩選種源時，通常以生長指標和藥用成分含量作為篩選標準，因此本研究以根莖生長速度、皂苷成分含量作為優(yōu)質(zhì)種源篩選標準較為科學。

本研究選用了目前市面上認可度較高的普洱景東、玉溪澄江、文山丘北、楚雄大姚、曲靖馬龍、昭通鎮(zhèn)雄、大理劍川、麗江永勝8 個地理種源，通過測定其皂苷含量及生長速度，篩選出皂苷含量較高、生長較快、來源豐富的滇重樓種源，對于滇重樓野生種質(zhì)資源保護和產(chǎn)業(yè)發(fā)展意義重大，研究結果可為滇重樓中藥材栽培和產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料的收集與處理

滇重樓種源種質(zhì)的收集，選擇曲靖馬龍、玉溪澄江、昭通鎮(zhèn)雄、楚雄大姚、大理劍川、麗江永勝、普洱景東、文山丘北共8 個云南省主要地理分布區(qū)的地理種源收集[9]。分別采集50 株7 年生野生滇重樓（經(jīng)西南林業(yè)大學曾覺民教授鑒定為滇重樓），實地采樣記錄樣地海拔、經(jīng)緯度及植被狀況等（表1）。

表1 滇重樓不同地理種源地信息表Table 1 Information of different geographical provenances

1.2 試劑

對照品重樓皂苷Ⅰ（YJ-111591）、皂苷Ⅱ（YJ-111592）、皂苷Ⅵ（YJ-111593）和皂苷Ⅶ（YJ-111594）均從中國藥品生物制品檢定所購買，供含量測定用。乙醇、甲醇為分析純，乙腈為色譜純。

1.3 樣品檢測與分析

1.3.1 滇重樓樣品中重樓皂苷的提取

采用加熱回流法提取重樓皂苷。每個地理種源隨機抽取20 株根莖部干燥粉碎，40 目的細篩過篩，稱取0.5 g 置于100 mL 的圓底小燒瓶。加入25 mL 乙醇后稱量（W），80 ℃加熱回流30 min；冷卻后再次稱量，乙醇補足至原來的W；混勻后移取1 mL 至離心管，2 800 r/min 轉(zhuǎn)離心15 min。

1.3.2 高效液相法測定重樓皂苷含量

色譜柱DIKMA 公司LeapsilC18，（100×4.6 mm，2.7 μm），乙腈-水流動相，203 nm 檢測波長，30 ℃柱溫，1 mL/min 流速，10 μL 進樣量。稱取對照品適量，加甲醇制成每1 mL 分別含重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ為0.372 08、0.377 34、0.355 64、0.380 00 mg 的混合溶液即得，0.45 μm 的微孔濾膜過濾對照品及樣品溶液備用。

1）線性關系分析。由低濃度到高濃度精密吸取重樓皂苷Ⅰ、重樓皂苷Ⅱ、重樓皂苷Ⅵ和重樓皂苷Ⅶ的標準品溶液10 μL 依次注入色譜儀。分別以進樣量、峰面積為橫坐標（X）、縱坐標（Y），繪制出標準曲線，計算線性回歸方程、相關系數(shù)以及相應的線性范圍。各標準品在表2范圍內(nèi)與其峰面積呈良好的線性關系。

表2 滇重樓標樣的線性關系考察表Table 2 Calibration data of saponins reference substances

2）精密度試驗。精密吸取對照品溶液（0.539 mg/mL）適量，按上述色譜條件重復進樣6 次，記錄峰面積。RSD 的結果為0.39%，說明所采用儀器的精密度良好。

3）穩(wěn)定性試驗。吸取適量的同一供試品溶液，于放置0、4、8、12、16、24 h 時分別按上述色譜條件進樣測定。RSD 的結果表明供試品的溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

4）重復性試驗。取同一產(chǎn)地樣品適量制備供試品溶液，分別在上述色譜條件下測定重樓皂苷Ⅰ、重樓皂苷Ⅱ、重樓皂苷Ⅵ、重樓皂苷Ⅶ的含量。RSD 的結果表明：該方法重復性良好。

實驗設置3 次重復。

1.3.3 不同地理種源滇重樓的年生長量測定

滇重樓樣本栽培于西南林業(yè)大學樹木園苗圃（25°3′N，102°45′E），70%遮 陰 網(wǎng) 下 統(tǒng) 一 管理。滇重樓地上莖倒苗后，每個種源隨機挖取30 株地下根莖稱量鮮重后種回，1 a 后再次挖取稱量，2 次稱量的差值測算每株根莖年增長量和年增長率。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用EXCEL 進行原始數(shù)據(jù)整理和統(tǒng)計，SPSS 26.0 進行方差分析、多重比較、相關性和聚類分析。

2 結果與分析

2.1 滇重樓根莖皂苷含量的種源差異

由表3 可知不同種源滇重樓根莖皂苷含量具有很大差異，皂苷Ⅰ、皂苷Ⅱ、皂苷Ⅵ、皂苷Ⅶ和總皂苷（Ⅰ + Ⅱ + Ⅵ + Ⅶ）含量中，總皂苷含量變異幅度為2.145～15.749 mg/g。其中普洱景東種源含量最高，麗江永勝種源含量最低，前者是后者的7.342 倍，除大理劍川和麗江永勝外6 個種源樣品皂苷含量均達到0.6%的藥典標準，屬于優(yōu)良種源。不同種源皂苷Ⅰ含量變異范圍為0.534～10.639 mg/g，皂苷Ⅱ含量變異范圍為1.248～6.793 mg/g，皂苷Ⅵ含量變異范圍為0.000～1.208 mg/g，皂苷Ⅶ含量變異范圍為0.000～0.546 mg/g。僅普洱景東、大理劍川種源檢測出皂苷Ⅵ，大理劍川、文山丘北種源未檢測出皂苷Ⅶ。方差分析表明，不同種源滇重樓根莖皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ和總皂苷（Ⅰ + Ⅱ + Ⅵ + Ⅶ）的含量存在極顯著差異（P＜ 0.01），8 個地理種源重樓皂苷含量：普洱景東＞玉溪澄江＞文山丘北＞楚雄大姚＞曲靖馬龍、昭通鎮(zhèn)雄＞大理劍川＞麗江永勝。8 個地理種源滇重樓皂苷成分以薯蕷類的重樓皂苷Ⅰ和重樓皂苷Ⅱ為主，偏諾類的重樓皂苷Ⅵ、重樓皂苷Ⅶ為輔。

表3 不同種源滇重樓皂苷含量差異Table 3 The difference of saponins contents of P. polyphylla var. yunnanensis from 8 provenances mg/g

2.2 滇重樓根莖皂苷含量與氣候生態(tài)因子的相關分析

由表4 可知，滇重樓根莖皂苷含量與氣候生態(tài)因子間相關性的顯著性檢驗表明，滇重樓根莖皂苷I 含量與經(jīng)度及年平均溫度、 總皂苷含量與經(jīng)度及緯度間相關性顯著（P＜0.05），相關系數(shù)值分別為0.797、0.826、0.787 和-0.725。說明皂苷I 含量與經(jīng)度、總皂苷含量與經(jīng)度、皂苷I 與年平均溫度間存在非常緊密正相關關系，總皂苷含量與緯度間存在非常緊密負相關關系。總皂苷含量與海拔間相關系數(shù)為-0.371，未達到顯著水平，存在緊密的負相關性，而總皂苷含量與年均氣溫和年均降水量間相關系數(shù)分別為0.668 和0.672，存在緊密的正相關性。

表4 滇重樓皂苷含量與種源地氣候生態(tài)因子相關分析Table 4 Correlation analysis of saponins contents and ecological factors of P. polyphylla var. yunnanensis

2.3 不同種源滇重樓根莖生長分析與比較

由表5 可知，不同種源滇重樓根莖生物年生長量及年生長速率具有很大差異，大理劍川種源滇重樓根莖生長速度最快，年生物量為35.3 g，年生長速率為21.41%，遠高于其他地理種源，麗江永勝、普洱景東、玉溪澄江種源次之，根莖生物量年生長速率分別為18.70%、17.76%、17.26%；文山丘北、楚雄大姚、曲靖馬龍、昭通鎮(zhèn)雄4 個地理種源的年生長速率較低，生長速度較慢。多重比較表明，曲靖馬龍和文山丘北兩地的皂苷根莖生物量年生長速率差異不顯著，其他種源根莖生物量之間差異均呈顯著差異（P＜0.05）。8 個地理種源的滇重樓根莖生物量年生長速率：大理劍川＞麗江永勝＞普洱景東＞玉溪澄江＞楚雄大姚＞文山丘北、曲靖馬龍＞昭通鎮(zhèn)雄。

表5 滇重樓不同種源根莖年生長Table 5 Annual growth of rhizomes of different provenances

2.4 不同種源滇重樓聚類分析與優(yōu)良種源篩選

以滇重樓根莖皂苷含量和根莖年生長速率為特征指標，對8 個滇重樓種源聚類分析。從圖1可以看出，以歐氏距離17 為分界閾值，可將滇重樓種源聚類為3 個類群，分別為低皂苷含量、高生長速率類群，高皂苷含量、高生長速率類群和中皂苷含量、低生長速率類群。其中大理劍川和麗江永勝種源屬低皂苷含量、高生長速率類群，普洱景東和玉溪澄江屬高皂苷含量、高生長率類群，昭通鎮(zhèn)雄、曲靖馬龍、楚雄大姚和文山丘北屬中皂苷含量、低生長速率類群。

圖1 不同種源滇重樓總皂苷含量、年生長率聚類分析Fig. 1 Cluster analysis of total saponin contents and annual growth rate in different provenances

通過不同地理種源滇重樓總皂苷含量及根莖年生長速率2 個指標綜合比較，普洱景東種源最優(yōu)，玉溪澄江次之，普洱景東種源和玉溪澄江種源的滇重樓為優(yōu)質(zhì)種源。大理劍川、麗江永勝種源的皂苷含量未達到藥典要求，但其光合面積大，芽多，根莖年生長量較大，也可以適當引種栽培。

3 結論與討論

滇重樓皂苷含量與光照強度、日照時數(shù)、病蟲害、土壤養(yǎng)分、微生物等因素密切相關[10-11]，李澤東等[12]發(fā)現(xiàn)日照、溫度、營養(yǎng)等影響三七（Panax notoginseng）生長和皂苷類成分的合成。滇重樓為陰生植物，喜斜射光或散光，適宜的遮蔭率對重樓生長和產(chǎn)量有重要作用[13-14]。普洱景東地區(qū)年均溫度18.3℃、年均降雨量1 087 mm，均高于其他種源地，研究發(fā)現(xiàn)人參皂苷含量與與日照時數(shù)和年降水量呈明顯的正相關[15]，故推測其皂苷含量高與日照時數(shù)和年降水量高有很大關系。本研究結果顯示氣溫較低地區(qū)，滇重樓根莖生長速度并非最慢，推測該地區(qū)晝夜溫差大，導致根莖生長量積累較多。不同地理種源生物量差異比較大[16]，大理劍川、麗江永勝種源生長快，該兩地種源具有矮桿多芽多葉的特點，其光合面積較大故根莖年生長量較大；普洱景東、玉溪澄江種源生長也較快，跟生長期長、芽壯、莖粗而高大等特性有關。降雨量、日照時數(shù)、晝夜溫差、土壤等因素都會影響其根莖生長速度，本研究皂苷含量與生態(tài)因子相關性分析表明總皂苷含量與海拔有一定的負相關性，而總皂苷含量與年均氣溫和年均降雨量間相關系數(shù)存在一定的正相關性，與人參、枸杞（Lycium chinense）、龍葵（Solanum nigrum）等有效成分累積的研究結果一致[17-19]。優(yōu)良的氣候條件是道地藥材的形成基礎，重樓品質(zhì)與氣溫、濕度、土壤pH 值及土壤微生物等有關[20-23]。普洱景東位于云南省中南部，橫斷山脈南端，屬亞熱帶季風型氣候，海拔高、垂直變化明顯，年平均氣溫18.3 ℃，年平均相對濕度77%，年均降水量1086.7 mm，年均日照2 131.6 h，無霜期355 d，非常適合滇重樓生長及生物量積累[24]。昭通鎮(zhèn)雄、曲靖馬龍氣溫較低且為單芽滇重樓，故生長最慢。通過聚類分析可將滇重樓種源分為3 個類群，大理劍川和麗江永勝種源屬低皂苷含量、高生長速率類群，普洱景東和玉溪澄江屬高皂苷含量、高生長速率類群，昭通鎮(zhèn)雄、曲靖馬龍、楚雄大姚和文山丘北屬中皂苷含量、低生長速率類群。

目前，滇重樓栽培生產(chǎn)中存在種源混亂、良莠不齊、品質(zhì)不佳等諸多問題。利用滇重樓在云南分布區(qū)域多樣性的特點篩選優(yōu)質(zhì)種源，是解決滇重樓產(chǎn)業(yè)發(fā)展中高品質(zhì)原材料短缺問題的必要前提。本研究結果顯示，普洱景東種源總皂苷含量最高達1.57%，生長速度較快，根莖年生物量為30.1 g，增長率為17.76%，為優(yōu)質(zhì)地理種源；不同地理種源中的生長速度差異顯著，大理劍川種源生長速度最快，根莖年增長率達21.41%，可以在合適區(qū)域種植；綜合皂苷含量和根莖生長速度兩個指標，玉溪澄江種源也可作為優(yōu)良滇重樓種源。通過篩選出普洱景東和玉溪澄江種源為優(yōu)良種源，對于滇重樓野生種植資源保護及產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有一定的科學意義。